@phdthesis{Spall2004, author = {Spall, Thomas}, title = {Optische Visualisierung neuronaler Aktivit{\"a}t : Etablierung des in-vivo Calcium-Imaging mit dem genetisch codierten Sensor Yellow Cameleon 2.1 und Untersuchung der olfaktorischen Codierung im Gehirn von Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11575}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Die Messung der r{\"a}umlich aufgel{\"o}sten Aktivit{\"a}t von neuronalen Zellverb{\"a}nden ist ein wichtiges Werkzeug, um die Funktionsweise von Gehirnen zu verstehen. F{\"u}r diese Arbeit diente die Fruchtfliege Drosophila melanogaster mit ihrer gut beschriebenen Genetik und Neurobiologie als Untersuchungsobjekt. Bei der vorgelegten Arbeit lag eine zweigeteilte Aufgabenstellung vor: Zum einen wurde die Technik des in - vivo Calcium - Imagings mit Hilfe des genetisch codierten Sensors Yellow Cameleon 2.1 am Lehrstuhl komplett neu etabliert, zum anderen wurde mit der neuen Technik das Zusammenspiel der funktionellen Elemente neuronaler Systeme anhand der Fliegenolfaktorik untersucht. Sowohl die Experimente zur Depolarisation durch KCl, als auch die Experimente zur olfaktorischen Codierung, wurden mit dem Calciumsensor Yellow Cameleon 2.1 durchgef{\"u}hrt. Es wurde ausgehend von der Vorg{\"a}ngerversion Yellow Cameleon 2.0 durch gezielte Mutagenese von S{\"o}ren Diegelmann erstellt. Eine Photomultiplier - basierte in - vitro Funktionsanalyse des rekombinanten Sensorproteins ergab eine Zunahme der Ratio EYFP / ECFP mit steigender Calciumkonzentration. Dabei konnte auch der ratiometrische FRET - Effekt des Cameleons verdeutlicht werden: Mit steigender Calciumkonzentration verschiebt sich das Verh{\"a}ltnis von EYFP - Fluoreszenz zu ECFP - Fluoreszenz zu h{\"o}heren Ratiowerten. Durch Zugabe des Calciumchelators EGTA konnte außerdem die reversible Arbeitsweise des Sensors nachgewiesen werden. Das in die Fliege eingebrachte Yellow Cameleon 2.1 - Konstrukt wurde mittels der GAL4 - UAS - Technik in verschiedenen olfaktorischen Gehirnzentren exprimiert. Von besonderer Relevanz f{\"u}r die Experimente zur olfaktorischen Codierung war dabei die GAL4 - Treiberlinie GH146. Mit ihrer Hilfe konnte das Fusionsprotein in den olfaktorischen Projektionsneuronen des Fliegengehirns exprimiert, und so die Duftrepr{\"a}sentation im postsynaptischen Neuropil der Antennalloben bzw. in den pr{\"a}synaptischen Neuropilen der Calyces und des lateralen Protocerbrums untersucht werden: Die Stimulation von 3 individuellen Fliegen mit den D{\"u}ften Benzaldehyd, Isoamylacetat und Octanol liefert duftspezifische neuronale Aktivit{\"a}tsmuster im Antenallobus. Die auf die Duftstimuli mit Calciumsignalen reagierenden Areale haben eine Gr{\"o}ße von 10 - 30 µm, liegen also in der Gr{\"o}ßenordnung von individuellen Glomeruli. Die Duftrepr{\"a}sentation in den Antennalloben zeigt außerdem einen kombinatorischen Aspekt: Jeder Duft evoziert ein charakteristisches Aktivit{\"a}tsmuster bestehend aus einem oder mehreren Glomeruli. Die Aktivit{\"a}tsmuster verschiedener D{\"u}fte k{\"o}nnen sich {\"u}berlagern, d.h. individuelle Glomeruli k{\"o}nnen durch verschiedene D{\"u}fte aktiviert werden, das gesamte Aktivit{\"a}tsmuster, d.h. die Summe der aktivierten Glomeruli eines bestimmten Duftes, ist jedoch charakteristisch. Die Duftrepr{\"a}sentation in den Antennalloben von Drososophila geschieht also in Form eines glomerul{\"a}ren Codes, ein Prinzip der Duftverarbeitung, das auch in anderen Insekten und Vertebraten nachgewiesen werden konnte. F{\"u}r den Calyx des Pilzk{\"o}rpers ergaben sich innerhalb eines Individuums, bei wiederholter Stimulation mit demselben Duft, ebenfalls duftspezifische Aktivit{\"a}tsmuster. Dabei waren die auf den Duftstimulus hin antwortenden neuronalen Areale diskret {\"u}ber den Calyx hinweg verteilt. Insgesamt zeigt das hohe Maß an Reproduzierbarkeit der Aktivit{\"a}tsmuster f{\"u}r einen gegebenen Duft, dass im Calyx, wie in den Antennalloben, eine duftspezifische r{\"a}umliche Repr{\"a}sentation vorliegt. Der kombinatorische Aspekt der Codierung konnte auch hier beobachtet werden. Die einzelnen Spots der im Calyx gemessenen Aktivit{\"a}tsmuster liegen in der Gr{\"o}ßenordnung von 5 +/- 2 µm und entsprechen somit in ihrer Gr{\"o}ße den elektronenmikroskopisch beschriebenen Microglomeruli. Durch die Calcium - Imaging Experimente am lateralen Protocerebrum konnte nachgewiesen werden, dass die Erh{\"o}hung der Duftkonzentration eine r{\"a}umliche Ausdehnung des aktivierten Neuropils zur Folge hat. Die EYFP -, ECFP - und Ratio - Intensit{\"a}ten, die aus einer "Region of Interest" im anterioren Bereich des lateralen Protocerebrums berechnet wurden, zeigen weiterhin, dass mit steigender Duftkonzentration auch die St{\"a}rke des Calciumsignals zunimmt. Dabei gibt es zwischen den 4 getesteten D{\"u}ften statistisch signifikante Unterschiede: Methylcyclohexanol evoziert {\"u}ber den gesamten Verd{\"u}nnungsbereich hinweg die schw{\"a}chste neuronale Aktivit{\"a}t, Isoamylacetat evoziert in den Verd{\"u}nnungsstufen 10-3 und 10-1 die st{\"a}rkste neuronale Aktivit{\"a}t. D.h. neben der r{\"a}umlichen Ausdehnung des Signals, f{\"u}hrt die Konzentrationserh{\"o}hung auch zu einer gesteigerten Intensit{\"a}t des Calciumsignals, wobei sich die Signalintensit{\"a}ten f{\"u}r verschiedene D{\"u}fte und Verd{\"u}nnungsstufen unterscheiden k{\"o}nnen. Mit der verwendeten Versuchsanordnung und Datenauswertung, war es jedoch bislang nicht m{\"o}glich eine r{\"a}umliche Repr{\"a}sentation der D{\"u}fte im lateralen Protocerebrum nachzuweisen.}, subject = {Terpyridinderivate <2}, language = {de} } @phdthesis{Kusnezow2006, author = {Kusnezow, Wlad}, title = {Entwicklung von Antik{\"o}rper-Mikroarray : von Biophysik der Mikrospot-Reaktion bis zur Hochdurchsatzanalyse der Proteine}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22534}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Obwohl Protein-Mikroarrays urspr{\"u}nglich aus dem gut entwickelten und fest etablierten DNA-Pendant entstanden sind, repr{\"a}sentierte jedoch die Umstellung der Mikroarray-Technik von der DNA- auf die Proteinanalyse aufgrund der enormen physikalisch-chemischen Variabilit{\"a}t der Proteine, deren relativ niedrigen Stabilit{\"a}t und der komplexen Mikrospot-Kinetik eine große technologische Herausforderung. Deshalb setzt das Vorhaben, die Technik der Antik{\"o}rper-Mikroarrays von ihrem konzeptuellen Zustand ausgehend zu einem robusten, real funktionierenden Werkzeug zu etablieren, nicht nur eine Vielzahl an technologischen L{\"o}sungen, sondern auch eine systematische und physikalisch begr{\"u}ndete Herangehensweise in dieser technologischen Entwicklung voraus. Das waren im Wesentlichen die zwei wichtigsten, der eigentlichen Entwicklung der Antik{\"o}rper-Mikroarrays untergeordneten Ziele der Arbeit. Mit dem Ziel, Antik{\"o}rper-Mikroarrays prinzipiell zu etablieren und eine optimale Immobilisierungschemie f{\"u}r deren Herstellung zu finden, wurden im ersten Teil dieser Arbeit mehrere chemische Beschichtungen von Glasslides optimiert, unterschiedliche Spotting-Bedingungen von Antik{\"o}rpern f{\"u}r verschiedene Oberfl{\"a}chen getestet und verschiedene Blockierungsverfahren und Strategien zur Aufbewahrung von Slides analysiert. Anschließend wurde eine Reihe von kommerziellen und selbst hergestellten chemisch beschichteten Slides unter den optimierten Bedingungen miteinander verglichen. Als Hauptergebnis dieser Untersuchung wurde die Herstellung der Antik{\"o}rper-Microarrays etabliert. Unter anderem konnte im Zuge dieser systematischen Analyse gezeigt werden, dass Epoxysilan-modifizierte Oberfl{\"a}chen am besten geeignet sind. Diese Oberfl{\"a}che ist heutzutage auf dem Gebiet der Protein-Microarrays am weitesten verbreitet und wurde f{\"u}r alle weiteren Studien innerhalb dieser Dissertation verwendet. Die Entwicklung der Antik{\"o}rper-Mikroarrays in den letzten Jahren demonstrierte erhebliche Schwierigkeiten im Erreichen der n{\"o}tigen Sensitivit{\"a}t und Reproduzierbarkeit. Um dieser Problematik auf den Grund zu gehen, und die Mikrospot-Kinetik experimentell untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte und f{\"u}r den Fall der Mikrorrays angepasste Variante des Two-Compartment Modells (TCM) entwickelt. TCM erm{\"o}glicht auf eine ph{\"a}nomenologische Weise, d.h., dass Diffusionskoeffizienten, Mischintensit{\"a}t oder Dichte der Bindungsstellen nicht bekannt sein m{\"u}ssen, eine quantitative experimentelle Analyse der Mikrospot-Kinetik unter Ber{\"u}cksichtigung von Effekten des Massentransports. Um die ph{\"a}nomenologischen TCM-Werte interpretieren zu k{\"o}nnen und um den Mechanismus der Mikrospot-Reaktion zu untersuchen, wurden auch andere, f{\"u}r die Mikrospot-Kinetik relevante, klassische Theorien an die Bedingungen der Mikrospot-Reaktion angepasst und mit dem modifizierten TCM mathematisch verbunden. Als das erste in der Mikroarray-Technologie mathematisch-physikalische Werkzeug dieser Art hat die hier entwickelte Theorie ein großes Potential, auch in den anderen verwandten Techniken wie DNA- oder Peptid-Mikroarrays Verwendung zu finden. Außerdem wurde innerhalb dieser Arbeit ein anderes einheitliches theoretisches Modell entwickelt, das eine kinetische Simulation von verschiedenen Reaktionsphasen sowohl f{\"u}r konventionelle als auch f{\"u}r Mikrospot-Immunoassays erm{\"o}glicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte f{\"u}r einen typischen Standard-Antik{\"o}rper-Mikroarray theoretisch und experimentell eine lang andauernde, stark massentransportabh{\"a}ngige Mikrospot-Kinetik beschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Erreichen eines thermodynamischen Gleichgewichts in Mikroarrays wegen eines relativ langsamen Ligandentransports zum Spot eine lange Zeit dauert, je nach Bindungskonstante, Diffusionsgeschwindigkeit und Ligandenkonzentration mehrere Stunden bis hin zu Wochen. In dieser Arbeit wurde ein neues physikalisches Konzept, das dem heutzutage dominierenden Blickwinkel, der sogenannten ambient analyte Theorie, opponierend gegen{\"u}bersteht, formuliert. Auch konnten viele Konsequenzen f{\"u}rs Design und die zuk{\"u}nftige Entwicklung dieser relativ neuen Technologie gezogen werden. Als eine logische Folge der massentransportlimitierten Reaktionen ist das Design eines Antik{\"o}rper-Mikroarray ein kritischer Punkt f{\"u}r die Leistung des Verfahrens. Im Laufe der experimentellen und/oder theoretischen Betrachtungen konnte gezeigt werden, dass eine Reihe allgemeiner Parameter wie Gr{\"o}ße eines Spots, Spotting-Muster, Inkubationsgeometrie, Volumen und Konzentration einer Probe, Viskosit{\"a}t des Inkubationspuffers und Mischintensit{\"a}t die Reaktionsraten auf den Spots insgesamt um mehrere Gr{\"o}ßenordnungen beeinflusst. Ist die maximale Rate des Massentransports in einem Mikroarray-Verfahren gew{\"a}hrleistet, kann dann auch die maximale Bindungsleistung der Spots, die durch die Dichte der Bindungsstellen, Bindungsaffinit{\"a}t, Inkubationszeit und andere relevante Parameter eingestellt wird, erreicht werden. Aber nicht nur in der Inkubationsphase, sondern auch bei den Wasch- und Detektionsschritten sollte die gleiche Liste der Parameter ber{\"u}cksichtigt werden. Durch die Optimierung all dieser Parametern konnte eine deutliche Verbesserung der Sensitivit{\"a}t von Antik{\"o}rper-Mikroarrays in der Protein-Expressionsanalyse von klinischen Blutproben erzielt werden In einer weiteren Studie zur Analyse von unterschiedlichen Detektionsverfahren konnte die Sensitivit{\"a}t und Reproduzierbarkeit der etablierten Antik{\"o}rper-Mikroarrays weiter verbessert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Markierungssubstanzen mit NHS (N-hydroxysuccinimide) und ULS (universal linkage system) reaktiven Gruppen wurden innerhalb drei Detektionsverfahren untersucht: 1) eine direkte Probenmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, 2) Markierung der Probe mit Biotin-Substanzen und nachfolgender Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Extravidin und 3) Markierung der Probe mit Fluorescein-Substanzen mit Anti-Fluorescein-Detektion. Aus den Erfahrungen der vorherigen kinetischen Untersuchungen wurde hier vorerst das kinetische Verhalten des Testsystems analysiert und optimale Inkubationsbedingungen festgelegt. Anschließend wurden optimale Konzentrationen all dieser Substanzen f{\"u}r die Markierung von Blutplasma bestimmt. Im Vergleich zur direkten Fluoreszenzmarkierung resultierten sich die indirekten Detektionsverfahren mit Biotin- und Fluorescein-Substanzen in wesentlich besseren Signal-zu-Hintergrund-Verh{\"a}ltnissen. In einer anschließenden Vergleichsanalyse zeigten sich einige Substanzen wie Biotin-ULS oder Fluoresceine-NHS als am besten geeignet f{\"u}r eine Protein-Expressionsanalyse von Blutplasma. Sensitivit{\"a}ten im femtomolaren Bereich konnten mittels der etablierten Antik{\"o}rper-Mikroarrays sowohl f{\"u}r eine markierte Antigenmischung als auch f{\"u}r komplexe klinische Proben innerhalb dieser Dissertation erzielt werden. Viele niedrig konzentrierte Proteine wie beispielsweise Zytokine, die normalerweise in einer piko-oder femtomolaren Konzentration im Blut vorliegen, wurden in dieser Arbeit mit sehr hohen Signal-zu-Hintergrund-Verh{\"a}ltnissen detektiert. Das hier beschriebene Verfahren {\"o}ffnet zus{\"a}tzliche M{\"o}glichkeiten f{\"u}r schnelle, kosteng{\"u}nstige und unbeschr{\"a}nkt erweiterungsf{\"a}hige Mikrospot-Immunoassays.}, subject = {Microarray}, language = {de} } @phdthesis{Goehler2012, author = {G{\"o}hler, Antonia}, title = {Untersuchung Karbohydrat-bindender Proteine mit hoher zeitlicher und r{\"a}umlicher Aufl{\"o}sung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76665}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Das menschliche Genom verschl{\"u}sselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten tr{\"a}gt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenw{\"a}rtige Bestandteile der extrazellul{\"a}ren Matrix von Zelloberfl{\"a}chen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, k{\"o}nnen bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilit{\"a}t erh{\"o}hen oder Immunantworten regulieren. Die Ausl{\"o}sung von biologischen Prozesse erfordert aber {\"U}bersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle {\"U}bereinstimmungen in der Aminos{\"a}uresequenz ihrer Zuckererkennungsdom{\"a}nen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll"-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltbl{\"a}ttern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen pr{\"a}sentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verkn{\"u}pfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Dom{\"a}ne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs {\"u}ber ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen {\"u}ber die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamili{\"a}ren Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und r{\"a}umlicher Aufl{\"o}sung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen n{\"a}her untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Daf{\"u}r skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgef{\"u}hrt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken f{\"u}r den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe m{\"o}glichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zur{\"u}ckgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle {\"A}hnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen k{\"o}nnen, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden k{\"o}nnen so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die {\"U}bertragbarkeit auf andere Glykoproteine gew{\"a}hrleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfl{\"a}che Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die r{\"a}umliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberfl{\"a}chen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochaufl{\"o}sende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker f{\"u}r hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfl{\"a}che best{\"a}tigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabh{\"a}ngig von der Konzentration, w{\"a}hrend die Anzahl der Cluster davon abh{\"a}ngt. F{\"u}r die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Molek{\"u}le, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdr{\"u}ckt und die Spezifit{\"a}t der CRDs gegen{\"u}ber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht m{\"o}glich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollst{\"a}ndigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. M{\"o}glicherweise wird der Zelltod induziert. Hochaufl{\"o}sende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie er{\"o}ffnet jedoch neue M{\"o}glichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolek{\"u}len, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermolek{\"u}le in die Zellmembranen eingebaut, {\"u}ber eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermolek{\"u}le in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchf{\"u}hrbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschl{\"u}sselt und eine Diffusionskonstante f{\"u}r Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher r{\"a}umlicher und zeitlicher Aufl{\"o}sung dar und erm{\"o}glicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine.}, subject = {Fluoreszenz}, language = {de} } @phdthesis{Niehoerster2022, author = {Nieh{\"o}rster, Thomas}, title = {Spektral aufgel{\"o}ste Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie mit vielen Farben}, doi = {10.25972/OPUS-29657}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-296573}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine vielseitig einsetzbare Untersuchungsmethode f{\"u}r biologische Proben, bei der Biomolek{\"u}le selektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, um sie dann mit sehr gutem Kontrast abzubilden. Dies ist auch mit mehreren verschiedenartigen Zielmolek{\"u}len gleichzeitig m{\"o}glich, wobei {\"u}blicherweise verschiedene Farbstoffe eingesetzt werden, die {\"u}ber ihre Spektren unterschieden werden k{\"o}nnen. Um die Anzahl gleichzeitig verwendbarer F{\"a}rbungen zu maximieren, wird in dieser Arbeit zus{\"a}tzlich zur spektralen Information auch das zeitliche Abklingverhalten der Fluoreszenzfarbstoffe mittels spektral aufgel{\"o}ster Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy, sFLIM) vermessen. Dazu wird die Probe in einem Konfokalmikroskop von drei abwechselnd gepulsten Lasern mit Wellenl{\"a}ngen von 485 nm, 532nm und 640nm angeregt. Die Detektion des Fluoreszenzlichtes erfolgt mit einer hohen spektralen Aufl{\"o}sung von 32 Kan{\"a}len und gleichzeitig mit sehr hoher zeitlicher Aufl{\"o}sung von einigen Picosekunden. Damit wird zu jedem detektierten Fluoreszenzphoton der Anregungslaser, der spektrale Kanal und die Ankunftszeit registriert. Diese detaillierte multidimensionale Information wird von einem Pattern-Matching-Algorithmus ausgewertet, der das Fluoreszenzsignal mit zuvor erstellten Referenzpattern der einzelnen Farbstoffe vergleicht. Der Algorithmus bestimmt so f{\"u}r jedes Pixel die Beitr{\"a}ge der einzelnen Farbstoffe. Mit dieser Technik konnten pro Anregungslaser f{\"u}nf verschiedene F{\"a}rbungen gleichzeitig dargestellt werden, also theoretisch insgesamt 15 F{\"a}rbungen. In der Praxis konnten mit allen drei Lasern zusammen insgesamt neun F{\"a}rbungen abgebildet werden, wobei die Anzahl der Farben vor allem durch die anspruchsvolle Probenvorbereitung limitiert war. In anderen Versuchen konnte die sehr hohe Sensitivit{\"a}t des sFLIM-Systems genutzt werden, um verschiedene Zielmolek{\"u}le voneinander zu unterscheiden, obwohl sie alle mit demselben Farbstoff markiert waren. Dies war m{\"o}glich, weil sich die Fluoreszenzeigenschaften eines Farbstoffmolek{\"u}ls geringf{\"u}gig in Abh{\"a}ngigkeit von seiner Umgebung {\"a}ndern. Weiterhin konnte die sFLIM-Technik mit der hochaufl{\"o}senden STED-Mikroskopie (STED: stimulated emission depletion) kombiniert werden, um so hochaufgel{\"o}ste zweifarbige Bilder zu erzeugen, wobei nur ein einziger gemeinsamer STED-Laser ben{\"o}tigt wurde. Die gleichzeitige Erfassung von mehreren photophysikalischen Messgr{\"o}ßen sowie deren Auswertung durch den Pattern-Matching-Algorithmus erm{\"o}glichten somit die Entwicklung von neuen Methoden der Fluoreszenzmikroskopie f{\"u}r Mehrfachf{\"a}rbungen.}, subject = {Fluoreszenzmikroskopie}, language = {de} }