@phdthesis{Willmann2023,
  author    = {Willmann, Lukas},
  title     = {Altersabh{\"a}ngige Makuladegeneration - Regeneration des retinalen Pigmentepithels durch Anregung zur Proliferation durch den Transkriptionsfaktor E2F2},
  doi       = {10.25972/OPUS-29183},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-291833},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist weltweit die h{\"a}ufigste Ursache von irreversibler Erblindung des alternden Menschen. Mit der anti-VEGF-Behandlung steht f{\"u}r die deutlich seltenere feuchte AMD eine zugelassene Therapie bereit, die deutlich h{\"a}ufigere trockene AMD entzieht sich aktuell jedoch jeglicher Therapie. Ein zentraler Pathomechanismus der AMD ist der progrediente Untergang des retinalen Pigmentepithels (RPE). Die Rarifizierung und letztendlich Atrophie des RPEs f{\"u}hrt zum Untergang der funktionellen Einheit aus RPE, Photorezeptoren und Bruch'scher Membran und somit zum irreversiblen Funktionsverlust. Ein m{\"o}glicher therapeutischer Ansatz, der progredienten Atrophie des RPEs entgegenzuwirken, ist, das prinzipiell post- mitotischen RPE zur Proliferation anzuregen. Grundlage unserer in vitro Untersuchungen ist das ARPE-19 Zellmodell. Um die Proliferation anzuregen wurden die RPE-Zellen mit E2F2, einem Zellzyklus- regulierendem Transkriptionsfaktor, transfiziert. Zun{\"a}chst wurde ein nicht-proliferatives RPE-Zellmodell mit spontanem Wachstumsarrest etabliert. Innerhalb von zwei Wochen konnte die Ausbildung von Zonulae occludentes als Zeichen der Integrit{\"a}t des adh{\"a}renten Zellmonolayers beobachtet werden. Die chemische Transfektion von E2F2 unter einem CMV-Promoter f{\"u}hrte zur {\"U}berexpression von E2F2-Protein. Der proliferationssteigernde Effekt von E2F2 konnte durch die Proliferationsmarker Cyclin D1 sowie Ki67, dem Anstieg der BrdU-Aufnahme und der nach Transfektion mit E2F2 zunehmenden Gesamtzellzahl nachgewiesen werden. Der Zellzahlerh{\"o}hung standen jedoch potentiell qualitative und funktionelle Einbußen entgegen. So zeigten sich nach Behandlung mit E2F2 die Zellviabilit{\"a}t reduziert und die Apoptoserate sowie die Permeabilit{\"a}t des Epithels erh{\"o}ht. Diese Einschr{\"a}nkungen waren jedoch nur passager bis 7 Tage nach Transfektion sichtbar und reversibel. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Defizite nicht durch E2F2 selbst, sondern durch das Transfektionsreagenz PEI bedingt waren. Weitere funktionelle Defizite k{\"o}nnten durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) verursacht werden. Hier zeigte sich durch E2F2 keine De-Differenzierung im Sinne einer typischen EMT-Marker- Expression. Die vorliegende Arbeit zeigt in einem in vitro Zellmodell die Grundlagen eines vielversprechenden Ansatzes zur Therapie der trockenen AMD: Durch {\"U}berexpression eines den Zellzyklus regulierenden Gens (hier E2F2) wurde die RPE-Regeneration angeregt. Analog zur schon zugelassenen Gentherapie des RPEs bei RPE65-assoziierten Netzhautdystrophien durch den Transfer von funktionst{\"u}chtigem RPE65-Gen mittels Adeno-assoziierten Viren k{\"o}nnte mittels E2F2, {\"u}bertragen mit einem lentiviralen Verktor, eine Stimulation des RPEs zur Proliferation m{\"o}glich sein. Entscheidend ist der m{\"o}glichst gute Struktur- und Funktionserhalt des Photorezeptor-Bruch-Membran-RPE Komplexes. Eine Therapie sollte daher in fr{\"u}hen Krankheitsstadien erfolgen, um die Progression zu fortgeschrittenen Erkrankungsstadien mit irreversiblem Funktionsverlust zu verz{\"o}gern oder zu verhindern.},
  subject      = {Netzhaut},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Henninger2022,
  author    = {Henninger, Markus},
  title     = {Funktion der zentralen metabolischen Kinase SnRK1 und von ihr abh{\"a}ngiger Transkriptionsfaktoren bei der Mobilisierung von Speicherstoffen w{\"a}hrend der \(Arabidopsis\) Keimlingsentwicklung},
  doi       = {10.25972/OPUS-21430},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-214305},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Pflanzen m{\"u}ssen sich w{\"a}hrend der Samenkeimung und Keimlingsentwicklung {\"u}ber eingelagerte Speicherstoffe heterotroph versorgen, bis sie, nach Etablierung ihres Photosyntheseapparats, einen autotrophen Lebensstil f{\"u}hren k{\"o}nnen. Diese Arbeit geht von der Hypothese aus, dass der evolution{\"a}r konservierten zentral-metabolischen Kinase Snf1-RELATED PROTEIN KINASE 1 (SnRK1) eine besondere Rolle bei der Mobilisierung von Speicherstoffen w{\"a}hrend der Keimlingsentwicklung zukommt. W{\"a}hrend die Bedeutung von SnRK1 als zentraler Regulator katabolischer Prozesse unter Energiemangel- und Stresssituationen bereits gezeigt wurde, war die Funktion von SnRK1 im Zusammenhang mit der Samenkeimung weitgehend ungekl{\"a}rt. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass SnRK1 in Arabidopsis die Mobilisierung und Degradation von Speicherstoffen, insbesondere von Triacylglyceride (TAGs), Samenspeicherproteinen und Aminos{\"a}uren, steuert. Sowohl Studien zur Lokalisation von SnRK1:GFP-Fusionsproteinen als auch Kinaseaktivit{\"a}tsassays unterst{\"u}tzen eine m{\"o}gliche Funktion von SnRK1 w{\"a}hrend der Keimlingsentwicklung. Eine induzierbare snrk1-knockdown Mutante zeigt neben einem eingeschr{\"a}nkten Wurzel- und Hypokotylwachstum auch keine Ausbildung eines Photosyntheseapparats, was die zentrale Rolle der SnRK1 in diesem fr{\"u}hen Entwicklungsstadium untermauert. Durch F{\"u}tterungsexperimente mit Glukose konnte der Ph{\"a}notyp einer snrk1 -Mutante in Keimlingen gerettet werden. Dies zeigt, dass der metabolische Block durch externe Gabe von Kohlenhydraten umgangen werden kann. Die zentrale Funktion von SnRK1 ist folgich der Abbau von Speicherstoffen und keine allgemeine Deregulation des pflanzlichen Stoffwechsels. Durch massenspektrometrische Untersuchungen von Keimlingen des Wildtyps und der snrk1-Mutante konnte gezeigt werden, dass TAGs in der Mutante in der sp{\"a}- ten Keimlingsentwicklung ab Tag 4 langsamer abgebaut werden als im Wildtyp. Ebenso werden Samenspeicherproteine in der Mutante langsamer degradiert, wodurch die Verf{\"u}gbarkeit von freien Aminos{\"a}uren in geringer ist. Entgegen der allgemeinen Annahme konnte gezeigt werden, dass w{\"a}hrend der Keimlingsentwicklung zumindest in Arabidopsis, einer {\"o}lhaltigen Pflanze, zun{\"a}chst Kohlenhydrate in Form von Saccharose abgebaut werden, bevor die Degradation von TAGs und Aminos{\"a}uren beginnt. Diese Abbauprodukte k{\"o}nnen dann der Glukoneogenese zugef{\"u}hrt werden um daraus Glukose herzustellen. Mittels Transkriptom-Analysen konnten zentrale SnRK1-abh{\"a}ngige Gene in der Speicherstoffmobilisierung von TAG, beispielsweise PEROXISOMAL NAD-MALATE DEHYDROGENASE 2 (PMDH2) und ACYL-CoA-OXIDASE 4 (ACX4), und Aminos{\"a}uren identifiziert werden. Somit wurde ein Mechanismus der SnRK1-abh{\"a}ngigen Genregulation w{\"a}hrend der Samenkeimung in Arabidopsis gefunden. Bei der Degradation von Aminos{\"a}uren wird die cytosolische PYRUVATE ORTHOPHOSPHATE DIKINASE (cyPPDK), ein Schl{\"u}sselenzym beim Abbau bestimmter Aminos{\"a}uren und bei der Glukoneogenese, SnRK1-abh{\"a}ngig transkriptionell reguliert. Durch Koregulation konnte der Transkriptionsfaktor bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63) gefunden werden, dessen Transkription ebenfalls SnRK1-abh{\"a}ngig reguliert wird. Außerdem konnte die Transkription von cyPPDK in bzip63-Mutanten nur noch sehr schwach induziert werden. In Protoplasten konnte der cyPPDK-Promotor durch Aktivierungsexperimente mit bZIP63 und SnRK1α1 induziert werden. Durch Mutationskartierung und Chromatin-Immunopr{\"a}zipitation (ChIP)PCR konnte mehrfach eine direkte Bindung von bZIP63 an den cyPPDK-Promotor nachgewiesen werden. Zusammenfassend ergibt sich ein mechanistisches Arbeitsmodell, in dem bZIP63 durch SnRK1 phosphoryliert wird und durch Bindung an regulatorische G-Box cis-Elemente im cyPPDK- Promotor dessen Transkription anschaltet. Infolgedessen werden Aminos{\"a}uren abgebaut und wird {\"u}ber die Glukoneogenese Glukose aufgebaut. Dieser Mechanismus ist essentiell f{\"u}r die {\"U}bergangsphase zwischen heterotropher und autotropher Lebensweise, und tr{\"a}gt dazu bei, die im Samen vorhandenen Ressourcen dem Keimling zum idealen Zeitpunkt zug{\"a}nglich zu machen. Dar{\"u}ber hinaus werden Gene im Abbau von verzweigtkettigen Aminos{\"a}uren ebenfalls durch bZIP63 reguliert. Dabei wird dem Keimling Energie in Form von Adenosin-Triphosphat (ATP) zur Verf{\"u}gung gestellt. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Mobilisierung von Speicherstoffen auch w{\"a}hrend der Keimlingsentwicklung direkt von SnRK1 abh{\"a}ngig ist. Die umfangreichen Datens{\"a}tze der RNA-Seq-Analysen bieten zudem die M{\"o}glichkeit, weitere SnRK1-abh{\"a}ngige Gene der Speichermobilisierung zu identifizieren und somit einem besseren Verst{\"a}ndnis der Keimlingsentwicklung beizutragen. Aufgrund der zentralen Bedeutung der SnRK1-Kinase in diesem entscheidenden Entwicklungsschritt ist davon auszugehen, dass diese Erkenntnisse mittelfristig auch f{\"u}r bessere Keimungsraten und somit bessere Ertr{\"a}ge in der Landwirtschaft genutzt werden k{\"o}nnen.},
  subject      = {SnRK1},
  language  = {de}
}
@article{MayrRamirezZavalaKruegeretal.2020,
  author    = {Mayr, Eva-Maria and Ram{\´i}rez-Zavala, Bernardo and Kr{\"u}ger, Ines and Morschh{\"a}user, Joachim},
  title     = {A Zinc Cluster Transcription Factor Contributes to the Intrinsic Fluconazole Resistance of Candida auris},
  series = {mSphere},
  volume    = {5},
  journal   = {mSphere},
  number    = {2},
  doi       = {10.1128/mSphere.00279-20},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-229937},
  year      = {2020},
  abstract  = {ABSTRACT The recently emerged pathogenic yeast Candida auris is a major concern for human health, because it is easily transmissible, difficult to eradicate from hospitals, and highly drug resistant. Most C. auris isolates are resistant to the widely used antifungal drug fluconazole due to mutations in the target enzyme Erg11 and high activity of efflux pumps, such as Cdr1. In the well-studied, distantly related yeast Candida albicans, overexpression of drug efflux pumps also is a major mechanism of acquired fluconazole resistance and caused by gain-of-function mutations in the zinc cluster transcription factors Mrr1 and Tac1. In this study, we investigated a possible involvement of related transcription factors in efflux pump expression and fluconazole resistance of C. auris. The C. auris genome contains three genes encoding Mrr1 homologs and two genes encoding Tac1 homologs, and we generated deletion mutants lacking these genes in two fluconazole-resistant strains from clade III and clade IV. Deletion of TAC1b decreased the resistance to fluconazole and voriconazole in both strain backgrounds, demonstrating that the encoded transcription factor contributes to azole resistance in C. auris strains from different clades. CDR1 expression was not or only minimally affected in the mutants, indicating that Tac1b can confer increased azole resistance by a CDR1-independent mechanism. IMPORTANCE Candida auris is a recently emerged pathogenic yeast that within a few years after its initial description has spread all over the globe. C. auris is a major concern for human health, because it can cause life-threatening systemic infections, is easily transmissible, and is difficult to eradicate from hospital environments. Furthermore, C. auris is highly drug resistant, especially against the widely used antifungal drug fluconazole. Mutations in the drug target and high activity of efflux pumps are associated with azole resistance, but it is not known how drug resistance genes are regulated in C. auris. We have investigated the potential role of several candidate transcriptional regulators in the intrinsic fluconazole resistance of C. auris and identified a transcription factor that contributes to the high resistance to fluconazole and voriconazole of two C. auris strains from different genetic clades, thereby providing insight into the molecular basis of drug resistance of this medically important yeast."},
  language  = {en}
}
@article{TuChenLimetal.2012,
  author    = {Tu, Xiaolin and Chen, Jianquan and Lim, Joohyun and Karner, Courtney M. and Lee, Seung-Yon and Heisig, Julia and Wiese, Cornelia and Surendran, Kameswaran and Kopan, Raphael and Gessler, Manfred and Long, Fanxin},
  title     = {Physiological Notch Signaling Maintains Bone Homeostasis via RBPjk and Hey Upstream of NFATc1},
  series = {PLoS Genetics},
  volume    = {8},
  journal   = {PLoS Genetics},
  number    = {3},
  doi       = {10.1371/journal.pgen.1002577},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-133490},
  pages     = {e1002577},
  year      = {2012},
  abstract  = {Notch signaling between neighboring cells controls many cell fate decisions in metazoans both during embryogenesis and in postnatal life. Previously, we uncovered a critical role for physiological Notch signaling in suppressing osteoblast differentiation in vivo. However, the contribution of individual Notch receptors and the downstream signaling mechanism have not been elucidated. Here we report that removal of Notch2, but not Notch1, from the embryonic limb mesenchyme markedly increased trabecular bone mass in adolescent mice. Deletion of the transcription factor RBPjk, a mediator of all canonical Notch signaling, in the mesenchymal progenitors but not the more mature osteoblast-lineage cells, caused a dramatic high-bone-mass phenotype characterized by increased osteoblast numbers, diminished bone marrow mesenchymal progenitor pool, and rapid age-dependent bone loss. Moreover, mice deficient in Hey1 and HeyL, two target genes of Notch-RBPjk signaling, exhibited high bone mass. Interestingly, Hey1 bound to and suppressed the NFATc1 promoter, and RBPjk deletion increased NFATc1 expression in bone. Finally, pharmacological inhibition of NFAT alleviated the high-bone-mass phenotype caused by RBPjk deletion. Thus, Notch-RBPjk signaling functions in part through Hey1-mediated inhibition of NFATc1 to suppress osteoblastogenesis, contributing to bone homeostasis in vivo.},
  language  = {en}
}
@article{SzaboPapinZornetal.2013,
  author    = {Szab{\´o}, {\´A}ron and Papin, Christian and Zorn, Daniela and Ponien, Prishila and Weber, Frank and Raabe, Thomas and Rouyer, Fran{\c{c}}ois},
  title     = {The CK2 Kinase Stabilizes CLOCK and Represses Its Activity in the Drosophila Circadian Oscillator},
  series = {PLoS Biology},
  volume    = {11},
  journal   = {PLoS Biology},
  number    = {8},
  issn      = {1545-7885},
  doi       = {10.1371/journal.pbio.1001645},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127234},
  pages     = {e1001645},
  year      = {2013},
  abstract  = {Phosphorylation is a pivotal regulatory mechanism for protein stability and activity in circadian clocks regardless of their evolutionary origin. It determines the speed and strength of molecular oscillations by acting on transcriptional activators and their repressors, which form negative feedback loops. In Drosophila, the CK2 kinase phosphorylates and destabilizes the PERIOD (PER) and TIMELESS (TIM) proteins, which inhibit CLOCK (CLK) transcriptional activity. Here we show that CK2 also targets the CLK activator directly. Downregulating the activity of the catalytic alpha subunit of CK2 induces CLK degradation, even in the absence of PER and TIM. Unexpectedly, the regulatory beta subunit of the CK2 holoenzyme is not required for the regulation of CLK stability. In addition, downregulation of \(CK2\alpha\) activity decreases CLK phosphorylation and increases per and tim transcription. These results indicate that CK2 inhibits CLK degradation while reducing its activity. Since the CK1 kinase promotes CLK degradation, we suggest that CLK stability and transcriptional activity result from counteracting effects of CK1 and CK2.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wehner2012,
  author    = {Wehner, Nora},
  title     = {Etablierung und Anwendung molekularer Methoden zur Analyse des Arabidopsis thaliana Transkriptionsfaktor-ORFeoms},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72057},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Transkriptionsfaktoren (TF) sind wichtige Regulatoren der Genexpression. In Arabidopsis kodieren ca. 1500-2000 Gene f{\"u}r TF, von denen die Mehrheit bis heute nicht funktionell charakterisiert ist. Um die Aufkl{\"a}rung der TF-Funktionen weiter voranzutreiben, werden daher Analyse-Plattformen f{\"u}r Hochdurchsatzverfahren immer wichtiger. In den letzten Jahren sind umfangreiche Gateway® -kompatible ORF (open-reading-frame)-Kollektionen f{\"u}r Arabidopsis aufgebaut worden, die nun als n{\"u}tzliche Ressourcen f{\"u}r genetische Analysen zur Verf{\"u}gung stehen. Auf Grundlage dieser Kollektionen wurde in dieser Arbeit eine neue Screening-Plattform etabliert, mit der trans-regulatorische Eigenschaften von TF in einem Hochdurchsatzverfahren untersucht werden k{\"o}nnen. Ein Mikrotiterplatten-System f{\"u}r Protoplastentransformationen erlaubt die transiente Koexpression von 96 verschiedenen TF-Expressionsvektoren mit einem Promotor:Luciferase-Reporter der Wahl. Das Transaktivierungspotential jedes einzelnen TF kann {\"u}ber die Luciferaseaktivit{\"a}t bestimmt werden, indem emittierte Lumineszenz in einem Luminometer detektiert wird. Die Funktionalit{\"a}t des PTA (Protoplast Trans Activation)-Systems wurde anhand einer Transaktivierungsstudie der bereits gut charakterisierten Promotoren von RD29A und PDF1.2 und der ERF (Ethylene Response Factor)-TF-Familie {\"u}berpr{\"u}ft, wobei bekannte Bindungsspezifit{\"a}ten der TF best{\"a}tigt werden konnten. F{\"u}r das System wurde eine umfassende Arabidopsis TF-Kollektion aufgebaut. Ca. 950 verschiedene Gateway® -kompatible TF-Expressionsvektoren stehen f{\"u}r Screening-Ans{\"a}tze zur Verf{\"u}gung. F{\"u}r das PTA-System wurden verschiedene Anwendungen etabliert. Neben transaktivierenden, konnten beispielsweise auch repressive Eigenschaften von TF bestimmt werden. Dar{\"u}ber hinaus wurde gezeigt, dass es m{\"o}glich ist, (I) die Expression von Promotoren gezielt durch verschiedene Stimuli, wie Salz oder Pflanzenhormone zu modulieren, (II) Protein-Protein-Interaktionen zu bestimmen, sowie (III) den Einfluss von Signalmolek{\"u}len (wie z. B. Kinasen) auf ihre Aktivierungseigenschaften zu untersuchen. Das PTA-System wurde in verschiedenen Screening-Ans{\"a}tzen zur Identifizierung transkriptioneller Regulatoren pflanzlicher Stressantworten eingesetzt. In einer Analyse des Auxin-induzierbaren GH3.3-Promotors wurde dabei gezeigt, dass weit mehr bZIP-TF Einfluss auf die Auxin-vermittelte GH3.3-Expression haben, als bisher angenommen. Beispielsweise zeigten bZIP16 und bZIP68 ein h{\"o}heres Transaktivierungspotential, als die bisher beschriebenen bZIP-Regulatoren der GH3.3-Expression. In einem zweiten Ansatz wurde die koordinierte Regulation der Biosynthese von Tryptophan-abgeleiteten antimikrobiellen Sekund{\"a}rmetaboliten (Indol-Glukosinolate, Camalexin) untersucht. Dabei konnten ERF-TF der phylogenetischen Gruppen VIII und IX als potentielle Regulatoren mehrerer wichtiger Gene der Biosynthesewege identifiziert werden. Mit einem zus{\"a}tzlichen Screening-Ansatz der gesamten TF-Expressionsvektor-Kollektion und einem Markerpromotor des Camalexin-Biosynthesewegs wurden weitere potentielle Regulatoren identifiziert, von denen einige bereits in der Pathogenantwort beschrieben sind. In einem weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit wurde die von Weiste et al. (2007) etablierte Arabidopsis thaliana TF-ORF-{\"U}berexpressions-Kollektion (AtTORF-EX) erweitert. Mit Hilfe des daf{\"u}r entwickelten Hochdurchsatzverfahrens zur Generierung stabil transformierter Pflanzenlinien wurden neue {\"U}berexpressionssamen-Kollektionen hergestellt und anschließend in einem Screening-Ansatz auf erh{\"o}hte Toleranz gegen{\"u}ber oxidativem Stress getestet, wobei die Chemikalie Paraquat als oxidativer Stress-Geber eingesetzt wurde. Die TF bZIP1 und OBP1 konnten dabei als Resistenz-vermittelnd identifiziert werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mit Hilfe beider Systeme neue potentielle Regulatoren pflanzlicher Stressantworten identifiziert.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Dabas2008,
  author    = {Dabas, Neelam},
  title     = {Control of Nitrogen Regulated Virulence Traits of the Human Fungal Pathogen Candida albicans},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29769},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Der Hefepilz Candida albicans ist ein harmloser Kommensale auf den Schleimh{\"a}uten des Gastrointestinal- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Bei einer St{\"o}rung der nat{\"u}rlichen Mikroflora oder des Wirtsimmunsystems kann der Pilz jedoch auch oberfl{\"a}chliche und sogar systemische Infektionen verursachen. C. albicans weist eine Reihe von Eigenschaften auf, die zur Virulenz des Erregers beitragen. Dazu geh{\"o}ren die Adh{\"a}renz an unterschiedliche Wirtsoberfl{\"a}chen, die morphologische Variabilit{\"a}t des Pilzes und die Sekretion von Aspartatproteasen. Die Expression vieler dieser Virulenzfaktoren wird unter anderem durch die Verf{\"u}gbarkeit von Stickstoff reguliert. Unter Stickstoffmangelbedingungen wechselt C. albicans vom Wachstum als sprossende Hefe zum filament{\"o}sen Wachstum, und dieser Wechsel wird durch die Ammoniumpermease Mep2p reguliert. Wie die Induktion des filament{\"o}sen Wachstums durch Mep2p kontrolliert wird, ist jedoch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsanalyse von Mep2p durchgef{\"u}hrt, um Aminos{\"a}uren zu identifizieren, die an der Signalfunktion dieser Permease beteiligt sind. Die C-terminale cytoplasmatische Dom{\"a}ne von Mep2p wird f{\"u}r den Ammoniumtransport nicht ben{\"o}tigt, ist jedoch essentiell f{\"u}r die Signaltransduktion. Progressive C-terminale Verk{\"u}rzungen von Mep2p zeigten, dass ein MEP2DC433-Allel immer noch in der Lage war, das filament{\"o}se Wachstum zu induzieren, wohingegen die Deletion einer weiteren Aminos{\"a}ure die Morphogenese blockierte. Das Tyrosin an Position 433 (Y433) ist deshalb die letzte Aminos{\"a}ure, die f{\"u}r die Signalfunktion von Mep2p essentiell ist. Um besser zu verstehen, wie die Signalaktivit{\"a}t von Mep2p durch die Verf{\"u}gbarkeit und den Transport von Ammonium reguliert wird, wurden verschiedene hochkonservierte Aminos{\"a}uren mutiert, die vermutlich an der Bindung oder dem Transport von Ammonium in die Zelle beteiligt sind. Die Mutation von D180, von dem postuliert wurde, dass es den initialen Kontakt mit extrazellul{\"a}rem Ammonium erm{\"o}glicht, oder der im Transportkanal lokalisierten Histidine H188 und H342 hatte zur Folge, dass Mep2p nicht mehr exprimiert wurde, so dass diese Aminos{\"a}uren vermutlich f{\"u}r die Proteinstabilit{\"a}t wichtig sind. Die Mutation von F239, das zusammen mit F126 eine extracytosolische Pforte zur Transportpore bildet, verhinderte trotz korrekter Membranlokalisation sowohl den Ammoniumtransport als auch das filament{\"o}se Wachstum. Allerdings f{\"u}hrte auch die Mutation von W167, das vermutlich zusammen mit Y122, F126 und S243 an der Rekrutierung des Ammoniumions an der extrazellul{\"a}ren Seite der Membran beteiligt ist, zur Blockierung des filament{\"o}sen Wachstums, obwohl der Ammoniumtransport kaum beeinflusst war. Dies zeigte, dass die intrazellu{\"a}re Signaltransduktion durch extrazellul{\"a}re Ver{\"a}nderungen in Mep2p beeinflusst werden kann. Die Mutation von Y122 reduzierte die Ammoniumaufnahme weitaus starker als die Mutation von W167, erlaubte jedoch immer noch ein effizientes filament{\"o}ses Wachstum. Die Signalaktivit{\"a}t von Mep2p ist deshalb offensichtlich nicht direkt mit der Transportaktivit{\"a}t des Proteins korreliert. Ein wichtiger Aspekt in der F{\"a}higkeit von Mep2p, die Morphogenese zu stimulieren, ist die vergleichsweise starke Expression des Proteins. Um die Regulation der MEP2-Expression aufzukl{\"a}ren, wurden die cis-regulatorischen Sequenzen und die trans-aktivierenden Faktoren, die die MEP2-Induktion unter Stickstoffmangel vermitteln, identifiziert. Eine Promotoranalyse zeigte, dass zwei mutmaßliche Bindungsstellen f{\"u}r GATA-Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle in der MEP2-Expression haben, da die Deletion oder Mutation dieser GATAA-Sequenzen die Expression von MEP2 stark reduzierte. Um die Rolle der GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p bei der Regulation der MEP2-Expression zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die entsprechenden Gene deletiert waren. Die Expression von Mep2p war in gln3D und gat1D Einzelmutanten stark verringert und in gln3D gat1D Doppelmutanten nicht mehr nachweisbar. Die Deletion von GLN3 hatte auch eine starke Reduktion des filament{\"o}sen Wachstums zur Folge, die durch die konstitutive Expression von MEP2 unter Kontrolle des ADH1-Promotors aufgehoben wurde. Dagegen hatte die Deletion von GAT1 keinen Einfluss auf das filament{\"o}se Wachstum. {\"U}berraschenderweise war das filament{\"o}se Wachstum in den gat1D Mutanten teilweise unabh{\"a}ngig von Mep2p, was darauf hinwies, dass in Abwesenheit von GAT1 andere Signalwege aktiviert werden, die die Morphogenese stimulieren. Diese Ergebnisse zeigten, dass die GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p die Expression der Ammoniumpermease MEP2 kontrollieren und dass Gln3p auch ein wichtiger Regulator des durch Stickstoffmangel induzierten filament{\"o}sen Wachstums von C. albicans ist. Mutanten, in denen die beiden GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p fehlten, waren nicht mehr in der Lage, in einem Medium zu wachsen, das bovines Serumalbumin (BSA) als einzige Stickstoffquelle enth{\"a}lt. Die F{\"a}higkeit von C. albicans, Proteine als einzige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden, wird durch die sekretierte Aspartatprotease Sap2p, die die Proteine zu Peptiden abbaut, und durch Oligopeptidtransporter, die diese Peptide in die Zelle aufnehmen, vermittelt. Der Wachstumsdefekt der gln3D gat1D Doppelmutanten war haupts{\"a}chlich durch einen Defekt in der SAP2-Expression verursacht, da die Expression von SAP2 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors die F{\"a}higkeit zum Wachstum auf BSA wieder herstellte. Es zeigte sich, dass Gln3p und Gat1p die Expression des Transkriptionsfaktors STP1, der f{\"u}r die Induktion von SAP2 in Gegenwart von Proteinen notwendig ist, regulieren. Bei einer Expression von STP1 unter Kontrolle des induzierbaren Tet-Promotors waren Gln3p und Gat1p nicht mehr notwendig f{\"u}r das Wachstum auf Proteinen. Wenn bevorzugte Stickstoffquellen verf{\"u}gbar sind, wird SAP2 auch in Gegenwart von Proteinen reprimiert, und diese Stickstoff-Katabolitrepression korrelierte mit einer reduzierten STP1-Expression. Die Expression von STP1 unter Kontrolle des Tet-Promotors hob diese Repression auf, was zeigte, dass die Regulation der STP1-Expression durch die GATA-Transkriptionsfaktoren eine Schl{\"u}sselrolle sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Kontrolle der SAP2-Expression spielt. Eine regulatorische Kaskade, in der die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors Stp1p durch die allgemeinen Regulatoren Gln3p und Gat1p kontrolliert wird, stellt die Expression von SAP2 in C. albicans deshalb unter Stickstoffkontrolle und gew{\"a}hrleistet eine angepasste Expression dieses Virulenzfaktors. Die Ergebnisse dieser Arbeit illustrieren, dass die GATA-Faktoren Gln3p und Gat1p zum Teil {\"u}berlappende aber auch spezifische Funktionen in der Anpassung von C. albicans an die Verf{\"u}gbarkeit verschiedener Stickstoffquellen haben. Diese Anpassungsmechanismen spielen auch eine Rolle in der Pathogenit{\"a}t des Pilzes, wobei die relative Bedeutung von Gln3p und Gat1p vom Zielgen und der Stickstoffquelle abh{\"a}ngt. Diese Erkenntnisse geben einen vertieften Eiblick in die molekularen Grundlagen der Anpassung von C. albicans an unterschiedliche Umweltbedingungen.},
  subject      = {Transkriptionsfaktor},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kraft2008,
  author    = {Kraft, Peter},
  title     = {Einfluß des Tumormikromilieus auf die Akkumulation des Hypoxia-inducible Factor-1 alpha (HIF-1 alpha) in humanen Tumorzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27135},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die Transduktionsfaktoruntereinheit HIF-1alpha ist der zentrale Sauerstoffsensor f{\"u}r S{\"a}ugerzellen aller Art. Er ist in der Lage durch Steuerung der Transkription entsprechender Gene auf die Zellproliferation, verschiedene Transportvorg{\"a}nge, die Angiogenese, die Glykolyse und andere Vorg{\"a}nge Einfluß zu nehmen. Zahlreiche Studien belegen den Zusammenhang zwischen HIF-1alpha-{\"U}berexpression in soliden Tumoren und Verk{\"u}rzung der {\"U}berlebens- bzw. der rezidivfreien Zeit. Schon lange ist die Assoziation von Tumorhypoxie mit der Verschlechterung der Prognose der Erkrankung bekannt. Die Trennung der hypoxischen Srahlenresistenz von der pro-proliferativen und pro-metastatischen Potenz von HIF-1alpha als Ursache der Prognoseverschlechterung von tumorkranken Patienten ist derzeit nicht m{\"o}glich. Die vorliegende Arbeit zeigt anhand zweier etablierter humaner Tumorzellinien, daß Faktoren des Tumormikromilieus in der Lage sein k{\"o}nnen, die HIF-1alpha-Expression zu modulieren. Hypoxie war stets eine Grundvoraussetzung f{\"u}r die Messung erh{\"o}hter HIF-1alpha-Spiegel. Jedoch waren ann{\"a}hernd normale Glukosespiegel des Tumormikromilieus f{\"u}r eine nennenswerte HIF-1alpha-{\"U}berexpression erforderlich. Dies k{\"o}nnte erkl{\"a}ren, warum immunhistochemische Schnitte von HIF-1alpha und von exogenen Hypoxiemarkern bez{\"u}glich der angef{\"a}rbten Areale differieren. Sowohl die mangelnde Spezifit{\"a}t der HIF-1alpha-Expression f{\"u}r Hypoxie, als auch die f{\"u}r klinische Routinearbeiten ung{\"u}nstige Kinetik des endogenen Hypoxiemarkers HIF-1alpha, lassen an seiner praktischen Einf{\"u}hrung in der Klinik zweifeln. Da noch kein endogener Hypoxiemarker gefunden werden konnte, der spezifisch bei Hypoxie akkumulieren w{\"u}rde, und dar{\"u}ber hinaus alle bekannten endogenen Hypoxiemarker bei Sauerstoffmangel unterschiedlich reagieren, scheint es derzeit am sinnvollsten zu sein, neben der Kombination von verschiedenen Markern außerdem andere Faktoren, wie die Vaskularisierungsdichte zu bestimmen. Die Tatsache, daß nicht alle hypoxischen Zellen HIF-1alpha exprimieren, und die, daß aufgrund der nicht-hypoxischen Aktivierung von HIF-1alpha unter Umst{\"a}nden auch nicht hypoxische Zellen gesteigerte HIF-1alpha-Spiegel aufweisen, k{\"o}nnte ein therapeutisches Eingreifen auf Ebene von HIF-1alpha - als vermeintlich tumorspezifische Therapieform - in Frage stellen. Die Ergebnisse zahlreicher Studien zeigen deutlich, daß HIF-1alpha weder hypoxiespezifisch noch tumorspezifisch in der Zelle akkumuliert. Die Zukunft wird zeigen, ob es eine neue Substanzklasse der „HIF-1-Inhibitoren" geben wird. Derzeit laufen mehrere klinische Studien zur Evaluierung denkbarer Substanzen.},
  subject      = {Hypoxie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Porsch2002,
  author    = {Porsch, Matthias},
  title     = {OMB and ORG-1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3614},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Members of the T-box gene family encode transcription factors that play key roles during embryonic development and organogenesis of invertebrates and vertebrates. The defining feature of T-box proteins is an about 200 aa large, conserved DNA binding motif, the T domain. Their importance for proper development is highlighted by the dramatic phenotypes of T-box mutant animals. My thesis was mainly focused on two Drosophila T-box genes, optomotor-blind (omb) and optomotor-blind related 1 (org-1), and included (i) a genetic analysis of org-1 and (ii) the identification of molecular determinants within OMB and ORG-1 that confer functional specificity. (i) Genetic analysis of org-1 initially based on a behavioral Drosophila mutant, C31. C31 is a X-linked, recessive mutant and was mapped to 7E-F, the cytological region of org-1. This pleiotropic mutant is manifested in walking defects, structural aberrations in the central brain, and "held-out" wings. Molecular analysis revealed that C31 contains an insertion of a 5' truncated I retrotransposon within the 3' untranslated transcript of org-1, suggesting that C31 might represent the first org-1 mutant. Based on this hypothesis, we screened 44.500 F1 female offspring of EMS mutagenized males and C31 females for the "held-out" phenotype, but failed to isolate any C31 or org-1 mutant, although this mutagenesis was functional per se. Since we could not exclude the possibility that our failure is due to an idiosyncracy of C31, we intended not to rely on C31 in further genetic experiments and followed a reverse genetic strategy . All P element lines cytologically mapping to 7E-7F were characterized for their precise insertion sites. 13 of the 19 analyzed lines had P element insertions within a hot-spot 37 kb downstream of org-1. No P element insertions within org-1 could be identified, but several P element insertions were determined on either side of org-1. The org-1 nearest insertions were used for local-hop experiments, in which we associated 6 new genes with P insertions, but failed to target org-1. The closest P elements are still 10 kb away from org-1. Subsequently, we employed org-1 flanking P elements to induce precise deletions in 7E-F spanning org-1. Two org-1 flanking P elements were brought together on a recombinant chromosome. Remobilization of P elements in cis configuration frequently results in deletions with the P element insertion sites as deficiency endpoints. In a first attempt, we expected to identify deficiencies by screening for C31 alleles. 8 new C31 alleles could be isolated. The new C31 chromosomes, however, did not carry the desired deletion. Molecular analysis indicated that C31 is not caused by aberrations in org-1, but by mutations in a distal locus. We repeated the P element remobilization and screened for the absence of P element markers. 4 lethal chromosomes could be isolated with a deletion of the org-1 locus. (ii) The consequences of ectopic org-1 were analyzed using UAS-org-1 transgenic flies and a number of different Gal4 driver lines. Misexpression of org-1 during imaginal development interfered with the normal development of many organs and resulted in flies with a plethora of phenotypes. These include a homeotic transformation of distal antenna (flagellum) into distal leg structures, a strong size reduction of the legs along their proximo-distal axis, and stunted wings. Like ectopic org-1, ectopic omb leads to dramatic changes of normal developmental pathways in Drosophila as well. dpp-Gal4/ UAS-omb flies are late pupal lethal and show an ectopic pair of wings and largely reduced eyes. GMR-Gal4 driven ectopic omb expression in the developing eye causes a degeneration of the photoreceptor cells, while GMR-Gal4/ UAS-org-1 flies have intact eyes. Hence, ectopic org-1 and omb induce profound phenotypes that are qualitatively different for these homologous genes. To begin to address the question where within OMB and ORG-1 the specificity determinants reside, we conceptionally subdivided both proteins into three domains and tested the relevance ofthese domains for functional specificity in vivo. The single domains were cloned and used as modules to assemble all possible omb-org-1 chimeric trans- genes. A method was developed to determine the relative expression strength of different UAS-transgenes, allowing to compare the various transgenic constructs for qualitative differences only, excluding different transgene quantities. Analysis of chimeric omb-org-1 transgenes with the GMR-Gal4 driver revealed that all three OMB domains contribute to functional specificity.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {en}
}