@phdthesis{Buechold2009,
  author    = {B{\"u}chold, Christian},
  title     = {Synthese und Testung cis-konfigurierter Aziridine als pseudo-irreversible Inhibitoren der sekretorischen Aspartatproteasen von Candida albicans},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39358},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Candida albicans geh{\"o}rt zu den f{\"u}r den Menschen fakultativ pathogenen Hefepilzen. Der normalerweise harmlose Begleiter der humanen Mikroflora findet sich haupts{\"a}chlich auf Schleimh{\"a}uten der Mundh{\"o}hle und des Magen-Darm-Trakt sowie in der vaginalen Flora. Menschen, deren Immunsystem geschw{\"a}cht ist, sind jedoch besonders anf{\"a}llig f{\"u}r Infektionen, die durch den Pilz hervorgerufen werden k{\"o}nnen. Neben oberfl{\"a}chlichen kann es dabei auch zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen kommen, die nicht selten zum Tod des Patienten f{\"u}hren. Durch ein zunehmendes Auftreten von Resistenzen gegen gebr{\"a}uchliche Pharmaka besteht aktuell ein dringender Bedarf an neuen Wirkstoffen gegen Candida. Die zehn vom Hefepilz exprimierten sekretorischen Aspartatproteasen (SAP1-10), die als wichtige Virulenzfaktoren gelten, stellten sich dabei zunehmend als vielversprechende Targets heraus. Das Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der literaturbekannten cis-konfigurierten 3-Phenylaziridin-2-carboxylate A-07 und A-08 als irreversible Inhibitoren der SAP-Isoenzyme. Die Variation der Substituenten am Aziridinstickstoff f{\"u}r die Adressierung der S3-Tasche im Enzym erfolgte durch Alkyl-, Aryl- und Acylreste. Die Aminos{\"a}ureester wurden in Konfiguration und Art der Seitenkette modifiziert, um eine Verbesserung der Anpassung an die S1'-Tasche zu erm{\"o}glichen. Die cis-3-Phenylaziridin-2-carboxylate wurden durch Cromwell-Synthese als Racemate erhalten. Aminos{\"a}ure- und Peptidkupplungen erfolgten mit g{\"a}ngigen Kupplungsreagenzien (PPA, DPPA). Die stereoselektive Synthese des methylenverbr{\"u}ckten Aziridin-2-carboxylats A-10 erfolgte durch Redoxkondensation nach Mukaiyama. Die synthetisierten Verbindungen wurden in einem fluorimetrischen FRET-Assay auf ihre inhibitorische Wirkung gegen SAP2 getestet. Dabei war das im FRET-Assay bislang an SAP2 verwendete Substrat Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH auch f{\"u}r Testungen an SAP1, 3 \& 8 sowie Cathepsin D geeignet. Neben den jeweiligen Km-Werten konnten f{\"u}r diese Enzyme auch die zugeh{\"o}rigen kcat-Werte bestimmt werden. Zur Bestimmung der Hemmkonstanten wurde f{\"u}r die aktiven Verbindungen ein Verd{\"u}nnungsassay nach Kitz und Wilson durchgef{\"u}hrt. 20 der 46 Aziridin-2-carboxylate erreichten SAP2 k2nd-Werte von mindestens 7880 M-1min-1. Die mit k2nd-Werten von 60608 bis 118582 M-1min-1 potentesten Verbindungen wurden durch (R)-Aminos{\"a}uresubstitution (A-28, A-31) bzw. durch Cyclohexylmethyl-Verkn{\"u}pfung am Aziridinstickstoff (A-43, A-45) erhalten. F{\"u}r die einzelnen Diastereomere von A-31, A-31a und A-31b, wurde eine signifikant unterschiedliche Hemmwirkung festgestellt. Die Inhibitoren zeigten eine zeitabh{\"a}ngige Hemmung, die nach ca. 30 min Inkubationszeit jedoch wieder schw{\"a}cher wurde. LC-MS- und NMR-Studien lassen einen pseudo-irreversiblen Hemmmechanismus vermuten: Der Inhibitor bindet zun{\"a}chst irreversibel unter Ring{\"o}ffnung des Aziridins an das Enzym. Der entstehende Ester wird danach unter den sauren Assaybedingungen wieder hydrolysiert. Der resultierende Aminoalkohol bindet anschließend als {\"U}bergangszustandsanalogon reversibel an das Enzym. Selektivit{\"a}tsstudien an Cathepsin D zeigten f{\"u}r 36 der 46 Aziridin-2-carboxylate k2nd-Werte von 10350 bis 936544 M-1min-1. Damit sind die Verbindungen an CathD aktiver als an SAP2. Die 1-Cyclohexylmethyl-verkn{\"u}pften Aziridine wiesen auch an CathD die h{\"o}chsten k2nd-Werte auf, wenngleich sich dabei die (R)-Konfiguration der Aminos{\"a}urereste (A-57, A-59) als die aktivere Variante herausstellte. Mit dem (R)-Phe-substituierten 1-tert-Butylaziridin A-58 erreichte der potenteste Vertreter der Reihe bereits einen Ki-Wert im dreistelligen nano-molaren Bereich. Ebenso wurden f{\"u}r die (R)-Aminos{\"a}ure-Analoga von A-07 und A-08 (A-28, A-31) erh{\"o}hte Hemmkonstanten erhalten. Wie SAP2 wird auch CathD durch die (an)getrennten Diastereomere A-31a und A-31b signifikant unterschiedlich stark inhibiert. Mit den (R)-Valin-verkn{\"u}pften Aziridinen A-81, A-82 und A-85 fanden sich aktive verzweigt-Alkyl-substituierte CathD-Inhibitoren.},
  subject      = {Candida albicans},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Dudaczek2009,
  author    = {Dudaczek, J{\"u}rgen},
  title     = {Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35175},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Ziel der Dissertation „Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern" war es neue Oktapeptide zu finden, die die F{\"a}higkeit besitzen Phosphate und Ester zu Hydrolysieren. In der Natur ist bei den Katalysereaktionen die Sekund{\"a}rstruktur von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen dieser Arbeit zun{\"a}chst ein Modellsystem entwickelt, mit dem gezeigt werden konnte, dass es m{\"o}glich ist mit einfachen Bausteinen wie Diaminobutan und dem in der Gruppe von Schmuck entwickelten Guanidiniocarbonylpyrrol ein Molek{\"u}l zu entwickeln, welches eine stabile intramolekulare Schleife in polaren L{\"o}sungsmitteln ausbildet. Aufgrund der geringen Gr{\"o}ße des Molek{\"u}ls, konnte kein \&\#946;-Faltblatt gebildet werden. Dennoch konnte mit Hilfe der NMR-Spektroskopie gezeigt werden, dass in dem polaren L{\"o}sungsmittel Methanol eine stabile Schleifenbildung mit einer intramolekularen Komplexierung stattfindet. Nach erfolgreicher Synthese des oben beschriebenen Testsystems wurde als n{\"a}chster Schritt eine kombinatorische Organokatalysatorbibliothek mit 625 Mitgliedern aufgebaut. Die Struktur der Peptide kann man in drei Teile untergliedern. Der erste Teil ist die feste Phase, das Amino-TentaGel, an das nacheinander die einzelnen Aminos{\"a}uren gekuppelt wurden. An Stelle der Butylgruppe als Schleifenelement wurde Aib-D-Pro als \&\#946;-Turn Element eingesetzt. Den dritten Teil bilden die bei der Synthese der Oktapeptide eingesetzten Aminos{\"a}uren AA1, AA3, AA6, AA8, die ein \&\#946;-Faltblatt ausbilden sollten. Die kombinatorische Synthese der Bibliothek erfolgte nach der „Split and Mix" Methode. Zum Unterscheiden der einzelnen Mitglieder untereinander, wurde die feste Phase zusammen mit einem Radiofrequenzchip in IRORI MikroKans gegeben. Durch die unterschiedlichen Aminos{\"a}uren ist die Bibliothek f{\"u}r die Katalyse in polaren L{\"o}sungsmitteln wie Wasser konzipiert worden. Als exemplarische Katalysereaktionen wurden dabei zwei Hydrolysereaktionen (Phosphatspaltung und Esterspaltung) ausgesucht. Zun{\"a}chst wurde f{\"u}r beide Reaktionen ein Screening mit unterschiedlichen Bedingungen durchgef{\"u}hrt. Dabei hat sich gezeigt, dass bei der Phosphatspaltung nur dann die Reaktion katalysiert wurde, wenn das k{\"u}nstliche Argininanalogon, welches in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert wurde, vorhanden war. Der beste Katalysator hat die Reaktion 175-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei dem Screening der Esterspaltung hat sich herausgestellt, dass die Aminos{\"a}ure Histidin essentiell f{\"u}r die katalytische Aktivit{\"a}t ist. Der beste Katalysator bei der Esterspaltung hat die Hydrolyse des Esters 345-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei beiden Reaktionen hat sich gezeigt, dass die Sequenz der Katalysatoren sehr wichtig f{\"u}r die Katalyse ist. So verringert z.B. bei der Esterhydrolyse der Austausch zweier Aminos{\"a}uren eine Verringerung der Aktivit{\"a}t von dem Faktor 294 auf den Beschleunigungsfaktor 35. Auch konnten beide Katalysereaktionen in w{\"a}ssrigem gepufferten L{\"o}sung durchgef{\"u}hrt werden. Damit ist es m{\"o}glich gewesen neue Oktapeptide f{\"u}r die Katalyse von Phosphat- und Esterspaltung zu finden und diese erfolgreich im Screening als auch in L{\"o}sung zu untersuchen.},
  subject      = {Organokatalyse},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Poppe2009,
  author    = {Poppe, Heiko Anton},
  title     = {Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifit{\"a}t von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34477},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Neben den cAMP- und cGMP-abh{\"a}ngigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkan{\"a}le CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor" Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinit{\"a}t f{\"u}r ihr Zielprotein, {\"u}ber ihre Hydrolysestabilit{\"a}t gegen{\"u}ber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am h{\"a}ufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln h{\"a}ufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Ver{\"a}nderungen der intrazellul{\"a}ren cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP - eine unerw{\"u}nschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem R{\"u}ckschl{\"u}sse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Dom{\"a}nen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivit{\"a}t, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des f{\"u}r ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates.},
  subject      = {Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3},
  language  = {de}
}