@phdthesis{Fink2023,
  author    = {Fink, Julian},
  title     = {Synthese von molekularen Werkzeugen zur Visualisierung und Untersuchung des Sphingolipidmetabolismus und weiterer biologischer Prozesse},
  doi       = {10.25972/OPUS-28699},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-286992},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Die Zelle stellt die kleinste Einheit des Lebens dar und zeichnet sich durch die hoch koordinierte Anordnung von mehreren Millionen (Bio-)Molek{\"u}len zu einem mikrometergroßen Objekt aus. Als struktureller Bestandteil der Lipiddoppelschicht eukaryotischer Zellen spielt neben Sterolen und Glycerolipiden die Verbindungsklasse der Sphingolipide eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Membranintegrit{\"a}t.[472] Dar{\"u}ber hinaus sind bioaktive Sphingolipide bei vielen grundlegenden zellul{\"a}ren Prozessen wie Apoptose, Wachstum, Differenzierung, Migration und Adh{\"a}sion entscheidend beteiligt.[87,120] Ein gest{\"o}rtes Gleichgewicht des Sphingolipidmetabolismus und Defekte der entsprechenden Stoffwechselwege stehen im Zusammenhang mit vielen Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Adipositas, Arteriosklerose, chronischen Entz{\"u}ndungen und Autoimmunerkrankungen sowie viraler und bakterieller Pathogenese.[22,143,473,474] Die Entwicklung und Anwendung von Sphingolipidanaloga als potenzielle Wirkstoffe r{\"u}ckten in den letzten Jahren immer weiter in den Fokus der interdisziplin{\"a}ren Forschung von Biologen, Chemikern und Medizinern. Als bekanntestes Beispiel ist Fingolimod (FTY720) zu nennen, das als Sphingosin-1-phosphat-Mimetikum heute unter dem Markennamen Gilenya® erfolgreich als Arzneistoff zur Behandlung von Multipler Sklerose eingesetzt wird.[475] Es besteht jedoch die Gefahr, dass Fingolimod zur Sch{\"a}digung anderer Zellfunktionen und zu gravierenden Nebeneffekten wie Bradykardie f{\"u}hren kann.[476] Da Sphingolipide ebenfalls in der Kontrolle von bakteriellen und viralen Infektionen essentiell beteiligt sind, spielen Sphingolipide und deren synthetisch dargestellte Derivate vermehrt eine Rolle in der Wirkstoffentwicklung im Kampf gegen pathogene Krankheitserreger.[175,477-479] Die Wirkweise von antimikrobiellen Sphingolipiden ist bisher nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt. F{\"u}r eine Weiterentwicklung von bekannten Medikamenten gegen verschiedene Krankheiten oder f{\"u}r die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen Erreger ist eine umfassende Untersuchung der zugrundeliegenden zellul{\"a}ren Mechanismen auf molekularer Ebene entscheidend. Hierf{\"u}r finden aufgrund der relativ einfachen Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie h{\"a}ufig fluoreszenzmarkierte Sphingolipidderivate breite Anwendung.[480] Die kovalent gebundene Farbstoffeinheit bringt jedoch wesentliche Nachteile mit sich, da sich die Biomolek{\"u}le durch die ver{\"a}nderte Struktur und Polarit{\"a}t in ihren biologischen Eigenschaften von den nat{\"u}rlichen Substraten unterscheiden k{\"o}nnen. Die Verwendung von bioorthogonal funktionalisierten Biomolek{\"u}len umgeht dieses Problem, da die strukturellen {\"A}nderungen minimal gehalten werden. Nach dem zellul{\"a}ren Einbau dieser Derivate ist eine schnelle und spezifische Konjugation mit einem komplement{\"a}ren Fluorophor zu einem gew{\"u}nschten Zeitpunkt durch sogenannte Click-Reaktionen wie CuAAC oder SPAAC m{\"o}glich.[12,46] Das Prinzip der Click-Chemie wurde bereits auf eine Vielzahl an Biomolek{\"u}len wie Sphingolipide, Fetts{\"a}uren, Aminos{\"a}uren, Proteine, Kohlenhydrate, Nukleoside oder Nukleins{\"a}uren (DNA und RNA) {\"u}bertragen.[47,280] Jedoch bedarf es weiterer spezifisch modifizierter Verbindungen, die vielf{\"a}ltige bioorthogonale Reaktionen f{\"u}r die Untersuchung von Zellprozessen zulassen ‒ sowohl in vitro als auch in vivo. Um neue Therapieans{\"a}tze gegen verschiedene Krankheiten zu entwickeln und schwerwiegende Nebenwirkungen zu vermeiden, ist die detaillierte Erforschung hochkomplexer Zellvorg{\"a}nge auf molekularer Ebene von entscheidender Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Synthese und Charakterisierung von molekularen Werkzeugen, die in Kombination mit verschiedenen aktuellen Mikroskopie- und Massenspektrometriemethoden die Visualisierung und Untersuchung des Sphingolipidmetabolismus und weiterer biologischer Prozesse erm{\"o}glichen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine Vielzahl an Sphingolipiden und deren bioorthogonal funktionalisierte Analoga ausgehend von der Aminos{\"a}ure L-Serin erfolgreich synthetisiert. Die vorgestellten Verbindungen eignen sich in Kombination mit Massenspektrometrie und Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie als molekulare Werkzeuge zur Untersuchung des komplexen Sphingolipidmetabolismus sowie des Einbaus und der Dynamik von Sphingolipiden in Modell- und Zellmembranen. Sowohl in humanen und tierischen Zellen als auch in Bakterien wurden die azidmodifizierten Sphingolipide durch Click-Reaktionen visualisiert, um ein verbessertes Verst{\"a}ndnis von bakteriellen und viralen Infektionsprozessen zu erhalten. Der modulare Ansatz der Click-Chemie erm{\"o}glicht die Verwendung verschiedener komplement{\"a}r funktionalisierter Farbstoffe, die unterschiedliche Eigenschaften bez{\"u}glich der Membrandurchg{\"a}ngigkeit oder Absorptions- und Emissionswellenl{\"a}ngen besitzen und somit je nach biologischer Fragestellung gezielt eingesetzt werden k{\"o}nnen. Alles in allem tragen die in dieser Arbeit synthetisierten Verbindungen dazu bei, die Rolle von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und Krankheitsverl{\"a}ufen auf subzellul{\"a}rer Ebene aufzukl{\"a}ren. Dadurch wird ein entscheidender Beitrag f{\"u}r die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen bakterielle oder virale Erreger sowie innovativer Therapien gegen verschiedene humane Krankheiten geliefert.},
  subject      = {Chemische Synthese},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Nagl2022,
  author    = {Nagl, Patrick Alexander},
  title     = {Chemistry meets Cancer Immunotherapy: Synthesis and Characterization of Hapten-like Compounds for Selective Immunotherapy},
  doi       = {10.25972/OPUS-21138},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-211385},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Chimeric antigen receptors (CARs) are able to specifically direct T cells to tumor antigens and therapy with anti-CD19 CARs has already cured cancer patients with B-cell lymphomas who have undergone long-term therapy non-successful. Despite this impressive result, the therapy is currently only approved as a last treatment option for blood cancers due to its life-threatening deficiencies. For patient safety and to enable additional application such as the treatment of solid tumors, CAR-T cells must be controllable, e. g. by chemically programmable CARs (cpCARs) regulated by hapten-like compounds. This thesis reports the synthesis and characterization of such hapten-like compounds. In the first step, seven different warheads with two different spacers were bound to biotin in order to find a suitable warhead for programming the cpCAR. In a second step, synthetic routes for the three pharmacophores folate, c(RGD), and an RGD peptidomimetic were developed. The routes allow the modification of the pharmacophores with one of the warheads from the first step. CuAAC was chosen as a bioorthogonal approach to link pharmacophores and warheads. In total, three different pharmacophores were modified with the 1,3-diketone motif of compound 21 leading to 112, 113 and 128. Activation of the T-cell signaling cascade was tested after binding of these hapten-like compounds to the cpCAR in the presence of suitable target structures. For 112, only a slight, non-significant, activation of the T-cell signaling cascade was observed, whereas for 113 and 128, a significant activation of the T-cell signaling cascade was observed. The poor solubility of the folate compounds led to alternative strategies. Folic acid was exchanged by pteroic acid and the bifunctional, linear compounds were enlarged to trifunctional dendrimers. Besides the reported regioisomer in 112, a second one, which was not reported to date, occurred by the cyclization of the linear RGD pentapeptide leading to 113. After the reported synthesis of an RGD peptidomimetic analogous to 128 could not be reproduced, a new synthetic route was developed. It also consists of 17 steps, but reduces the number of linear steps from 13 to 10. Moreover, the developed route contains an asymmetric hydrogenation step and is, compared to the published one, more flexible by the use of the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). In addition, an unknown reaction was observed. Instead of the formation of a Schiff base in the reductive amination of 129, an insertion of propargylamine occurred forming 131. The reaction is almost quantitative and in high purity. After requiring no purification, it could be predestined for industrial purposes, such as the synthesis of N-functionalized 1,2-dihydroquinolines or as a building block with various orthogonal functional groups. Besides the sulfonamide 16, the diketone (21, 27, 31) and lactam compounds (39 - 41), experiments on adapter molecules with further warheads were performed. In the synthesis of a proadapter approach, in which the warhead is formed only after the retro-aldol reaction catalyzed by the mAb, 6 of 10 steps were successfully performed. A newly developed synthesis to keto-sulfonyl and keto-sulfoxide compounds could not be completed but was performed on a small scale to the point of keto-sulfonyl and keto-sulfoxide. Furthermore, a universal synthesis route was designed to allow the introduction of the warhead at the end of the synthesis by acylation. Thus, after 5 shared steps, 3 of them in quantitative yield, different warheads may be introduced. Moreover, this also facilitates the purification and the analysis of the compounds by the absence of tautomerism or labile groups. However, the acylation experiments were not successful with either the acid cyanide or the Weinreb amide. In summary, this thesis has proven that the 1,3-diketone motif is a suitable warhead for programming the cpCAR, which was developed by Hudecek et al. (unpublished data). The hapten-like compounds 112, 113 and 128 simultaneously bind to integrin \${\alpha}_v{\beta}_3\$ and the cpCAR activating the T-cell signaling cascade. The modular synthesis strategy and the use of the bioorthogonal CuAAC allow straightforward access to these valuable immunotherapeutics but revealed the need for an additional purification step to remove copper ions.},
  subject      = {Organische Synthese},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schlegel2021,
  author    = {Schlegel, Jan},
  title     = {Super-Resolution Microscopy of Sphingolipids and Protein Nanodomains},
  doi       = {10.25972/OPUS-22959},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-229596},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {The development of cellular life on earth is coupled to the formation of lipid-based biological membranes. Although many tools to analyze their biophysical properties already exist, their variety and number is still relatively small compared to the field of protein studies. One reason for this, is their small size and complex assembly into an asymmetric tightly packed lipid bilayer showing characteristics of a two-dimensional heterogenous fluid. Since membranes are capable to form dynamic, nanoscopic domains, enriched in sphingolipids and cholesterol, their detailed investigation is limited to techniques which access information below the diffraction limit of light. In this work, I aimed to extend, optimize and compare three different labeling approaches for sphingolipids and their subsequent analysis by the single-molecule localization microscopy (SMLM) technique direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). First, I applied classical immunofluorescence by immunoglobulin G (IgG) antibody labeling to detect and quantify sphingolipid nanodomains in the plasma membrane of eukaryotic cells. I was able to identify and characterize ceramide-rich platforms (CRPs) with a size of ~ 75nm on the basal and apical membrane of different cell lines. Next, I used click-chemistry to characterize sphingolipid analogs in living and fixed cells. By using a combination of fluorescence microscopy and anisotropy experiments, I analyzed their accessibility and configuration in the plasma membrane, respectively. Azide-modified, short fatty acid side chains, were accessible to membrane impermeable dyes and localized outside the hydrophobic membrane core. In contrast, azide moieties at the end of longer fatty acid side chains were less accessible and conjugated dyes localized deeper within the plasma membrane. By introducing photo-crosslinkable diazirine groups or chemically addressable amine groups, I developed methods to improve their immobilization required for dSTORM. Finally, I harnessed the specific binding characteristics of non-toxic shiga toxin B subunits (STxBs) and cholera toxin B subunits (CTxBs) to label and quantify glycosphingolipid nanodomains in the context of Neisseria meningitidis infection. Under pyhsiological conditions, these glycosphingolipids were distributed homogenously in the plasma membrane but upon bacterial infection CTxB detectable gangliosides accumulated around invasive Neisseria meningitidis. I was able to highlight the importance of cell cycle dependent glycosphingolipid expression for the invasion process. Blocking membrane accessible sugar headgroups by pretreatment with CTxB significantly reduced the number of invasive bacteria which confirmed the importance of gangliosides for bacterial uptake into cells. Based on my results, it can be concluded that labeling of sphingolipids should be carefully optimized depending on the research question and applied microscopy technique. In particular, I was able to develop new tools and protocols which enable the characterization of sphingolipid nanodomains by dSTORM for all three labeling approaches.},
  subject      = {Sphingolipide},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wolf2021,
  author    = {Wolf, Natalia},
  title     = {Synthese multifunktionaler Farbstoffe und Linker zur Visualisierung biologischer Strukturen},
  doi       = {10.25972/OPUS-20531},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-205312},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Durch stetige Entwicklung der Mikroskopiemethoden in den letzten Jahrzehnten ist es nun m{\"o}glich Strukturen und Abl{\"a}ufe in biologischen Systemen detaillierter darzustellen als mit der von Abbe entdeckten maximalen Aufl{\"o}sungsgrenze. Oft werden dabei Fluoreszenzmarker benutzt, welche die unsichtbare Welt der Mikrobiologie und deren biochemische Prozesse illuminieren. Diese werden entweder durch Expression, wie z.B. das gr{\"u}n fluoreszierende Protein (GFP), in das zu untersuchende Objekt eingebracht oder durch klassische Markierungsmethoden mithilfe von fluoreszierenden Immunkonjugaten installiert. Jedoch gewinnt eine alternative Strategie, die von der interdisziplin{\"a}ren Zusammenarbeit zwischen Chemikern, Physikern und Biologen profitiert, immer mehr an Bedeutung - die bioorthogonale Click-Chemie. Sie erm{\"o}glicht eine effiziente Fluoreszenzmarkierung der biologischen Strukturen unter minimalem Eingriff in die Abl{\"a}ufe der Zelle. Dazu m{\"u}ssen allerdings sowohl Farbstoffe als auch die biologisch aktiven Substanzen chemisch modifiziert werden, da nur dadurch die Bioorthogonalit{\"a}t gew{\"a}hrleistet werden kann. Mittlerweile existiert eine breite Palette an fluoreszierenden Farbstoffen, die das komplette sichtbare Spektrum abdecken und sich f{\"u}r diverse Mikroskopiemethoden eignen. Allerdings gibt es zwei Farbstoffklassen, die sich aus der gesamten F{\"u}lle abheben und sich f{\"u}r hochaufl{\"o}sende bildgebende Experimente auf Einzelmolek{\"u}lebene eignen. Zum einen ist es die Farbstofffamilie der Cyanine und insbesondere der wasserl{\"o}slichen Pentamethincyanine, die reversibel und kontrolliert zum Photoschalten animiert werden k{\"o}nnen und in der stochastisch optischen Rekonstruktionsmikroskopie Anwendung finden. Zum anderen ist es die Gruppe, der Rhodamine und Fluoresceine, die zu Xanthenfarbstoffen geh{\"o}ren und sich durch gute photophysikalische Eigenschaften auszeichnen. Trotz der Beliebtheit stellt ihre Darstellung immer noch eine Herausforderung dar und limitiert deren Einsatz. Deshalb war es notwendig im Rahmen der vorliegenden Arbeit M{\"o}glichkeiten zur Syntheseoptimierung beider Farbstoffklassen zu finden, damit diese im Folgenden weiterentwickelt und an die biologische Fragestellung angepasst werden k{\"o}nnen. Die Arbeit unterteilt sich deshalb in Relation an die oben genannten Farbstoffklassen in zwei Bereiche. Im ersten Teil wurden Projekte basierend auf den wasserl{\"o}slichen Pentamethincyaninen behandelt. Im zweiten Teil besch{\"a}ftigte sich die Arbeit mit Projekten, die auf Xanthen-Farbstoffen aufbauen.},
  subject      = {Farbstoff},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Solger2021,
  author    = {Solger, Franziska},
  title     = {Central role of sphingolipids on the intracellular survival of \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) in epithelial cells},
  doi       = {10.25972/OPUS-24753},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-247534},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Neisseria gonorrhoeae are Gram-negative bacteria with diplococcal shape. As an obligate human pathogen, it is the causative agent of gonorrhoea, a sexually transmitted disease. Gonococci colonize a variety of mucosal tissues, mainly the urogenital tract in men and women. Occasionally N. gonorrhoeae invades the bloodstream, leading to disseminated gonococcal infection. These bacteria possess a repertoire of virulence factors, which expression patterns can be adapted to the environmental conditions of the host. Through the accumulation of antibiotic resistances and in absence of vaccines, some neisserial strains have the potential to spread globally and represent a major public health threat. Therefore, it is necessary to understand the exact molecular mechanisms underlying the successful infection and progression of gonococci within their host. This deeper understanding of neisserial infection and survival mechanisms is needed for the development of new therapeutic agents. In this work, the role of host-cell sphingolipids on the intracellular survival of N. gonorrhoeae was investigated. It was shown that different classes of sphingolipids strongly interact with invasive gonococci in epithelial cells. Therefore, novel and highly specific clickable sphingolipid analogues were applied to study these interactions with this pathogen. The formation of intra- and extracellular sphingosine vesicles, which were able to target gonococci, was observed. This direct interaction led to the uptake and incorporation of sphingosine into the neisserial membrane. Together with in vitro results, sphingosine was identified as a potential bactericidal reagent as part of the host cell defence. By using different classes of sphingolipids and their clickable analogues, essential structural features, which seem to trigger the bacterial uptake, were detected. Furthermore, effects of key enzymes of the sphingolipid signalling pathway were tested in a neutrophil infection model. In conclusion, the combination of click chemistry and infection biology made it possible to shed some light on the dynamic interplay between cellular sphingosine and N. gonorrhoeae. Thereby, a possible "catch-and-kill" mechanism could have been observed.},
  subject      = {Neisseria gonorrhoeae},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Peng2020,
  author    = {Peng, Kun},
  title     = {iClick reactions as a modular access to palladium(II) and platinum(II) triazolato complexes: Trends in kinetics and biological activity},
  doi       = {10.25972/OPUS-21161},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-211613},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {In the context of this work, important trends in the influence of the metal center, coligand, and alkyne reaction partner on the iClick reaction of square-planar palladium(II) and platinum(II) complexes with a N^N^N, C^N^N, or S^N^N coordination sphere and a number of internal as well as terminal alkynes were elaborated. Preliminary bioactivity studies on a human cancer cell line gave low micromolar EC50 values, for the most promising compound comparable to cisplatin serving as a reference drug. The further application of the iClick reaction to bioconjugation will be explored in future work.},
  subject      = {Click-Chemie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Walter2018,
  author    = {Walter, Tim},
  title     = {Bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide zur Evaluierung von Lipiddynamiken \(in\) \(vivo\)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-168091},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {In der Kontrolle von viralen oder bakteriellen Infektionen spielen Sphingolipide eine essentielle Rolle[335-336], weshalb sich inzwischen die Forschung vermehrt an Sphingolipiden und -analoga als Wirkstoffen gegen die verschiedensten Erreger besch{\"a}ftigt.[9] Dabei finden in der Synthese und Identifikation potentieller Wirkstoffe auch clickchemiebasierte Ans{\"a}tze Anwendung.[224] Allerdings ist die Wirkweise von sphingolipidbasierten Pharmaka auch in viraler und mikrobieller Pathogenese bisher ungekl{\"a}rt. Mit der Entdeckung der CuAAC[112-113] sowie deren modernen Varianten und Alternativen, die gemeinsam unter dem Begriff Clickchemie zusammengefasst werden, ist es m{\"o}glich, die strukturellen {\"A}nderungen von Biomolek{\"u}len klein zu halten und durch sp{\"a}tere Konjugation mit Farbstoffen Fluoreszenspektroskopie zu erm{\"o}glichen.[339-340] W{\"a}hrend in den letzten Jahren die Clickchemie breite Anwendung zur Modifikation von Proteinen[130], Kohlenhydraten[341] und DNA[340] gefunden hat blieben Lipide lange unbeachtet[342], was vor allem auch f{\"u}r Sphingolipide gilt. In dieser Arbeit werden bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide und -analoga vorgestellt, um die Vielseitigkeit der Clickchemie auf das Feld der Sphingolipide zu {\"u}bertragen. Die clickf{\"a}higen Lipidanaloga erm{\"o}glichen detaillierte Einblicke in die dynamische Organisation von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und ihr Einsatz als therapeutische Wirkstoffe oder zur Generierung von antibakteriellen Oberfl{\"a}chenbeschichtungen wurden untersucht. Die dargestellten azidmodifizierten Sphingolipide und -analoga konnten in Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern, bez{\"u}glich ihrer Verwendung in Visualisierungsexperimenten und antibakteriellen Eigenschaften untersucht werden. Die Ceramidderivate konnten genutzt werden, um den Einfluss von Kettenl{\"a}nge und Position des Azides der acylierten S{\"a}ure auf die in vivo-Konjugation mit dem Fluoreszenzfarbstoff DBCO-Sulfo-Cy5 in Jurkatzellen genauer zu untersuchen.[211] Auch konnten azidfunktionalisierte Ceramide auf ihre Eignung zur Visualisierung von Ceramiddynamiken w{\"a}hrend T-Stimulation untersucht werden.[205] In diesem Zusammenhang sind visualisierbare Ceramide von besonderer Bedeutung, da die T-Zellstimulation die ASM-Aktivierung zur Folge hat, die wiederum Ceramide freisetzt. Mit dem azidmodifizierten Phytosphingosinderivat gelang es erstmals ein azidmodifiziertes Sphingolipid nach Inkubation von Arabidopsis thaliana Setzlingen mittels CuAAC mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu konjugieren.[258] Des Weiteren konnten die azidfunktionalisierten N-Oleoylserinole in verschiedenen Zelltypten erfolgreich eingebaut und selektiv mit Fluoreszenzfarbstoff visualisiert werden. Kof{\"a}rbungen mit GFP-PKCζ und Antik{\"o}rpermarkierungen von Ceramid sowie PKCζ zeigten, dass es sich bei den Enantiomeren um ceramidimitierende Lipidanaloga handelt. Somit eignen sich diese N-Oleoylserinolanaloga, um die Interaktion von Ceramiden mit der Proteinkinase Cζ zu untersuchen. Da viele nat{\"u}rliche Sphingolipide antibakterielle Eigenschaften aufweisen, konnte in Kooperation mit J{\´e}r{\^o}me Becam der Einsatz azidmodifizierter Ceramide als Wirkstoff gegen Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae sowie Escherichia coli und Staphylococcus aureus untersucht werden. ωN3-C6-Cer zeigt gute bakterizide Eigenschaften gegen Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, ohne dabei toxisch gegen{\"u}ber den Wirtszellen zu sein. Die Ceramidanaloga αN3-C6-Cer, αN3-C16-Cer und ωN3-C16-Cer weisen keine antibakteriellen Eigenschaften auf, aber sie wurden effizient in die Membran der Neisseriae eingebaut und konnten ebenfalls erfolgreich bioorthogonal markiert werden. Des Weiteren zeigten hochaufl{\"o}sende dSTORM-Aufnahmen der Bakterien, im Gegensatz zu Humanzellen, eine homologe Verteilung der konjugierten Ceramide. Da Ceramide eine wichtige Rolle in der Infektionsbek{\"a}mpfung spielen, sind die in dieser Arbeit synthetisierten azidmodifizierten Ceramide wertvolle Werkzeuge, um die Interaktion von Bakterien mit Humanzellen zu untersuchen. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich eine innovative Methode entwickelt werden, um alkinpr{\"a}sentierende Linker auf die Oberfl{\"a}che von Nunc Covalink 96 Microtiterplatten kovalent zu binden und die Alkine konnten anschließend mittels CuAAC mit den in dieser Arbeit synthetisierten azidfunktionalisierten Lipiden zu konjugiert werden. Ziel der Methode war es potentielle Molek{\"u}le f{\"u}r bakterizide Oberfl{\"a}chenmodifikationen zu identifizieren. Mittels solcher Oberfl{\"a}chenmodifikationen soll die Biofilmbildung in Endotrachealtuben verhindert, und damit die Entstehung von beatmungsassozierten Pneumonien unterbunden werden. Die lipidmodifizierten Microtiterplatten sollen zuk{\"u}nftig auch genutzt werden, um sphingolpidaffine Proteine aus Zelllysaten zu identifizieren.},
  subject      = {Click-Chemie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{BertleffZieschang2014,
  author    = {Bertleff-Zieschang, Nadja Luisa},
  title     = {Galectin-1: A Synthetic and Biological Study of a Tumor Target},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-101529},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Galectin-1 (hGal-1) is overexpressed by numerous cancer types and previously conducted studies confirmed that the β-galactoside-binding protein mediates various molecular interactions associated with tumor growth, spread and survival. Upon interaction with carbohydrate-based binding epitopes of glycan structures on human cell surfaces galectin-1 induces proliferative, angiogenetic and migratory signals and modulates negative T cell regulation which essentially helps the tumor to evade the immune response. These findings attributed galectin-1 a pivotal role in tumor physiology and strongly suggest the protein as target for diagnostic and therapeutic applications. Within the scope of this work a strategy was elaborated for designing tailor-made galectin-1 ligands by functionalizing selected hydroxyl groups of the natural binding partner N-acetyllactosamine (LacNAc) that are not involved in the sophisticated interplay between the disaccharide and the protein. Synthetic modifications intended to introduce chemical groups i) to address a potential binding site adjacent to the carbohydrate recognition domain (CRD) with extended hGal-1-ligand interactions, ii) to implement a tracer isotope for diagnostic detection and iii) to install a linker unit for immobilization on microarrays. Resulting structures were investigated regarding their targeting ability towards galectin-1 by cocrystallization experiments, SPR and ITC studies. Potent binders were further probed for their diagnostic potential to trace elevated galectin-1 levels in microarray experiments and for an application in positron emission tomography (PET).},
  subject      = {Organische Synthese},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Loeschberger2014,
  author    = {L{\"o}schberger, Anna},
  title     = {Biologische Referenzstrukturen und Protokolloptimierung in der hochaufl{\"o}senden Fluoreszenzmikroskopie mit dSTORM},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-102630},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Die Lokalisationsmikroskopie ist eine neue, vielversprechende Methode der hochaufl{\"o}senden Fluoreszenzmikroskopie. Sie erm{\"o}glicht detaillierte Einblicke in die Organisation und den strukturellen Aufbau von Zellen. Da die Vorbereitung der Proben und das Aufnehmen der Bilder im Vergleich zu herk{\"o}mmlichen Methoden h{\"o}here Anforderungen stellt, mussten ihr Potential und ihre Zuverl{\"a}ssigkeit erst noch {\"u}berzeugend gezeigt werden. Bis vor kurzem wurde das Aufl{\"o}sungsverm{\"o}gen vor allem an Mikrotubuli gezeigt, deren filament{\"o}se Struktur allerdings schon in konfokalen Bildern zu erkennen ist. Deswegen wurde in dieser Dissertation der Kernporenkomplex (NPC), dessen Struktur in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht aufl{\"o}sbar ist, als Modellstruktur f{\"u}r die hochaufl{\"o}sende Fluoreszenzmikroskopie eingef{\"u}hrt. Dazu wurden Kernporenkomplexe aus Kernh{\"u}llen von Xenopus laevis Oocyten mit dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), einer Methode der Lokalisationsmikroskopie, hochaufgel{\"o}st. Damit konnte nun erstmals die Achtfachsymmetrie dieses Proteinkomplexes lichtmikroskopisch dargestellt werden. Desweiteren konnte der Zentralkanal mit einem Durchmesser von ca. 40 nm aufgel{\"o}st werden. Die Daten eigneten sich außerdem f{\"u}r eine automatisierte Bildanalyse nach dem sogenannten "particle averaging" - einer aus der Elektronenmikroskopie bekannten Methode, um eine Durchschnittsstruktur zu ermitteln. Dar{\"u}ber hinaus wurden Zweifach-F{\"a}rbungen von NPCs benutzt, um verschiedene Ans{\"a}tze f{\"u}r Zweifarben-Aufnahmen mit dSTORM zu testen. Neben dem mittlerweile standardm{\"a}ßig benutzten, sequentiellen Ansatz mit zwei spektral getrennten Farbstoffen, wurde auch ein simultaner Ansatz mit zwei spektral {\"u}berlappenden Farbstoffen erfolgreich angewandt. Auch f{\"u}r 3D-Messungen mit den Ans{\"a}tzen Biplane und Astigmatismus eignete sich die Markierung der Kernh{\"u}lle. Hier wurden jedoch A6-Zellen benutzt und die Kr{\"u}mmung des Zellkerns {\"u}ber die gef{\"a}rbten Kernporen dargestellt. dSTORM-Messungen k{\"o}nnen nicht nur an fixierten, sondern auch in lebenden Zellen durchgef{\"u}hrt werden. Hierzu eignen sich vor allem sehr immobile Proteine, wie H2B oder Lamin C. Anhand von SNAP-Tag- und Halo-Tag-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass sich kommerziell erh{\"a}ltliche, organische Farbstoffe auch in endogener zellul{\"a}rer Umgebung schalten lassen, wodurch Lebendzell-Aufnahmen mit dSTORM m{\"o}glich sind. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit korrelativen Aufnahmen aus dSTORM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Hierzu wurden Xenopus laevis Kernh{\"u}llen zuerst mit dSTORM hochaufgel{\"o}st und danach f{\"u}r die EM pr{\"a}pariert. Anschließend wurden zugeh{\"o}rige Bereiche am Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Mit den erhaltenen korrelativen Bildern konnte gezeigt werden, dass sich dSTORM und SEM bei geeigneten Proben durchaus kombinieren lassen. Proteine k{\"o}nnen somit spezifisch markiert und im Rahmen ihrer strukturellen Umgebung mit nahezu molekularer Aufl{\"o}sung dargestellt werden. Da hochwertige Aufnahmen eine ausgereifte Probenpr{\"a}paration voraussetzen, darf deren Etablierung nicht zu kurz kommen. Unter dieser Pr{\"a}misse wurde ein optimiertes Markierungsprotokoll mit dem Namen ClickOx entwickelt. Mit ClickOx bleibt bei der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition die Feinstruktur von Aktinfilamenten, sowie die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine, deutlich sichtbar erhalten. W{\"a}hrend bei den klassischen Click-Protokollen auf Grund der Entstehung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) feine zellul{\"a}re Strukturen, wie Aktinfilamente, angegriffen oder zerst{\"o}rt werden, sch{\"u}tzt das neue Protokoll mit enzymatischem Sauerstoffentzug Proteine und somit Strukturen vor Reaktionen mit ROS. Das unterstreicht, wie wichtig es ist auch sogenannte "etablierte" Protokolle weiterzuentwickeln, denn bestimmte Nebeneffekte in Pr{\"a}parationen werden unter Umst{\"a}nden erstmals in der Hochaufl{\"o}sung sichtbar. Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung des Einflusses von D1 auf die Chromatinorganisation. Mit verschiedenen mikroskopischen Methoden konnten Hinweise auf eine m{\"o}gliche DNA-Cross-Linking-F{\"a}higkeit dieses Proteins gesammelt werden. Hier wurde die Einzelmolek{\"u}linformation der dSTORM-Filme genutzt, um unterschiedliche Grade von DNA- bzw. Chromatin-Akkumulation zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass wildtypisches D1 DNA vernetzen kann. Dies erfolgt {\"u}ber die sogenannten AT-Haken-Motive. Sobald diese alle durch Mutation funktionsunf{\"a}hig gemacht werden - wie bei der verwendeten R10xG-Mutante - l{\"a}sst sich keine Akkumulation der DNA mehr beobachten. Neben der Chromatinaggregation durch D1-Expression konnte in FRAP-Experimenten gezeigt werden, dass nur die "echten" AT-Haken eine hohe Affinit{\"a}t zum Chromatin aufweisen, die sogenannten "potentiellen" hingegen nicht.},
  subject      = {Fluoreszenzmikroskopie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Qamar2012,
  author    = {Qamar, Riaz-ul},
  title     = {Synthesis of functionalized molecular probes for bioorthogonal metabolic glycoengineering},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73378},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Biomolecules are difficult to investigate in their native environment. The vast complexity of cellular systems and seldom availability of chemical reactions compatible with the physiological milieu make it a challenging task. Bioorthogonal chemical reactions serve as a key to achieve selective ligation, whose components must react rapidly and selectively with each other under physiological conditions in the presence of the plethora of functionalities necessary to sustain life. In this dissertation, we focused on the synthesis of chemical reporters and probe molecules for bioorthogonal labeling through click reaction. Initially, sialic acid derivatives with a linker containing terminal alkyne functionality were synthesized. After the synthesis of azide derivatives of fluorescent dyes as counter partners, they were conjugated with sialic acids through Cu(I) catalyzed alkyne azide cycloaddition (CuAAC). The successful in vitro conjugation of Sia and fluorescent dyes was followed by metabolic tagging of human larynx carcinoma (HEp-2) and the carcinoma of Chinese hamster ovary (CHO­K1) with alkynated Sia that were subsequently ligated with fluorescein azide. Finally, the stained cells were subjected to fluorescent microscopy to obtain their images. To enable the click reaction compatible to in vivo applications, the reactivity of cyclooctyne was enhanced by two different approaches. In a first approach, following the Bertozzi's strategy, two fluorine atoms were introduced adjacent to the alkyne to lower the LUMO. In a second strategy the ring strain of cyclooctyne was attempted to be enhanced by the introduction of an amide group. In addition, glutarimide derivatives with free amino and carboxylic acid functional groups were synthesized by domino-Michael addition-cyclization-reaction.},
  subject      = {Click-Chemie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Meinhardt2011,
  author    = {Meinhardt, Thomas},
  title     = {Effiziente Oberfl{\"a}chen-Funktionalisierung von Nanodiamant durch die Click-Reaktion von Alkinen und Aziden},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-66410},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {In dieser Arbeit wurde die Kupfer(I)-katalysierte Cycloaddition von Alkinen und Aziden ("Click-Chemie") als effiziente, vielseitige und milde Reaktion f{\"u}r die Funktionalisierung von Nanodiamantpartikeln etabliert. Es wurden verschiedene Alkin- oder Azid-funktionalisierte Nanodiamantsysteme hergestellt und deren Reaktivit{\"a}t in Click-Reaktionen anhand vielf{\"a}ltiger Beispiele demonstriert. Hierzu wurden neben einfachen Testverbindungen auch komplexere Substanzen (z. B. ein Mannose-Derivat, Polytriazole, Fluoreszenzfarbstoffe, ein Thiazolium-Organokatalysator) durch Triazolsynthese immobilisiert. Zus{\"a}tzlich wurde eine Methode entwickelt, die die Herstellung funktionalisierter und vollst{\"a}ndig dispergierter Nanodiamant-Prim{\"a}rteilchen erm{\"o}glicht, wobei gezeigt wurde, dass dieser Weg auch f{\"u}r die Funktionalisierung durch Click-Chemie geeignet ist. Die Analyse der Nanodiamantpartikel erfolgte u. a. durch FT-IR, TGA, Elementaranalyse, Partikelgr{\"o}ßen- und Zetapotentialbestimmung, NMR, HR-TEM, UV / Vis sowie Fluoreszenzspektroskopie und -mikroskopie.},
  subject      = {Funktionalisierung <Chemie>},
  language  = {de}
}