@phdthesis{Beier2023,
  author    = {Beier, Charlotte},
  title     = {Metabolomische Untersuchung von Humanserum nach der Einnahme eines Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®)},
  doi       = {10.25972/OPUS-31691},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-316917},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Der aus der in Frankreich kultivierten Meeres-Kiefer (Pinus pinaster) gewonnene und standardisierte Rindenextrakt Pycnogenol enth{\"a}lt neben Procyanidinen auch weitere polyphenolische sekund{\"a}re Naturstoffe und ist zudem weltweit als USP-gelistetes Nahrungserg{\"a}nzungsmittel kommerziell erh{\"a}ltlich. Der Konsum von polyphenolreichen Lebensmitteln ist ebenso wie die Einnahme von Pycnogenol mit einer Vielzahl von positiven Effekten bei verschiedenen pathophysiologischen Prozessen assoziiert. Dazu z{\"a}hlen beispielsweise antioxidative oder antiinflammatorische Wirkungen, welche sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet werden konnten. Bislang gelang es nach der Einnahme des Extraktes nicht alle in Humanserum oder -plasma detektierten Substanzen zu identifizieren; zudem ist nicht gekl{\"a}rt, von welchen Stoffen konkret eine Bioaktivit{\"a}t ausgeht oder ob diese durch synergistische Effekte zustande kommt. Aus diesen Gr{\"u}nden sollten in der vorliegenden Arbeit im Rahmen einer Klinischen Studie bislang nicht beschriebene Analyten in Humanserum mittels UHPLC-qTOF-MS charakterisiert werden. Hierbei wurde ein ungerichteter, metabolomischer Ansatz gew{\"a}hlt. Die Studienproben der Proband*innen wurden dabei also ohne etwaige Restriktionen analysiert, beispielsweise hinsichtlich m{\"o}glicher Molek{\"u}lstrukturen oder der Retentionszeiten der detektierten Analyten. N{\"a}her betrachtet werden sollten Analyten, die in einer individuellen Serumprobe nach Beginn der viert{\"a}gigen Pycnogenol-Einnahme neu auftraten. In Anschluss an eine Probenvorbereitung mittels methanolischer Proteinpr{\"a}zipitation im sauren Milieu konnten in dem Humanserum der Proband*innen im ESI-Positiv-Modus f{\"u}nf und im ESI-Negativ-Modus 23 interessante Analyten nachgewiesen werden, die auf die Einnahme von Pycnogenol zur{\"u}ckzuf{\"u}hren waren. Elf dieser Substanzen konnte eine Struktur zugeordnet werden, wobei alle ausschließlich als Sulfatkonjugate vorlagen. Zu diesen z{\"a}hlten neben Zimts{\"a}ure-Derivaten wie Ferulas{\"a}ure-Sulfat zudem Flavonoide, z. B. Taxifolin-Sulfat, aber auch Phenylvalerians{\"a}ure-Abk{\"o}mmlinge, beispielsweise Hydroxydihydroxyphenylvalerians{\"a}ure-Sulfat, sowie Vertreter aus der Gruppe der Benzoes{\"a}uren und weitere Aromaten wie z. B. Pyrogallol-Sulfat oder Protocatechus{\"a}ure-Sulfat. Nach unserem besten Wissen war der Aspekt der ausschließlichen Sulfatierung neuartig. Wie aufgrund des interindividuell variablen Metabolismus zu erwarten, insbesondere durch das enterale Mikrobiom, war die Verteilung dieser sogenannten Marker innerhalb der 15 Studienteilnehmenden sehr heterogen. Nicht jeder Marker wurde bei jeder Person erfasst; die Spannweite reichte dabei von einem Teilnehmenden im Falle des mikrobiellen Metaboliten Hydroxyphenylvalerians{\"a}ure-Sulfat bis hin zu 14 Proband*innen bei einer nicht-identifizierbaren, jedoch wahrscheinlich endogenen Substanz im ESI-Positiv-Modus. Am h{\"a}ufigsten wurden die elf zuordenbaren Analyten vier Stunden nach der Einnahme von Pycnogenol {\"u}ber einen Zeitraum von vier Tagen bestimmt. Im Anschluss sollte die Bioaktivit{\"a}t dieser Substanzen in einem endothelialen Zellkulturmodell untersucht werden. Das Endothel wurde als Zielstruktur gew{\"a}hlt, da eine endotheliale Dysfunktion in der Pathogenese einer Reihe von Krankheiten mit ausgepr{\"a}gter Mortalit{\"a}t und Morbidit{\"a}t eine bedeutende Rolle spielt. Zudem wurde bereits eine positive Wirkung auf die Endothelfunktion nach der Einnahme von Pycnogenol beschrieben, wobei bis dato der Mechanismus auf molekularer Ebene unklar war. Die Charakterisierung der Sulfatkonjugate bez{\"u}glich ihrer Bioaktivit{\"a}t ex vivo mit humanen Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) gestaltete sich herausfordernd. Initial sollte untersucht werden, inwiefern diese Substanzen einer durch einen Entz{\"u}ndungsstimulus hervorgerufenen Sch{\"a}digung der endothelialen Glycocalyx entgegenwirken oder diese vermeiden k{\"o}nnen. Allerdings ließen sich mit den verschiedenen inflammatorischen Stimuli Lipopolysaccharid (LPS), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Wasserstoffperoxid bez{\"u}glich Konzentration und Inkubationsdauer keine reproduzierbaren Kulturbedingungen f{\"u}r eine valide ELISA-Quantifizierung des endothelialen Markers Heparansulfat etablieren. Im Anschluss erfolgte unter dem Einfluss einer TNF-α-Stimulation ein orientierendes Screening mit den Monosubstanzen Ferulas{\"a}ure und Protocatechus{\"a}ure bzw. mit deren Sulfatkonjugaten in Konzentrationen von 0,1 und 0,5 µM. Dabei zeigten die Konjugate beider Analyten bei der niedrigeren Konzentration tendenziell eine glycocalyx-protektive Wirkung, welche bei der h{\"o}heren Konzentration jedoch nicht mehr beobachtet werden konnte. Die endotheliale Permeabilit{\"a}t wurde mittels eines FITC-Dextran-Permeabilit{\"a}ts-Assays untersucht. Hiermit sollte ebenfalls ein m{\"o}glicher endothel-protektiver Einfluss der sulfatierten Substanzen unter entz{\"u}ndlichen Bedingungen (TNF-α-Stimulation) beleuchtet werden. Jedoch konnte weder bei Ferulas{\"a}ure oder Protocatechus{\"a}ure noch bei deren Sulfatkonjugate oder Taxifolin in diesem Modell ein Einfluss auf die endotheliale Barrierefunktion erfasst werden. Urspr{\"u}nglich war abschließend geplant in einem ex vivo-Modell die Humanserum-Proben mit dem darin enthaltenen Gemisch aus m{\"o}glicherweise bioaktiven Metaboliten direkt im Zellkulturmodell auf ihre Wirkung zu testen. Dies hat den Vorteil, dass simultan synergistische Effekte und Einfl{\"u}sse der Matrix untersucht werden k{\"o}nnen und ausschließlich in vivo erreichbare Konzentrationen eingesetzt werden. Aufgrund der limitierten Verf{\"u}gbarkeit der Studienproben und der oben geschilderten heterogenen Ergebnisse wurde auf eine weitere Analyse im Rahmen eines ex vivo-Modells verzichtet. Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach der Einnahme von Pycnogenol resorbierte Bestandteile und Metabolite in Humanserum ausschließlich als Sulfatkonjugate vorlagen. Zudem wurde bez{\"u}glich der Evaluation der endothelialen Bioaktivit{\"a}t durch Polyphenole eine Grundlage f{\"u}r weitere Untersuchungen geschaffen. Damit konnte ein Beitrag zur pharmakokinetischen und -dynamischen Charakterisierung von Pycnogenol geleistet werden.},
  subject      = {Polyphenole},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Muelek2015,
  author    = {M{\"u}lek, Melanie},
  title     = {Distribution and metabolism of constituents and metabolites of a standardized maritime pine bark extract (Pycnogenol®) in human serum, blood cells and synovial fluid of patients with severe osteoarthritis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-128085},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Dietary polyphenols have been related to beneficial effects on humans' health. Pycnogenol®, a dietary polyphenol-rich food supplement complies with the monograph "Maritime pine extract" in the United States Pharmacopeia (USP) and has demonstrated effects in different diseases. Several human trials concerning knee osteoarthritis have shown significant improvement of the symptoms like reducing the pain and the stiffness of the joint(s) upon intake of Pycnogenol®. After oral intake of multiple doses of Pycnogenol® previously low concentrations in the nanomolar range of monomeric extract constituents have been found in human plasma as well as a bioactive metabolite, δ-(3,4-dihydroxy-phenyl)-γ-valerolactone (M1), which is formed by the human intestinal flora from the procyanidins' catechin units. It is not clear yet which compound(s) of the complex extract is (are) mainly responsible for the described clinical effects of Pycnogenol®. To gain deeper insights into the in vivo fate of the pine bark extract the distribution of its constitutents and metabolites was closer investigated in the present thesis. Initial in vitro experiments suggested a facilitated cellular uptake of M1 into human erythrocytes, possibly via GLUT-1 transporter. For elucidating further the in vitro and in vivo metabolism of M1 in human blood cells, a metabolomic approach was performed using UPLC-ESI-qTOF-MSE analysis, which revealed a comprehensive and rapid metabolism of M1 to a variety of biotransformation products in human blood cells. Predominant metabolites were found to be conjugates of glutathione (GSH) isomers, namely M1-S-GSH and M1-N-GSH. Further sulfur-containing biotransformation products of M1 were conjugates with oxidized glutathione (M1-GSSG) and cysteine (M1-CYS) and the sulfated derivative of M1 (M1-sulfated). Other in vitro biotransformation products constituted the open-chained ester form of M1 (M1-COOH), hydroxybenzoic acid and the methylated (M1-methylated), acetylated (M1-acetylated), hydroxylated (M1-hydroxylated) and ethylated (M1-ethylated) derivatives of M1. Indeed, six of these in vitro metabolites, respectively M1-COOH, M1-sulfated, hydroxybenzoic acid, M1-S-GSH, M1-methylated and M1-acetylated, were also identified in vivo in blood cells of human volunteers after ingestion of Pycnogenol®. Related reference material was synthesized for reliable confirmation of the metabolites M1-GSH, M1-GSSG, M1-CYS and M1-COOH. In the course of a randomized controlled clinical trial patients suffering from severe osteoarthritis ingested multiple doses of 200 mg/day Pycnogenol® for three weeks before they were scheduled for an elective knee replacement surgery. Various biological specimen, respectively blood cells, synovial fluid and serum samples, were to be analyzed to investigate the distribution and disposition of possibly bioactive constituents and metabolites. Therefore, highly sensitive methods were developed using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)- technology because of the expected low concentrations of the analytes in the related matrices. Initially, for each matrix different sample preparation techniques (protein precipitation, liquid-liquid extraction, solid phase extraction and useful combinations thereof) were compared to achieve maximum detection sensitivity of the analytes that were of highest interest, namely M1, ferulic acid and taxifolin. By comparing 32 various sample clean-up procedures in human serum, the highest recovery of the metabolite M1 was achieved using a liquid-liquid extraction with ethyl acetate and tert-butyl methyl ether at a serum pH-value of 3.2. A similar extraction method was also chosen for analyte detection in human synovial fluid after comparing 31 different sample preparation techniques. Whole blood or blood cells are difficult to handle because of their high viscosity and strong coloration. The QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) approach which was originally developed for the food safety and thus for the determination of pesticide residues in fruits and vegetables yielded the highest total recovery rate of M1 in human blood cells when assessing 18 different sample clean-up techniques. By applying the QuEChERS method for the first time for the simultaneous and highly sensitive quantification of selected polyphenols in human blood cells it was demonstrated that this fast and inexpensive technique can be applied in clinical fields for cleaning-up highly complex and thus challenging biological matrices. All developed methods for the different biological specimen were optimized to achieve maximum sensitivity of the target analytes. The determined lower limits of quantification (LLOQs) were sufficient for the quantification of the study samples. The LLOQs ranged from 113 pg/mL for taxifolin to 48 ng/mL for caffeic acid in blood cells and from 80 pg/mL for taxifolin to 3 ng/mL for caffeic acid in synovial fluid. In human serum the LLOQs even ranged down to 35 pg/mL for taxifolin and up to 8 ng/mL for caffeic acid. All analytical methods were subjected to a full validation according to current EMA and FDA guidelines and fulfilled those criteria, showing excellent performance and reliability of the developed and optimized methods. Serum, blood cells and synovial fluid samples of the osteoarthritis patients were all processed with an enzymatic incubation with ß-glucuronidase/sulfatase to hydrolyse conjugates (phase-II-metabolism) prior the actual sample preparation. Additionally, serum samples of the osteoarthritis patients were prepared without enzymatic hydrolysis to determine the individual degree of conjugation with sulfate and glucuronic acid of the analytes. All determined concentrations in the patients' samples were in the lower ng/mL range. Notably, highest total concentrations of the polyphenols were not detected in serum, in which the degree of analyte conjugation with sulfate and glucuronic acid ranged from 54.29 ± 26.77\% for catechin to 98.34 ± 4.40\% for M1. The flavonoids catechin and taxifolin mainly partitioned into blood cells, whereas the metabolite M1, ferulic and caffeic acid primarily resided in the synovial fluid. The concentration of M1 in the blood cells was low, however, this could be explained by the previously observed extensive and rapid intracellular metabolism in vitro. This was now supported by the in vivo evidence in samples of patients who received Pycnogenol® in which the open-chained ester form of M1 (M1-COOH) as well as the glutathione conjugate of M1 (M1-GSH) were identified, indicating that M1 does not accumulate in its original form in vivo. Possibly, a variety of bioactive metabolites exist which might play an important role for the clinical effects of Pycnogenol®. Although the study participants were requested to avoid polyphenol-rich food and beverages within the last two days before the blood samplings this was obviously difficult for most of the patients. Hence, no statistically significantly difference was observed in the mean polyphenol concentrations in serum, blood cells and synovial fluid between the intervention and the control group. Nevertheless, it was possible to identify marker compounds for Pycnogenol® intake under real life conditions with occasional or regular consumption of polyphenol-rich foods and beverages. Thereby, ferulic acid was found in serum samples exclusively after intake of Pycnogenol®, confirming that ferulic acid is a suitable marker of consumption of French maritime pine bark extract. Taxifolin was present in serum and synovial fluid exclusively in the intervention group indicating a role as further marker of Pycnogenol® intake. Taxifolin, ferulic acid and caffeic acid were detected in both serum and synovial fluid only in the intervention group. Moreover, the metabolite M1, taxifolin and ferulic acid were only detected simultaneously in all matrices (serum, blood cells and synovial fluid) after ingestion of Pycnogenol®. Thus, deeper insights into the distribution of bioactive constituents and metabolites of Pycnogenol® into serum, blood cells and synovial fluid after oral administration to patients with severe osteoarthritis were gained. The present study provides the first evidence that polyphenols indeed distribute into the synovial fluid of patients with osteoarthritis where they might contribute to clinical effects.},
  subject      = {Pycnogenol},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Grimm2005,
  author    = {Grimm, Tanja},
  title     = {Antiinflammatorische Wirkungen und Pharmakokinetik eines standardisierten Kiefernrindenextraktes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14879},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die Hemmung des induzierten Abbaus von Matrixproteinen sowie von Gelatine durch Matrixmetalloproteinasen mithilfe des Kiefernrindenextraktes Pycnogenol, einer Auswahl seiner Inhaltsstoffe und seiner Metabolite d-(3,4-Dihydroxyphenyl)-g-valerolacton (M1) und d-(3-Methoxy-4-hydroxyphenyl)-g-valerolacton (M2) untersucht. Beide Metabolite zeigten eine signifikante Hemmwirkung und lagen in der Effektivit{\"a}t ihrer Hemmung auf einer µg/ml-Basis immer leicht {\"u}ber der des Gesamtextraktes. Um die in Frage kommenden Mechanismen der Hemmwirkung gegen{\"u}ber Matrixmetalloproteinasen aufzukl{\"a}ren, wurde die Bindung des Gesamtextraktes an Hautpulver, sowie an die Matrixproteine Collagen und Elastin untersucht. Es wurde ein Schutz der Substrate vor enzymatischer Degradierung durch MMPs infolge einer Adsorption der Procyanidine abgeleitet. Die Metabolite M1 und M2 schienen auf Grund eines anderen Mechanismus die Aktivit{\"a}t der MMPs zu hemmen. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmwirkung der untersuchten Inhibitoren auf MMP-9 nach Zinkzusatz vollst{\"a}ndig aufgehoben wurde. Daher konnte eine direkte Interaktion von beiden Metaboliten auf das Zinkatom des aktiven Zentrums angenommen werden. Die Wirkungen der Metabolite M1 und M2 wurden anschließend auf zellul{\"a}rer Ebene untersucht. Es wurde getestet, ob sie einen Einfluss auf die Sekretion von MMP-9 aus bakteriellen Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten Monocyten hatten. Als Positivkontrolle wurden antiinflammatorisch wirkenden PPAR-Agonisten, sowie das endogene Glucocorticoid Hydrocortison eingesetzt, deren Hemmwirkung auf die MMP-9-Freisetzung gut belegt war. Die PPAR-Agonisten waren in Bezug auf die MMP-9-Sekretion die wirksamsten Inhibitoren. Mit einer bemerkenswert niedrigen IC50 waren die beiden Metabolite M1 und M2 in ihrer Wirkung equipotent. Im Vergleich zu Hydrocortison konnte sogar gezeigt werden, dass beide Metabolite potentere Inhibitoren darstellten als das k{\"o}rpereigene antiinflammatorisch wirksame Glucocorticoid. In pharmakokinetischen Untersuchungen wurden Plasmaproben von Probanden nach Einmal- (n = 11) und Mehrfach- (n = 5) Einnahme von 300 bzw. 200 mg Pycnogenol mithilfe der HPLC vermessen. Durch diese Untersuchungen sollte festgestellt werden, ob eine Absorption von Extraktbestandteilen, sowie Metabolisierungsreaktionen im K{\"o}rper stattfinden. Es konnten in den Proben der meisten Probanden erstmalig im Plasma sowohl Extraktbestandteile als auch der Metabolit M1 nachgewiesen werden. Daneben konnten zehn bislang unbekannte Substanzen detektiert werden, die in weiterf{\"u}hrenden Arbeiten noch identifiziert werden m{\"u}ssen. Es wurde eine große interindividuelle Variabilit{\"a}t sowohl im Grad der Konjugation als auch bei den im Plasma vorliegenden Konzentrationen der einzelnen Substanzen festgestellt. Nach Einmalgabe des Extraktes wurden verschiedene Gruppen von Substanzen mit fr{\"u}hen, mittleren, sp{\"a}ten und interindividuell sehr variablen Plasmaspiegelmaxima nachgewiesen. Es konnten erstmalig nach Pycnogenol-Einnahme pharmakokinetische Parameter der bekannten und im Gesamtextrakt quantifizierbaren Verbindungen errechnet werden. Nachfolgend wurde in den Plasmaproben der Probanden nach Pycnogenol-Einnahme nachgewiesen, dass Wirksubstanzen in Konzentrationen vorhanden waren, die tats{\"a}chlich pharmakodynamische Effekte erzielen konnten. Dazu wurde ein neues Versuchskonzept erstellt, bei dem die Hemmung der MMP-9-Sekretion auf zellul{\"a}rer Ebene mit den Plasmaproben der Studienteilnehmer vor und nach Pycnogenol-Einnahme ex vivo untersucht wurde. Nach Mehrfachgabe bewirkten die verd{\"u}nnten Plasmaproben der Probanden eine signifikant verminderte MMP-9-Sekretion um im Mittel 25 \%. Plasmaproben nach einmaliger Einnahme von 300 mg Pycnogenol riefen schon 30 Minuten nach Extrakt-Einnahme eine Hemmung der MMP-9-Sekretion hervor. Diese Hemmung war bis 14 Stunden nach der Einnahme nachzuweisen. Einen wichtigen Transkriptionsfaktor im Entz{\"u}ndungsgeschehen stellt NF-kB dar. Stimuliert durch verschiedene Agenzien f{\"u}hrt NF-kB u.a. zur Induktion von MMP-9. Nach Mehrfachgabe konnte in ex vivo Versuchen mit den Plasmaproben der Studienteilnehmer nach Inkubation mit stimulierten Monocyten eine etwa 15 \%ige Hemmung der NF-kB-Aktivierung gezeigt werden. Es konnte am Beispiel von MMP-9 und NF-kB erstmalig gezeigt werden, dass nach Einnahme von Pycnogenol auch in vivo Konzentrationen an Metaboliten bzw. Bestandteilen erreicht werden, die ex vivo in der Lage waren, pharmakodynamische Effekte zu erzielen. Bislang konnte jedoch keine Zuordnung der pharmakokinetisch identifizierten Verbindungen zu den pharmakodynamischen Effekten erfolgen. Die umfassenden in vitro, ex vivo und in vivo Untersuchungen von Bestandteilen und/oder Metaboliten des Pycnogenol-Extraktes in der vorliegenden Arbeit leisten auf molekularer und auf zellul{\"a}rer Ebene einen grundlegenden Beitrag zum Verst{\"a}ndnis der klinischen antiinflammatorischen Effekte des Kiefernrindenextraktes.},
  subject      = {Strandkiefer},
  language  = {de}
}