@phdthesis{Kuhn2019,
  author    = {Kuhn, Maximilian},
  title     = {Strukturbasiertes Design von MIP-Inhibitoren und computergest{\"u}tzte Selektivit{\"a}tsuntersuchung gegen{\"u}ber MIP- und humanen FKB-Proteinen},
  doi       = {10.25972/OPUS-16575},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-165757},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Bakterielle und parasit{\"a}re MIP-Proteine stellen wichtige Virulenzfaktoren dar, deren Inhibition das {\"U}berleben der Erreger sowie deren Penetration in menschliche Zellen stark einschr{\"a}nken kann. In dieser Arbeit standen die MIP-Proteine von Burkholderia pseudomallei (Ausl{\"o}ser der Melioidose) und Legionella pneumophila (Legion{\"a}rskrankheit) im Fokus. Außerdem wurde das MIP-Protein von Trypanosoma cruzi (Chagas-Krankheit) untersucht. Die strukturverwandten humanen FKB-Proteine FKBP12 und FKBP52 sind relevante „off-targets", wie Experimente mit Knockout-M{\"a}usen gezeigt haben. Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung von bekannten MIP-Inhibitoren im Hinblick auf ihre Affinit{\"a}t und Selektivit{\"a}t f{\"u}r MIP-Proteine gegen{\"u}ber den beiden genannten FKB-Proteinen bei gleichzeitig verbesserter L{\"o}slichkeit, mit Hilfe von in silico Methoden. Ausgangspunkt waren hierbei zwei von Dr. Christina Juli und Dr. Florian Seufert entwickelte Leitstrukturen, welche ein Pipecolins{\"a}uregrundger{\"u}st aufweisen. Diese Referenzliganden beinhalten einen 3,4,5-Trimethoxyphenylring (TMPR, vgl. Ref_t) bzw. einen Pyridinylring (Ref_p). Beim Vergleich von insgesamt 32 MIP- und FKB-Proteinen konnten in zwei Loop-Bereichen, welche 50er bzw. 80er Loop genannt werden, relevante Unterschiede in der Aminos{\"a}uresequenz identifiziert werden. Die Nummerierung bezieht sich stets auf FKBP12. Diese Unterschiede ließen sich zum Design von vergleichsweise selektiv an MIP-Proteine bindenden Molek{\"u}len nutzen. Der 50er Loop ist in nahezu allen MIP-Proteinen (jedoch nicht in BpsMIP) im Vergleich zu den FKB-Proteinen um zwei Aminos{\"a}uren verk{\"u}rzt. Dadurch befindet sich das Proteinr{\"u}ckgrat von LpnMIP (Gln49) und TcrMIP (Arg49) n{\"a}her am Zentrum der Bindetasche (definiert als Ile56, welches durch die Pipecolins{\"a}ureesterfunktion der Liganden adressiert wird). MD-Simulationen der beiden Apoproteine belegten, dass die geringere Distanz nicht durch Artefakte beim Modellieren der Strukturen bedingt ist. Aufbauend auf dieser Erkenntnis wurde gezeigt, dass der Pyridinylring von Ref_p eine Wasserstoffbr{\"u}cke zu Gln49 ausbildet. Experimentell wurde dieser Befund durch eine entsprechende chemische Verschiebung der Aminos{\"a}ure im NMR-Experiment von Dr. Kristian Schweimer best{\"a}tigt. Durch {\"U}berbr{\"u}ckung des Pipecolins{\"a}urerings (Ligand 6bp) konnte die Wasserstoffbr{\"u}cke in MD-Simulationen weiter stabilisiert werden. Durch Rechnungen zur Absch{\"a}tzung der freien Bindungsenthalpien (mittels LIE und MM/GBSA) wurde eine erh{\"o}hte Affinit{\"a}t von 6bp im Vergleich zu Ref_p in LpnMIP ermittelt. Im Laufe der Arbeit wurde anhand von pIC50-Werten, welche von Dr. Mathias Weiwad bestimmt wurden, erkannt, dass Liganden mit Pyridinylring oftmals eine bessere Affinit{\"a}t in LpnMIP aufweisen als die entsprechenden Liganden mit TMPR. Durch MD Simulationen wurde nachgewiesen, dass der TMPR in LpnMIP nur schwer an der in den anderen Proteinen bevorzugten Position binden kann. Grund hierf{\"u}r ist die Mutation einer Aminos{\"a}ure (zu Pro57) in diesem Bereich von LpnMIP: Diese verf{\"u}gt {\"u}ber eine wenig flexible Seiten-kette, an welche sich der TMPR auf Grund seiner Rigidit{\"a}t nicht anpassen kann, was die Interaktion zwischen Protein und Ligand st{\"o}rt. Der Pyridinylring von Ref_p ist hiervon nicht betroffen, da er bevorzugt an einer anderen Stelle (Gln49, s. o.) bindet. Der 80er Loop weist in vielen MIP-Proteinen deutlich hydrophobere Aminos{\"a}uren auf als in FKB-Proteinen. Von besonderem Interesse ist die Position 90, da hier in BpsMIP und LpnMIP sterisch weniger anspruchsvolle Aminos{\"a}uren (Val, Pro) vorliegen als in den bei-den FKB-Proteinen (Ile, Lys). Dieser Unterschied wurde mit kleinen hydrophoben Substituenten am Phenylring der Liganden adressiert. Bereits im Docking zeigten sich die positiven Effekte der para-Substitution durch Halogenatome oder eine Methylgruppe. Die von Dr. Mathias Weiwad und Dr. Mirella Vivoli ermittelten pIC50- bzw. pKi-Werte best{\"a}tigten diesen Trend. Zugleich nahm die Affinit{\"a}t zu FKBP12 deutlich ab. Bei der Untersuchung der Referenzliganden sowie deren Chlor- und Bromderivate in MD-Simulationen zeigte sich, dass der Phenylring der Liganden in den MIP-Proteinen bevorzugt in Richtung des 80er Loops orientiert ist; in den FKB-Proteinen liegt er hingegen um etwa 110° gedreht vor und kann somit schlechter mit der Bindetasche interagieren. Besonders ausgepr{\"a}gt ist dieser Effekt in FKBP12. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der Phenylring durch einen 4-Bromo-1H-imidazol-2-ylsubstituenten ersetzt (Ligand 8ap). Dieser ist in der Lage, in der erwarteten Orientierung im Bereich des 80er Loops von BpsMIP zu binden und gleichzeitig eine stabile Wasserstoffbr{\"u}cke zu Asp37 auszubilden. Hieraus resultiert f{\"u}r den Liganden eine deutlich h{\"o}here Affinit{\"a}t in LIE- und MM/GBSA-Rechnungen; in FKBP12 blieb sie auf Grund der dort instabilen Interaktion unver{\"a}ndert. Die berechneten Energien k{\"o}nnen unmittelbar f{\"u}r einen relativen Vergleich verschiedener Liganden in einer Bindetasche verwendet werden. F{\"u}r die Vorhersage von pKi- bzw. pIC50-Werten in den verschiedenen Proteinen ist eine Kalibrierung gegen die gemessenen Affinit{\"a}ten erforderlich. Dies wurde f{\"u}r BpsMIP durchgef{\"u}hrt, indem eine lineare Korrelation zwischen den pKi- bzw. pIC50-Werten und den mit MM/GBSA ermittelten Energien aufgestellt wurde. F{\"u}r LIE wurde auf publizierte Werte von Lamb et al. zur{\"u}ckgegriffen. Die berechneten Affinit{\"a}ten stimmen f{\"u}r die bereits getesteten Inhibitoren gut mit den experimentellen pKi- und pIC50-Werten {\"u}berein. Anhand der Modelle werden f{\"u}r 8ap Werte vorhergesagt, die besser als die experimentellen Affinit{\"a}ten bekannter Liganden sind. Idealerweise k{\"o}nnen auch aus den Scores, die durch Docking erhalten werden, bereits R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Affinit{\"a}ten der Liganden gezogen werden. F{\"u}r die untersuchten Proteine war dies, auf Grund des engen Bereichs der experimentell ermittelten pKi- und pIC50-Werte, nicht mit hinreichender Richtigkeit m{\"o}glich. Um die Scores dennoch f{\"u}r die Beurteilung neuer Liganden verwenden zu k{\"o}nnen, wurden logistische Regressionsmodelle erstellt. Anhand dieser kann abgesch{\"a}tzt werden, ob ein Molek{\"u}l in BpsMIP submikromolare Affinit{\"a}t aufweist. Die Richtigkeit dieser Vorhersagemodelle konnte durch die Ber{\"u}cksichtigung dreier weiterer Deskriptoren (Konfiguration am Stereozentrum der Pipecolins{\"a}ure, Molekulargewicht und logD-Wert) deutlich verbessert werden, wobei die AUC der entsprechenden ROC-Kurven Werte bis zu 0.9 erreichte. Diese Modelle k{\"o}nnen f{\"u}r die Postprozessierung eines Dockings angewendet werden, um die vielversprechendsten Kandidaten zu identifizieren und anschließend in rechnerisch anspruchsvolleren MD-Simulationen genauer zu untersuchen. Mit dieser Arbeit wurde zur Weiterentwicklung der Leitstrukturen Ref_t und Ref_p beigetragen. Viele der getesteten Derivate wiesen deutlich verbesserte L{\"o}slichkeit bei gleichbleibender Affinit{\"a}t auf. Ferner wurden erstmalig detailliert die Unterschiede in den Bindetaschen zwischen 32 MIP- und FKB-Proteinen evaluiert. Hiervon wurden f{\"u}nf in MD-Simulationen als Apoprotein und im Komplex mit verschiedenen Inhibitoren verglichen. Anhand dieser Simulationen wurde nachgewiesen, dass jeweils eine Aminos{\"a}ure in BpsMIP und LpnMIP im Vergleich zum wichtigsten „off-target" FKBP12 selektiv durch eine Wasserstoffbr{\"u}cke adressiert werden kann. Durch LIE- und MM/GBSA-Rechnungen konnte gezeigt werden, dass in diesen hochkonservierten Bindetaschen eine bedeutende Modulation der Affinit{\"a}t zugunsten von BpsMIP m{\"o}glich ist.},
  subject      = {Computational chemistry},
  language  = {de}
}