@phdthesis{Hartmann2014,
  author    = {Hartmann, Michael},
  title     = {Charakterisierung inaktivierender posttranslationaler Modifikationen des GC-A-Rezeptors f{\"u}r das atriale natriuretische Peptid (ANP)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-97959},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Das atriale natriuretische Peptid (ANP) wird infolge einer Zunahme des atrialen Drucks aus den Myozyten des Atriums sezerniert. Es spielt lokal eine bedeutende, protektive Rolle und wirkt der Entstehung von Herzhypertrophie und Fibrose entgegen. Dar{\"u}ber hinaus kommt ANP vor allem eine wichtige Rolle als endokrines Hormon zu, das den arteriellen Blutdruck und das Blutvolumen regelt. Diese physiologischen Effekte vermittelt das Herzhormon durch seinen Rezeptor, das Transmembranprotein Guanylatzyklase A (GC-A). Durch Bindung von ANP an die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne der GC-A wird intrazellul{\"a}r, durch die katalytische Dom{\"a}ne des Rezeptors, der sekund{\"a}re Botenstoff cGMP gebildet. Patienten mit einer, durch Bluthochdruck verursachten Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz weisen erh{\"o}hte ANP-Konzentrationen im Plasma auf. Die durch ANP vermittelten, protektiven Effekte sind allerdings vermindert. Zahlreiche Studien haben in vitro gezeigt, dass die chronische Inkubation der GC-A mit ihrem Liganden, sowie die Behandlung von GC-A exprimierenden Zellen mit Hormonen wie Angiotensin II, zur Desensitisierung des Rezeptors f{\"u}hren. Der Verlust der Funktionsf{\"a}higkeit geht einher mit der Dephosphorylierung des Rezeptors an spezifischen, intrazellul{\"a}r lokalisierten Aminos{\"a}uren. Durch die Erforschung dieses Mechanismus und Identifizierung m{\"o}glicher Interaktionspartner in vivo k{\"o}nnte der Grundstein f{\"u}r neue oder verbesserte Therapieformen gelegt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine k{\"u}rzlich identifizierte Isoform des GC-A-Rezeptors identifiziert, die durch alternatives Spleißen des Exons 4 entsteht und in einer Vielzahl untersuchter Gewebe der Maus vorkommt. Die Deletion umfasst 51 Basenpaare und resultiert in einem um 17 Aminos{\"a}uren verk{\"u}rzten GC-A-Rezeptor (GC-AΔLys314-Gln330). Molekulare Modellierungen der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen des wildtypischen GC-A-Rezeptors und der Isoform zeigten, dass sich die Deletion im membrannahen Bereich der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne und damit deutlich entfernt von der ANP-Bindungsdom{\"a}ne befindet. Oberfl{\"a}chenbiotinylierungs- und Zellfraktionierungsversuche zeigten, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors an der Oberfl{\"a}che von Zellmembranen transient transfizierter HEK 293-Zellen pr{\"a}sentiert wird. Jedoch zeigten die ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-Radioimmunassay (cGMP-RIA) und F{\"o}rster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen, dass die Isoform nicht zur ANP-vermittelten intrazellul{\"a}ren cGMP-Bildung stimuliert werden kann. Im Rahmen von ANP-Bindungsstudien mit 125I-ANP wurde gezeigt, dass GC-AΔLys314-Gln330 die F{\"a}higkeit zur Bindung des Liganden ANP verloren hat. Jedoch zeigten die Koimmunpr{\"a}zipitationsversuche, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors Heterodimere mit dem wildtypischen GC-A-Rezeptor bilden und dadurch die ligandeninduzierte Bildung von cGMP reduzieren kann. In vivo konnte gezeigt werden, dass unter Angiotensin II-induzierter Hypertonie die mRNA-Expression f{\"u}r GC-AΔLys314-Gln330 in der Lunge gesteigert, und gleichzeitig die ANP-vermittelte cGMP-Bildung deutlich reduziert ist. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das alternative Spleißen ein regulierender Mechanismus ist, der auf den ANP/GC-A-Signalweg Einfluss nimmt. Angiotensin II-induziertes alternatives Spleißen des GC-A-Gens kann daher einen neuen Mechanismus f{\"u}r die Verringerung der Sensitivit{\"a}t des GC-A-Rezeptors gegen{\"u}ber ANP darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden transgene Tiere mit kardiomyozytenspezifischer {\"U}berexpression eines Epitop-getaggten GC-A-Rezeptors generiert. Durch dieses Modell sollte es erm{\"o}glicht werden, den Rezeptor aus murinem Gewebe anreichern und aufreinigen zu k{\"o}nnen um danach Analysen zu posttranslationalen Ver{\"a}nderungen und m{\"o}glichen Interaktionspartnern durchzuf{\"u}hren. Zun{\"a}chst wurde in eine FLAG-Epitop-getaggte GC-A zus{\"a}tzlich ein HA-tag, sowie eine Erkennungssequenz f{\"u}r die Protease des tobacco etch virus (TEV) eingef{\"u}gt. Die Expression und Funktionsf{\"a}higkeit des modifizierten Rezeptors wurde durch ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-RIA und FRET-Messungen verifiziert. Die Funktionsf{\"a}higkeit der TEV-Erkennungssequenz wurde durch die Elution mittels TEV-Protease nach Immunpr{\"a}zipitation (IP) nachgewiesen. In vivo wurde an M{\"a}usen die Expression und Lokalisation der GC-A auf Proteinebene, unter Anwendung von Zellfraktionierungsexperimenten und Immunpr{\"a}zipitationen, {\"u}berpr{\"u}ft. Die entstandenen transgenen Tiere zeigten eine deutliche, in den Zellmembranen von Kardiomyozyten lokalisierte, {\"U}berexpression des Rezeptors. Dieser konnte {\"u}ber das HA-tag angereichert und aufgereinigt werden. Um die Funktionsf{\"a}higkeit des modifizierten Rezeptors in vivo nachzuweisen, wurde in zwei Versuchsreihen kardiale Hypertrophie durch chronische Applikation von Angiotensin II induziert. Es wurde postuliert, dass die {\"U}berexpression funktionsf{\"a}higer GC-A im Herzen die Tiere vor Herzhypertrophie sch{\"u}tzt. Die Ergebnisse der Studien zeigen allerdings, dass die generierten transgene Tiere trotz kardiomyozytenspezifischer {\"U}berexpression des Rezeptors nicht den erwarteten Schutz vor Herzhypertrophie aufwiesen, sondern {\"a}hnlich wie ihre wildtypischen Geschwistertiere reagieren. Jedoch gelang es mit Hilfe des {\"U}berexpressionsmodells zusammen mit anderen Mitarbeitern der AG Kuhn eine zuvor in vitro beschriebene Interaktion des GC-A-Rezeptors mit den Kationenkan{\"a}len TRPC3 und TRPC6 in vivo nachzuweisen. Somit besteht die M{\"o}glichkeit die Epitope und das murine {\"U}berexpressionsmodell auch zuk{\"u}nftig zu nutzen, um Interaktionspartner der GC-A zu identifizieren.},
  subject      = {Guanylatzyklase},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schmid2008,
  author    = {Schmid, Ursula},
  title     = {Protection against oxidative DNA damage by antioxidants, hormone-receptor blockers and HMG-CoA-reductase inhibitors},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28379},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {In the course of this study, several endogenous compounds and model substances were used to mimic the conditions in patients suffering from hypertension. As endogenous compounds, angiotensin II and aldosterone were chosen. As model substances, 4-nitroquinoline-1-oxide (NQO), hydrogen peroxide and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were selected. Benfotiamine as well as \&\#945;-tocopherol proved in the course of the experiments to be able to prevent angiotensin II-induced formation of oxidative DNA strand breaks and micronuclei. This could be due to a prior inhibition of the release of reactive oxygen species and is in contrast to results which were achieved using thiamine. Furthermore, experiments in which cells were pre-incubated with benfotiamine followed by incubation with NQO showed that benfotiamine was not able to prevent the induction of oxidative stress. The hypothesis that benfotiamine has, like \&\#945;-tocopherol, direct antioxidative capacity was fortified by measurements in cell free systems. In brief, a new working mechanism for benfotiamine in addition to the ones already known could be provided. In the second part of the study, angiotensin II was shown to be dose-dependently genotoxic. This effect is mediated via the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) which. Further experiments were extended from in vitro settings to the isolated perfused kidney. Here it could be shown that angiotensin II caused vasoconstriction and DNA strand breaks. Co-perfusion of kidneys with angiotensin II and candesartan prevented vasoconstriction and formation of strand breaks. DNA strand break formation due to mechanical stress or hypoxia could be ruled out after additional experiments with the thromboxane mimetic U 46619. Detailed investigation of the DNA damage in vitro revealed that angiotensin II induces single strand breaks, double strand breaks and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG)-adducts as well as abasic sites. Investigations of the effects of aldosterone-treatment in kidney cells showed an increase of oxidative stress, DNA strand breaks and micronuclei which could be prevented by the steroidal mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Additional experiments with the non-steroidal mineralocorticoid receptor antagonist (S)-BR-4628 revealed that this substance was also able to prevent oxidative stress and genomic damage and proved to be more potent than eplerenone. In vivo, hyperaldosteronism was imitated in rats by aid of the deoxycorticosteroneacetate (DOCA) salt model. After this treatment, levels of DNA strand breaks and chromosomal aberrations in the kidney could be observed. Furthermore, an increase in the release of ROS could be measured. Treatment of these animals with spironolactone , BR-4628 and enalaprile revealed that all antagonists were effective BR-4628 was the most potent drug. Finally, rosuvastatin was investigated. In HL-60 cells phorbol 12-myristate 13-acetate caused oxidative stress. Rosuvastatin was able to prevent the release of ROS and subsequent oxidative DNA damage when co-incubated with PMA. Furthermore, not only an inhibition of PMA-induced oxidative stress but also inhibition of the unspecific release of ROS induced by hydrogen peroxide was observable. Addition of farnesyl pyrophosphate (FPP), geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), and mevalonate, intermediates of the cholesterol pathway, caused only a marginal increase of oxidative stress in cells treated simultaneously with PMA and rosuvastatin, thus indicating the effect of rosuvastatin to be HMG-CoA-reductase-independent. Investigation of the gene expression of subunits of NAD(P)H oxidase revealed a down-regulation of p67phox following rosuvastatin-treatment. Furthermore, it could be shown that rosuvastatin treatment alone or in combination with PMA increased total glutathione levels probably due to an induction of the gene expression and enzyme activity of \&\#947;-glutamylcysteine synthetase (\&\#947;-GCS).},
  subject      = {Oxidativer Stress},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Zimnol2017,
  author    = {Zimnol, Anna},
  title     = {Relevance of angiotensin II type 1a receptor and NADPH oxidase for the formation of angiotensin II-mediated DNA damage},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-137469},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck sowie den Elektrolyt- und Wasserhaushalt. Das aktive Peptid, Angiotensin II (AngII), f{\"u}hrt dabei zur Vasokonstriktion und in h{\"o}heren Konzentrationen zu Bluthochdruck. Hypertensive Patienten haben ein erh{\"o}htes Risiko an Krebs zu erkranken, vor allem an Nierenkrebs. Wir konnten bereits in vivo zeigen, dass AngII in der Lage ist, den Blutdruck zu steigern und dosisabh{\"a}ngig zu DNA-Sch{\"a}den {\"u}ber den Angiotensin II Typ 1-Rezeptor (AT1R) f{\"u}hrt. Ein stimuliertes RAAS kann ferner {\"u}ber die Aktivierung der NADPH-Oxidase, einer Hauptquelle der Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, zu oxidativem Stress f{\"u}hren. Zielsetzung dieser Arbeit war es zum einen, mit Hilfe von AT1a-Rezeptor-defizienten M{\"a}usen in vivo zu pr{\"u}fen, ob die Bildung von ROS, sowie die Bildung von DNA-Sch{\"a}den in der Niere und im Herzen unabh{\"a}ngig von einem erh{\"o}hten Blutdruck auftreten. Zum anderen sollte, ebenfalls in vivo, untersucht werden, ob eine oder beide von zwei untersuchten Isoformen der NADPH-Oxidase (Nox) f{\"u}r die Ausl{\"o}sung oxidativen Stresses in der Niere verantwortlich ist. Zun{\"a}chst wurden f{\"u}r den Versuch zur {\"U}berpr{\"u}fung der Abh{\"a}ngigkeit AngII-induzierter DNA-Sch{\"a}den vom Blutdruck m{\"a}nnliche C57BL/6-M{\"a}use und AT1a-Knockout (KO)-M{\"a}use mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentrationen von 600 ng/kg min {\"u}ber einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Zus{\"a}tzlich wurde eine Gruppe von AngII-behandelten Wildtyp (WT)-M{\"a}usen mit dem AT1-Rezeptor-Blocker Candesartan (Cand) behandelt. W{\"a}hrend des Versuchszeitraumes fanden regelm{\"a}ßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an den wachen M{\"a}usen statt. In WT-M{\"a}usen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erh{\"o}hte Albumin-Level im Urin und f{\"u}hrte zur Bildung von ROS in Niere und im Herzen. Außerdem traten in dieser Gruppe DNA-Sch{\"a}den in Form von Einzel- und Doppelstrangbr{\"u}chen auf. All diese Reaktionen auf AngII konnten jedoch durch gleichzeitige Behandlung mit Cand verhindert werden. AT1a-KO-M{\"a}use hatten, verglichen mit WT-Kontrollm{\"a}usen, einen signifikant niedrigeren Blutdruck und normale Albumin-Level im Urin. In AT1a-KO-M{\"a}usen, die mit AngII behandelt wurden, konnte kein Anstieg des systolischen Blutdrucks sowie kein Einfluss auf die Nierenfunktion gefunden werden. Jedoch f{\"u}hrte AngII in dieser Gruppe zu einer Steigerung von ROS in der Niere und im Herzen. Zus{\"a}tzlich wurden genomische Sch{\"a}den, vor allem in Form von Doppelstrangbr{\"u}chen signifikant in dieser Gruppe induziert. Auch wenn AT1a-KO-Tiere, unabh{\"a}ngig von einer AngII-Infusion, keine eingeschr{\"a}nkte Nierenfunktion zeigten, so wiesen sie erhebliche histopathologische Sch{\"a}den im Hinblick auf die Glomeruli und das Tubulussystem auf. Diese Art von Sch{\"a}den deuten auf eine besondere Bedeutung des AT1aR im Hinblick auf die embryonale Entwicklung der Niere hin. Zusammenfassend beweisen die Ergebnisse dieses Experiments eindeutig, dass eine AngII-induzierte ROS-Produktion und die Induktion von DNA-Sch{\"a}den unabh{\"a}ngig von einem erh{\"o}hten Blutdruck auftreten. Da in der AngII-behandelten AT1a-KO-Gruppe eine signifikant h{\"o}here Expression des AT1b-Rezeptors zu finden war und die Blockade von beiden Rezeptorsubtypen mit Cand zu einer Verhinderung der sch{\"a}dlichen Effekte durch AngII f{\"u}hrte, scheint der AT1bR im Falle einer AT1aR-Defizienz f{\"u}r die Entstehung der Sch{\"a}den zust{\"a}ndig zu sein. Ziel des zweiten Experimentes war es, den Beitrag der Nox2 und Nox4 zum oxidativen DNA-Schaden in vivo zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurden m{\"a}nnliche C57BL/6-M{\"a}use und Nox2- oder Nox4-defiziente M{\"a}use mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentration von 600 ng/kg min {\"u}ber einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Im WT-Stamm und in beiden Nox-defizienten St{\"a}mmen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erh{\"o}hte Albumin-Level im Urin und f{\"u}hrte zur Bildung von ROS in der Niere. Außerdem waren in allen AngII-behandelten Gruppen genomische Sch{\"a}den, vor allem in Form von Doppelstrangbr{\"u}chen, erh{\"o}ht. Auch in Abwesenheit von AngII wiesen Nox2- und Nox4-defiziente M{\"a}use mehr Doppelstrangbr{\"u}che im Vergleich zu WT-Kontrollm{\"a}usen auf. Interessanterweise kompensieren allerdings weder Nox2 noch Nox4 das Fehlen der jeweils anderen Isoform auf RNA-Basis. Aufgrund dieser Ergebnisse schließen wir, dass bislang keine Isoform alleine f{\"u}r die Generierung von oxidativen DNA-Sch{\"a}den in der Niere verantwortlich gemacht werden kann und dass eine Beteiligung einer weiteren Nox-Isoform sehr wahrscheinlich ist. M{\"o}glicherweise k{\"o}nnten aber auch andere ROS-generierende Enzyme, wie Xanthinoxidase oder Stickoxidsynthase involviert sein. Da genomische Sch{\"a}den in Nieren von Nox2- und Nox4-defizienten M{\"a}usen in Abwesenheit von AngII gegen{\"u}ber den Sch{\"a}den in WT-Kontrollm{\"a}usen erh{\"o}ht waren, k{\"o}nnten die beiden Isoformen auch eine sch{\"u}tzende Funktion im Bereich von Nierenkrankheiten {\"u}bernehmen. Da dies aber bislang nur f{\"u}r Nox4 beschrieben ist, ist es wahrscheinlicher, dass das Fehlen von einer der beiden Isoformen eher einen Einfluss auf die Embryonalentwicklung hat. Um dies jedoch abschließend zu kl{\"a}ren w{\"a}re es sinnvoll mit induzierbaren Knockout-Modellen zu arbeiten, bei denen m{\"o}gliche entwicklungsbedingte Effekte minimiert werden k{\"o}nnen.},
  subject      = {Angiotensin II},
  language  = {de}
}