@phdthesis{Stahl2006,
  author    = {Stahl, Sonja},
  title     = {Molekulare Mechanismen der Neurodegeneration in der Grosshirnrinde von Kathepsin B und L-Doppelknockoutm{\"a}usen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21606},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Kathepsin B und L sind lysosomale Cysteinproteasen, die mit einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie z. B. Cancerogenese, Tumorangiogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht werden. Dennoch sind bis jetzt nur wenige Proteinsubstrate beschrieben. Ausserdem sind die Mechanismen der Regulation von Zellproliferation, -invasion und -apoptose durch Kathepsin B und L weitgehend unverstanden. Ein kombinierter Mangel beider Kathepsine f{\"u}hrt zu einer fr{\"u}hzeitigen Neurodegeneration in M{\"a}usen, die an neuronale Lipofuszinosen beim Menschen erinnert. In der vorliegenden Studie wurden Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von wildtypischen und doppelt-defizienten Gehirnlysosomen quantifiziert. Eine Kombination von subzellul{\"a}rer Fraktionierung und LC-MS/MS unter Verwendung einer isobarischen Markierung (iTraqTM) erlaubte uns die gleichzeitige Untersuchung von zerebralen Lysosomen aus Wildtyp und Kathepsin B-/-L-/- M{\"a}usen. Ingesamt waren 19 Proteine signifikant erh{\"o}ht in Kathepsin B-/-L-/- Lysosomen. Die meisten erh{\"o}hten Proteine wurden der neuronalen Biosynthese, regenerierenden bzw. endozytotischen oder lysosomalen Kompartimenten zugeordnet. Der Anstieg von Calcyon, dem Delta/Notch- verwandten epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (DNER), Neurochondrin, Phospholipase D3, Rab14, Cathepsin D und Apolipoprotein E l{\"a}sst eine potentielle Rolle von Kathepsin B und L im Axonwachstum und der Synapsenbildung w{\"a}hrend der postnatalen Entwicklung des Zentralnervensystems vermuten.},
  subject      = {Kathepsin B},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Vicik2004,
  author    = {Vicik, Radim},
  title     = {Synthese und Eigenschaften N-Acylierter Aziridin-2,3-dicarboxylate als selektive, peptidomimetische Inhibitoren von Cystein-Proteasen der Cathepsin-L-Subfamilie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11127},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Cystein-Proteasen der S{\"a}uger und Parasiten wurden erst in den letzten zwei Jahrzehnten als pharmazeutisch/medizinisches Target erkannt. Die genauen Aufgaben der einzelnen Enzyme dieser sehr umfangreichen und st{\"a}ndig wachsenden Protease-Familie bleiben zwar teilweise noch unbekannt, es ist jedoch klar, dass ihre Aufgabe nicht nur der unspezifische Protein-Abbau ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit waren die Synthese einer Reihe peptidomimetischer Inhibitoren mit elektrophilem Aziridin-2,3-dicarbons{\"a}ure-Baustein und deren Testung an den Proteasen Cathepsin B (human), Cathepsin L (Paramecium tetraurelia), Falcipain-2 (Plasmodium falciparum) und Rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense). Die Verbindungen sind als irreversible Inhibitoren der Proteasen konzipiert. Der Aziridin-Baustein als Elektrophil wird durch den Cystein-Rest des aktiven Zentrums der Proteasen angegriffen, es erfolgt eine nucleophile Ring{\"o}ffnung und damit die irreversible Alkylierung der Proteasen. Die Aziridin-Bausteine wurden entweder stereoselektiv aus Tartraten oder als Racemate aus Fumaraten dargestellt. Durch NMR-spektroskopische Versuche wurde der Mechanismus der Epimerisierung der als Intermediate der stereoselektiven Synthese auftretenden Azidoalkohole aufgekl{\"a}rt. Die N-Acylierung des Aziridin-Bausteins mit den Aminos{\"a}uren bzw. Dipeptiden erfolgte {\"u}ber Segmentkopplungen oder {\"u}ber eine schrittweise Ankn{\"u}pfung der Aminos{\"a}uren. Es wurden dabei verschiedenste Methoden der Peptidchemie eingesetzt. Die Hemmkonstanten der synthetisierten Substanzen wurden in einem kontinuierlichen fluorimetrischen Mikrotiterplatten-Assay bei Inhibitor-Konzentrationen von 0.35 - 140 µM ermittelt. Als Substrat diente f{\"u}r alle Enzyme Z-Phe-Arg-AMC. Der Nachweis der Irreversibilit{\"a}t der Hemmung wurde durch Dialyse-Versuche und die Affinit{\"a}tsmarkierung von Cathepsin L und Falcipain 2 mit Hilfe eines Biotin-markierten Inhibitors erbracht. Bei Inhibitoren, die eine zeitabh{\"a}ngige Hemmung aufweisen, wurden die Alkylierungskonstanten (ki -Werte) ermittelt. Diese sind im Vergleich zu den Konstanten der Epoxysuccinyl-Peptide ca. 1000x kleiner, was fr{\"u}here Untersuchungen best{\"a}tigt. Aus den ermittelten Dissoziationskonstanten (Ki) ist die Selektivit{\"a}t f{\"u}r Cathepsin-L-{\"a}hnliche Proteasen eindeutig. Dabei wird die Reihenfolge RD > CL > FP >>> CB gefunden. Der beste Inhibitor f{\"u}r alle Enzyme ist die Substanz 116C (BOC-(S)-Leu-(S)-Azy-(S,S)-Azi(OBn)2), f{\"u}r die Hemmkonstanten im unteren micromolaren bzw. sogar nanomolaren Bereich gefunden werden. Unter den Substanzen finden sich auch einige, die f{\"u}r einzelne Enzyme selektiv sind. F{\"u}r CL sind es die Verbindungen 517C, 105G, Z-023B, 023A; f{\"u}r CB 034A und 013B und f{\"u}r RD 112C, 222C, 105B, 013A. Dabei gibt es zwei Inhibitoren (105A, 517G), die selektiv nur die parasit{\"a}ren Enzyme FP und RD hemmen. Die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergab, dass in Abh{\"a}ngigkeit von den Substituenten am Aziridinring (Benzylester, Ethylester, Dis{\"a}ure), von den Substituenten am Aziridin-Stickstoff (Phe-Ala, Leu-Xxx, Gly-Xxx, Xxx = cyclische Aminos{\"a}ure) und der Stereochemie unterschiedliche Bindungsmodi vorliegen m{\"u}ssen. Erste Docking-Versuche, die in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Baumann (Institut f{\"u}r Pharmazie und LMC, Universit{\"a}t W{\"u}rzburg) durchgef{\"u}hrt wurden, best{\"a}tigen dies. Postuliert wird f{\"u}r Inhibitoren, die die Sequenz Leu-Pro enthalten, eine Bindung an die S`- Seite von Cathepsin L. Dies erkl{\"a}rt die Selektivit{\"a}t dieser Inhibitoren, denn innerhalb der S`-Substratbindungstaschen finden sich die gr{\"o}ßten strukturellen Unterschiede zwischen Cathepsin B und den Cathepsin-L-{\"a}hnlichen Proteasen. Im Gegensatz dazu wird f{\"u}r eines der Phe-Ala-Derivate eine Bindung an die S-Taschen postuliert, die zwischen den einzelnen Proteasen geringere strukturelle Unterschiede aufweisen. Dieser Inhibitor hemmt, wie fast alle Phe-Ala-Derivate, dementsprechend auch Cathepsin B besser als die Leu-Xxx-Derivate. In Rahmen einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe Engels Institut f{\"u}r Organische Chemie, Universit{\"a}t W{\"u}rzburg) wurden quantenchemische Rechnungen durchgef{\"u}hrt, die u.a. den Einfluss von Substituenten auf die Kinetik und Thermodynamik der nucleophilen Ring{\"o}ffnung untersuchten. Vorhergesagt wurde, dass Substituenten am Aziridin-Stickstoff, die den {\"U}bergangzustand stabilisieren (N-Formyl), zu einer besseren Hemmung f{\"u}hren sollten. Das darauf hin synthetisierte N-Formylaziridin-2,3-dicarboxylat 008B weist eine etwa 5000x bessere Hemmung von CL auf als das nicht-formylierte Diethylaziridin-2,3-dicarboxylat. Die gezielt als "affinity label" entwickelte Biotin-markierte Verbindung 999C wurde zur Identifizierung von Cystein-Proteasen, die von Plasmodium falciparum exprimiert werden, eingesetzt (Kooperation mit der Arbeitsgruppe Gelhaus/Leippe, Institut f{\"u}r Zoologie, Universit{\"a}t Kiel).},
  subject      = {Aziridine},
  language  = {de}
}