@phdthesis{Wilhelm2018,
  author    = {Wilhelm, Christian},
  title     = {Die Rolle von Chronophin bei Schlaganfall-induziertem Funktionsverlust der Blut-Hirn-Schranke},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-163877},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Der isch{\"a}mische Schlaganfall ist mit einer j{\"a}hrlichen Inzidenz von 200/100 000 Einwohnern die h{\"a}ufigste Gef{\"a}ßerkrankung in Deutschland. Atherothrombose, arterielle Hypertonie und Embolien unterschiedlichen Ursprungs sind die wesentlichen Ursachen des isch{\"a}mischen Schlaganfalls. Die neurologischen Defizite nach einem Schlaganfall resultieren aus einem gest{\"o}rten zerebralen Blutfluss und somit einer insuffizienten Sauerstoffversorgung. Zus{\"a}tzlich ist die {\"O}dembildung, welche von einer gesteigerten Permeabilit{\"a}t der Blut-Hirn-Schranke verursacht wird, am neuronalen Zelltod beteiligt. Chronophin ist eine Aktinzytoskelett-regulierende Serin-Phosphatase. In einem isch{\"a}mischen Schlaganfall-Modell konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass der globale Verlust von Chronophin zu einer vermehrten {\"O}dembildung und einem aggravierten neurologischen Zustand der M{\"a}use im Vergleich zu wildtypischen Kontrollen f{\"u}hrte. Hirnlysate von wildtypischen M{\"a}usen zeigten verringerte Chronophin-Level in der vom Schlaganfall betroffenen Hemisph{\"a}re. Jedoch konnten initiale immunhistochemische und zellbiologische Untersuchungen weder Chronophin-abh{\"a}ngige Ver{\"a}nderungen der Blut-Hirn-Schranke feststellen noch einen zerebralen Zelltyp identifizieren, der f{\"u}r den sch{\"u}tzenden Effekt von Chronophin verantwortlich ist. Diese Ergebnisse weisen auf einen komplexen, vielzelligen Mechanismus hin, dem die sch{\"u}tzende Rolle von Chronophin im isch{\"a}mischen Schlaganfall unterliegt. Die Entschl{\"u}sselung dieses Mechanismus ist Aufgabe k{\"u}nftiger Untersuchungen.},
  subject      = {Schlaganfall},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Seifried2014,
  author    = {Seifried, Annegrit},
  title     = {Mechanistic insights into specificity determinants and catalytic properties of the haloacid dehalogenase-type phosphatase AUM},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-101009},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are an emerging family of enzymes with important functions in physiology and disease. HAD phosphatases can target diverse metabolites, lipids, DNA, and serine/threonine or tyrosine phosphorylated proteins with often high specificity (Seifried et al., 2013). These enzymes thus markedly enlarge the repertoire and substrate spectrum of mammalian phosphatases. However, the basis of HAD phosphatase substrate specificity is still elusive and a number of mammalian HAD phosphatases remain uncharacterized to date. This study characterizes the biochemical and structural properties of AUM (aspartate-based, ubiquitous, Mg2+-dependent phosphatase), a previously unexplored mammalian HAD phosphatase. In vitro phosphatase assays of purified, recombinant AUM showed phosphatase activity towards para-nitrophenyl phosphate and adenine and guanine nucleotide di- and triphosphates. Inhibitor studies indicated that similar to other HAD superfamily members, the AUM-catalyzed dephosphorylation reaction proceeds via a pentacovalent phosphoaspartate intermediate. In line with an aspartate-based catalytic mechanism, AUM was insensitive to inhibitors of serine/threonine phosphatases. The characterization of the purified recombinant murine enzyme also revealed that AUM exists in equilibrium between dimers and tetramers. AUM was identified as the closest, yet functionally distinct relative of chronophin, a pyridoxal 5'-phosphate and serine/threonine-directed phosphatase. Phylogenetic analyses showed that AUM and chronophin evolved via duplication of an ancestral gene at the origin of the vertebrates. In contrast to chronophin, AUM acts as a tyrosine-specific HAD-type phosphatase in vitro and in cells. To elucidate how AUM and chronophin achieve these distinct substrate preferences, comparative evolutionary analyses, biochemical approaches and structural analyses were combined. Swapping experiments of less homologous regions between AUM and chronophin were performed. The mutational analysis revealed residues important for AUM catalysis and specificity. A single differently conserved residue in the cap domain of AUM or chronophin is crucial for phosphatase specificity (AUML204, chronophinH182). The X-ray crystal structure of the AUM cap fused to the catalytic core of chronophin (CAC, PDB: 4BKM) was solved to 2.65 {\AA} resolution. It presents the first crystal structure of the murine AUM capping domain. The detailed view of the catalytic clefts of AUM and chronophin reveals the structural basis of the divergent substrate specificities. These presented findings provide insights into the design principles of capped HAD phosphatases and show that their substrate specificity can be encoded by a small number of predictable residues. In addition, the catalytic properties of AUM were investigated, identifying a mechanism of reversible oxidation regulating the activity of AUM in vitro. AUM phosphatase activity is inhibited by oxidation and can be recovered by reduction. The underlying molecular mechanism was revealed by mutational analyses. The cysteines C35, C104 and C243, located in the AUM core domain, are responsible for the inhibition of AUM by oxidation. C293 mediates the redox-dependent tetramerization of AUM in vitro. Based on the chronophin and CAC structure, a direct impact of the oxidation of C35 on the nucleophile D34 is proposed. In addition, a redox-dependent disulfide bridge (C104, C243), connecting the core and cap domain of AUM may be important for an open/close-mechanism. This hypothesis is supported by CD spectroscopy experiments that demonstrate a structural change in AUM upon reduction. These data present the first evidence for the regulation of AUM catalysis by reversible oxidation. This finding is so far unique in the field of HAD phosphatases. In this context, the first cell-based AUM activity assay was developed. For this, the artificial substrate pNPP was combined with the reducing agent DTT to create a specific AUM activity readout. This fractionation-based assay is the first tool to differentiate between cell lines or tissues with different AUM concentrations or activities. Taken together, the presented biochemical characterization reveals the specificity determinants and catalytic properties of AUM. General insights into structural determinants of mammalian HAD phosphatase substrate recognition are provided and reversible oxidation as possible regulatory mechanism for AUM is proposed. These findings constitute a framework for further functional analyses to elucidate the biomedical importance of AUM.},
  subject      = {Proteintyrosinphosphatase},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Dudaczek2009,
  author    = {Dudaczek, J{\"u}rgen},
  title     = {Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35175},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Ziel der Dissertation „Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern" war es neue Oktapeptide zu finden, die die F{\"a}higkeit besitzen Phosphate und Ester zu Hydrolysieren. In der Natur ist bei den Katalysereaktionen die Sekund{\"a}rstruktur von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen dieser Arbeit zun{\"a}chst ein Modellsystem entwickelt, mit dem gezeigt werden konnte, dass es m{\"o}glich ist mit einfachen Bausteinen wie Diaminobutan und dem in der Gruppe von Schmuck entwickelten Guanidiniocarbonylpyrrol ein Molek{\"u}l zu entwickeln, welches eine stabile intramolekulare Schleife in polaren L{\"o}sungsmitteln ausbildet. Aufgrund der geringen Gr{\"o}ße des Molek{\"u}ls, konnte kein \&\#946;-Faltblatt gebildet werden. Dennoch konnte mit Hilfe der NMR-Spektroskopie gezeigt werden, dass in dem polaren L{\"o}sungsmittel Methanol eine stabile Schleifenbildung mit einer intramolekularen Komplexierung stattfindet. Nach erfolgreicher Synthese des oben beschriebenen Testsystems wurde als n{\"a}chster Schritt eine kombinatorische Organokatalysatorbibliothek mit 625 Mitgliedern aufgebaut. Die Struktur der Peptide kann man in drei Teile untergliedern. Der erste Teil ist die feste Phase, das Amino-TentaGel, an das nacheinander die einzelnen Aminos{\"a}uren gekuppelt wurden. An Stelle der Butylgruppe als Schleifenelement wurde Aib-D-Pro als \&\#946;-Turn Element eingesetzt. Den dritten Teil bilden die bei der Synthese der Oktapeptide eingesetzten Aminos{\"a}uren AA1, AA3, AA6, AA8, die ein \&\#946;-Faltblatt ausbilden sollten. Die kombinatorische Synthese der Bibliothek erfolgte nach der „Split and Mix" Methode. Zum Unterscheiden der einzelnen Mitglieder untereinander, wurde die feste Phase zusammen mit einem Radiofrequenzchip in IRORI MikroKans gegeben. Durch die unterschiedlichen Aminos{\"a}uren ist die Bibliothek f{\"u}r die Katalyse in polaren L{\"o}sungsmitteln wie Wasser konzipiert worden. Als exemplarische Katalysereaktionen wurden dabei zwei Hydrolysereaktionen (Phosphatspaltung und Esterspaltung) ausgesucht. Zun{\"a}chst wurde f{\"u}r beide Reaktionen ein Screening mit unterschiedlichen Bedingungen durchgef{\"u}hrt. Dabei hat sich gezeigt, dass bei der Phosphatspaltung nur dann die Reaktion katalysiert wurde, wenn das k{\"u}nstliche Argininanalogon, welches in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert wurde, vorhanden war. Der beste Katalysator hat die Reaktion 175-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei dem Screening der Esterspaltung hat sich herausgestellt, dass die Aminos{\"a}ure Histidin essentiell f{\"u}r die katalytische Aktivit{\"a}t ist. Der beste Katalysator bei der Esterspaltung hat die Hydrolyse des Esters 345-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei beiden Reaktionen hat sich gezeigt, dass die Sequenz der Katalysatoren sehr wichtig f{\"u}r die Katalyse ist. So verringert z.B. bei der Esterhydrolyse der Austausch zweier Aminos{\"a}uren eine Verringerung der Aktivit{\"a}t von dem Faktor 294 auf den Beschleunigungsfaktor 35. Auch konnten beide Katalysereaktionen in w{\"a}ssrigem gepufferten L{\"o}sung durchgef{\"u}hrt werden. Damit ist es m{\"o}glich gewesen neue Oktapeptide f{\"u}r die Katalyse von Phosphat- und Esterspaltung zu finden und diese erfolgreich im Screening als auch in L{\"o}sung zu untersuchen.},
  subject      = {Organokatalyse},
  language  = {de}
}