@phdthesis{Loeffler2006, author = {L{\"o}ffler, Daniela Inge Martina}, title = {Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes St{\"a}mme als Impfstofftr{\"a}ger im Mausmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Virulenzattenuierte St{\"a}mme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Tr{\"a}ger f{\"u}r heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem prim{\"a}ren phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpr{\"a}sentierenden Zellen (APC). Diese F{\"a}higkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete {\"U}bertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Pr{\"a}sentationswege, um so eine effektive zellul{\"a}re Immunit{\"a}t zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm \&\#61508;trpS St{\"a}mme in das Zytosol von antigenpr{\"a}sentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterst{\"u}tzt. Die {\"U}bertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Molek{\"u}le durch die autolysierenden Listerien f{\"u}hrte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Pr{\"a}sentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zellul{\"a}re Immunit{\"a}t unter Beteiligung von T-Ged{\"a}chtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die {\"U}bertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellul{\"a}ren adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Ged{\"a}chtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA {\"u}bertrugen, l{\"o}sten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Tr{\"a}gerstamm Lm \&\#61508;trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei h{\"o}her Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollst{\"a}ndigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch st{\"a}rker attenuierter autolysierender Lm St{\"a}mme als {\"U}bertr{\"a}ger des Ovalbumins (Lm Mutanten \&\#61508;trpS hlyW491A und \&\#61508;(trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide erm{\"o}glichten die OVA-Pr{\"a}sentation {\"u}ber MHC-Klasse-I-Molek{\"u}le mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm \&\#61508;trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Pr{\"a}sentation des OVAs {\"u}ber MHC-Klasse-I-Molek{\"u}le durch die autolysierende Mutante \&\#61508;trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm \&\#61508;(trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5\&\#61620;107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Tr{\"a}ger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm \&\#61508;trpS eine sehr geringe Lebersch{\"a}digung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm \&\#61508;(trpS aroA aroB) St{\"a}mmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellul{\"a}r verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare H{\"a}ufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm \&\#61508;(trpS aroA aroB) OVA-Tr{\"a}gerst{\"a}mme. Die Strategie der {\"U}bertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpr{\"a}sentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpr{\"a}sentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten f{\"u}r die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der urspr{\"u}nglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die urspr{\"u}ngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 f{\"u}r die {\"U}bertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien f{\"u}hrte.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} } @phdthesis{Bock2005, author = {Bock, Fiola}, title = {Untersuchungen zu nat{\"u}rlicher und manipulierter Aufzucht von Apis mellifera : Morphologie, Kognition und Verhalten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17801}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {3. Zusammenfassung Ein noch immer unvollst{\"a}ndig verstandenes Problem sind die exakten Mechanismen der Arbeitsteilung und Koordination innerhalb von Bienenv{\"o}lkern Apis mellifera. Auf der einen Seite muss die sensorische und neuronale Ausstattung jedes Individuums das Potential zur Kommunikation und Aufgabenbew{\"a}ltigung enthalten, zum anderen m{\"u}ssen jedem Bienenvolk Mechanismen zur Steuerung zur Verf{\"u}gung stehen, die auch so weit in die Zukunft reichenden Notwendigkeiten wie Wintervorbereitungen zuverl{\"a}ssig durchf{\"u}hren. Die vorliegende Arbeit beleuchtet daraus ausgew{\"a}hlte Aspekte. Zum einen werden Aspekte der kognitiven F{\"a}higkeiten der Einzelbienen untersucht, die im Hinblick auf ihre Rolle als sammelnde Arbeiterinnen eine wichtige Rolle spielen. Das Erkennen und Verarbeiten von Mustern spielt eine wichtige Rolle beim Auffinden von potentiellen Nahrungsquellen. Hier konnte mittels des DMTS - Paradigma ein hoher Abstraktionsgrad der Musterverarbeitung sowie eine Speicherung auch komplexer Muster gezeigt werden. Zum anderen wird die Bruttemperatur als ein Einfluss auf die Puppenentwicklung und dessen m{\"o}gliche Folgen auf kognitive F{\"a}higkeiten und Lebenshistorie untersucht. Variation der Bruttemperatur wurde in verschiedenen Zusammenh{\"a}ngen als starker Einfluss auf unterschiedliche Aspekte der Entwicklung gezeigt. In der vorliegenden Arbeit kann diese Bruttemperatur als m{\"o}glicher Faktor der nachfolgend unterschiedlichen Auspr{\"a}gung von Verhaltensmustern gezeigt werden. Dabei wird ebenso auf die Unterschiede im Verhaltensmuster von t{\"a}glichen Stockt{\"a}tigkeiten wie auf die resultierenden Unterschiede in der Lebensgeschichte und -spanne eingegangen, die aus unterschiedlichen Brutaufzuchtstemperaturen resultieren k{\"o}nnen. Als Aufzuchtstemperaturen werden dabei 32°C, 35°C sowie 36°C verwendet, um eine Vari ation zwischen der an anderer Stelle berichteten mittleren, der niedrigsten und der h{\"o}chsten Temperatur f{\"u}r morphologisch vollst{\"a}ndig entwickelte Bienen zu erreichen und die daraus resultierenden Arbeiterinnen zu untersuchen. Sowohl die Ergebnisse der Verhaltensuntersuchungen von Stockbienen wie auch der Vergleich von Lebensaktivit{\"a}t und -spanne zeigen dabei signifikante Unterschiede zwischen den bei unterschiedlichen Temperaturen aufgezogenen Arbeiterinnen in deren analysiertem Verhalten.}, subject = {Biene}, language = {de} } @phdthesis{ZavalaGongora2005, author = {Zavala G{\´o}ngora, Ricardo}, title = {Isolierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von TGF-Beta-Signaltransduktionskomponenten des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17755}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgel{\"o}sten Erkrankung der alveol{\"a}ren Echinokokkose sind bislang ungekl{\"a}rt. Zudem liegen keine Daten {\"u}ber Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die f{\"u}r die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden k{\"o}nnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits fr{\"u}hzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorg{\"a}ngen ist das TGF\&\#946;/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGF\&\#946; (transforming growth factor \&\#946;) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberfl{\"a}chenst{\"a}ndigen Rezeptoren der TGF\&\#946;-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellul{\"a}ren Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorg{\"a}ngen tierischer Organismen k{\"o}nnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation w{\"a}hrend Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGF\&\#946; und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGF\&\#946;/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgef{\"u}hrt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGF\&\#946;/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazellul{\"a}re Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGF\&\#946; activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals f{\"u}r einen parasit{\"a}ren Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGF\&\#946; wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGF\&\#946;- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 w{\"a}re durch weitere Untersuchungen zu kl{\"a}ren. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGF\&\#946;/BMP-Signalsystemen des Parasiten und S{\"a}ugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin {\"a}ußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden k{\"o}nnen. Dar{\"u}ber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen k{\"o}nnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Dom{\"a}ne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGF\&\#946;/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellul{\"a}ren Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang f{\"u}r Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis aus{\"u}bt, k{\"o}nnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 - Interaktion von entscheidender Bedeutung f{\"u}r die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveol{\"a}ren Echinokokkose sein.}, subject = {Fuchsbandwurm}, language = {de} } @phdthesis{Schauss2006, author = {Schauß, Astrid Claudia}, title = {Charakterisierung des mitochondrialen Teilungsproteins Dnm1p mittels quantitativer hochaufl{\"o}sender Lichtmikroskopie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17566}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Mitochondrien ver{\"a}ndern dynamisch durch ein balanciertes Verh{\"a}ltnis von Teilung und Fusion die Gestalt ihrer Netzwerke und reagieren so auf interne und externe Signale. Ein Schl{\"u}lsselprotein der mitochondrialen Teilung ist die Dynamin-verwandte GTPase Dnm1p, die in dieser Arbeit charakterisiert wurde. Da Mitochondrien aufgrund ihres endosymbiontischen Ursprungs zwei Membranen besitzen, erfordert deren Teilung eine besondere Koordination. Unter Verwendung von photokonvertierbarem GFP wird in dieser Arbeit gezeigt, dass in S. cerevisiae die Teilung der inneren und {\"a}ußeren Membran zeitlich eng gekoppelt verl{\"a}uft. Dieser Prozess wird durch die GTPase Dnm1p, aber auch durch die Adaptor-Proteine Mdv1p und Caf4p sowie dem integralen Membrananker Fis1p v ermittelt. Dnm1p lagert sich zu Spiralen um den tubul{\"a}ren Strang an und trennt GTP-abh{\"a}ngig die Mitochondrien voneinander. Eine Voraussetzung f{\"u}r die Anlagerung dieser Spiralen stellen Matrix-Konstriktionen dar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Dnm1p und auch Fis1p f{\"u}r die Ausbildung dieser mitochondrialen Einschn{\"u}rungen nicht essentiell sind. Die Untersuchung der Verteilung, Orientierung und Gr{\"o}ße der Epitop-markierten Dnm1p-Cluster bildet den Schwerpunkt der Arbeit. Weiterhin wird der Einfluss der Teilungsproteine Fis1p, Mdv1p und Caf4p auf diese Dnm1p-Charakteristika ermittelt. Die Analyse basiert auf quantitativen Konfokalmikroskopie-Aufnahmen, zus{\"a}tzlich werden auch neue hochaufl{\"o}sende Lichtmikroskope (4Pi und STED) zur genauen Lokalisation und Gr{\"o}ßenbestimmung eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionsst{\"a}mmen die Mehrheit der Cluster mit den Mitochondrien assoziiert ist, w{\"a}hrend in Fis1p- und Caf4p-Deletionszellen die Rekrutierung der Cluster zu den Mitochondrien gest{\"o}rt erscheint. Nur wenige Cluster bilden Spiralen um Matrix-Konstriktionen aus, die {\"u}berwiegende Mehrheit der nicht an aktuellen Teilungsprozessen beteiligten Dnm1p-Aggregate weist dagegen im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionszellen eine polare Orientierung Richtung Zellcortex auf. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Polarit{\"a}t ist in Fis1p- und Caf4p-Deletionsst{\"a}mmen aufgehoben, bleibt jedoch auch nach der Zerst{\"o}rung des Aktin-Ger{\"u}stes aufrechterhalten. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass Dnm1p in einem Komplex mit Fis1p und Caf4p zus{\"a}tzlich zu seiner Funktion als Teilungsprotein an der Anheftung der Mitochondrien an den Zellcortex beteiligt ist. Zudem scheinen die Adaptorproteine Mdv1p und Caf4p trotz molekularer {\"A}hnlichkeit unterschiedliche Aufgaben in der Zelle zu erf{\"u}llen.}, subject = {Hefeartige Pilze}, language = {de} } @phdthesis{Bertram2005, author = {Bertram, Helge}, title = {Bioinformatische Identifikation von Dom{\"a}nenunterschieden bei Parasit und Wirt am Beispiel der Malaria}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17188}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Diese Arbeit untersucht zellul{\"a}re Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu m{\"u}ssen zun{\"a}chst Proteindom{\"a}nen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht f{\"u}r regulatorische Elemente in Nukleins{\"a}uren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender N{\"a}he zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Dom{\"a}nenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Dom{\"a}nen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen {\"u}ber das Netzwerkverhalten f{\"u}hren, andererseits f{\"u}r konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel w{\"a}hlten wir hier Redoxnetzwerke und die Bek{\"a}mpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode f{\"u}r dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verst{\"a}rkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit m{\"o}glichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu k{\"o}nnen. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und f{\"u}hrt zu einer vereinfachten Darstellungsm{\"o}glichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindom{\"a}nenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Dom{\"a}nen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bed{\"u}rfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit {\"u}ber die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen {\"u}ber das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine {\"U}bersicht {\"u}ber die Schwerpunkte der Bioinformatik in W{\"u}rzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zug{\"a}nglich gemacht werden k{\"o}nnen (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bek{\"a}mpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte St{\"o}rungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszul{\"o}sen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann.}, subject = {Plasmodium falciparum}, language = {de} } @phdthesis{Schuetz2006, author = {Sch{\"u}tz, Wolfgang}, title = {Postmeiotische Expression und funktionelle Charakterisierung von Lamin B3 in der Spermatogenese der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17110}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Die Lamine geh{\"o}ren zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernh{\"u}lle eukaryontischer Zellen. In S{\"a}ugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernh{\"u}lle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enth{\"a}lt eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellul{\"a}ren Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien w{\"a}hrend der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernh{\"u}lle und {\"u}berraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina w{\"a}hrend der S{\"a}uger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in S{\"a}ugern das erste Beispiel f{\"u}r ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen f{\"u}hrt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenf{\"o}rmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Ver{\"a}nderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale St{\"a}bchendom{\"a}ne in Lamin B3 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Dar{\"u}ber hinaus zeigte das Protein eine stark erh{\"o}hte L{\"o}slichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching" (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching" (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Molek{\"u}le eine hohe Mobilit{\"a}t aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze St{\"a}bchendom{\"a}ne begr{\"u}ndet ist. Die Ergebnisse f{\"u}hren zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernh{\"u}lle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung f{\"u}r einige Vorg{\"a}nge in der Spermiogenese sein k{\"o}nnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminos{\"a}uren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde {\"u}ber einen „Pull-Down-Assay" nach m{\"o}glichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie geh{\"o}ren zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und sp{\"a}teren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch {\"u}berpr{\"u}ft werden, w{\"u}rde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernh{\"u}lle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es f{\"u}r die Kernh{\"u}llenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem w{\"a}re es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Dom{\"a}ne von Lamin B3.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Schoen2005, author = {Schoen, Christoph}, title = {Entwicklung neuartiger bakterieller Vektoren zur {\"U}bertragung von zellassoziierten Antigenen, DNA und RNA auf der Basis virulenzattenuierter L. monocytogenes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16560}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Listeria monocytogenes ist ein fakultativ humanpathogenes Bakterium und aufgrund seiner F{\"a}higkeit, in Zellen des Wirtes einzudringen und sich im Zytoplasma der befallenen Wirtszelle zu vermehren, ein attraktiver Tr{\"a}ger, um heterolog exprimierte Antigene in den MHC-I- und -II-Pr{\"a}sentationsweg antigenpr{\"a}sentierender Zellen (APC) einzuschleusen und so eine effektive zellul{\"a}re Immunreaktion zu erzeugen. Dabei hat die Art und Weise der Antigenexpression einen wesentlichen Einfluss auf die Erzeugung der antigenspezifischen Immunit{\"a}t. So konnte unter Verwendung extrazellul{\"a}rer Tr{\"a}gerbakterien gezeigt werden, dass insbesondere die Verankerung von Antigenen auf der Zelloberfl{\"a}che der Bakterien zu einer effektiven Induktion einer humoralen Immunantwort f{\"u}hrt. Mit dem Ziel, mit einem derartigen Ansatz auch eine zellul{\"a}re Immunit{\"a}t zu erzeugen, wurde ein Plasmidsystem f{\"u}r die Expression von heterologen Proteinen in der Zellwand von L. monocytogenes entwickelt. Dabei gelang die Verankerung zahlreicher Proteine eukaryontischer wie auch prokaryontischer Herkunft {\"u}ber das LPXTG-Ankermotiv von Internalin A. Die so erzielte starke Expression in der Zellwand setzte aber sowohl die Fitness der Bakterien als auch deren Invasivit{\"a}t in vitro deutlich herab und verhinderte damit eine effektive MHC-I-Pr{\"a}sentation des verwendeten Modellantigens. Alternativ wurde L. monocytogenes bereits erfolgreich zur {\"U}bertragung von DNA-Vakzinen eingesetzt, um so auch die Synthese gegebenenfalls posttranslationell modifizierter Antigene in ihrer korrekten Konformation durch die infizierte Wirtszelle zu erzielen. Allerdings erfolgte die Expression des als Reporterprotein verwendeten EGFP insbesondere in APC sehr langsam und war von geringer Effizienz. Dabei konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass nach bakterieller {\"U}bertragung von DNA-Vakzinen der Import der Plasmidmolek{\"u}le in den Kern insbesondere sich nicht teilender Zellen einen der wichtigsten Engp{\"a}sse f{\"u}r eine m{\"o}glichst fr{\"u}hzeitige und effektive Reportergenexpression darstellt. Einen Ausweg bietet die bakterielle {\"U}bertragung codierender mRNA, die unmittelbar nach der Freisetzung aus der Bakterienzelle im Zytoplasma der infizierten Wirtszelle zur Translation zu Verf{\"u}gung steht. Dazu wurde das 5'-Ende der EGFP-codierenden Sequenz mit dem IRES-Element des Encephalomyocarditisvirus genetisch fusioniert. Um eine m{\"o}glichst hohe Syntheserate zu erzielen und damit dem Abbau der mRNA in der Bakterienzelle entgegenzuwirken, erfolgte die Synthese der mRNA in L. monocytogenes mit Hilfe eines T7-RNA-Polymerase-basierten Transkriptionssystems. Im Gegensatz zur bakteriellen {\"U}bertragung von Plasmid-DNA konnte so bereits 4 h nach Infektion sowohl in epithelialen als auch in APC wie Makrophagen und humanen dendritischen Zellen eine deutliche EGFP-Expression nachgewiesen werden sowie bei Verwendung von Ovalbumin als Reporterprotein eine effektive MHC-I-Pr{\"a}sentation in vitro. Damit stellt die bakterielle {\"U}bertragung von mRNA einen vielversprechenden neuartigen Ansatz dar zur Erzeugung einer zellul{\"a}ren und gegebenenfalls auch humoralen Immunantwort gegen posttranslational modifizierte Antigene.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} } @phdthesis{Bujok2005, author = {Bujok, Brigitte}, title = {Thermoregulation im Brutbereich der Honigbiene Apis mellifera carnica}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15903}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Honigbienen (Apis mellifera carnica) regulieren die Temperatur ihrer Brut in einem sehr engen Temperaturfenster, da vor allem die gedeckelte Brut sehr temperaturempfindlich reagiert (Groh et al. 2004). Die Thermoregulation ist nicht - wie lange angenommen - Beiprodukt von allt{\"a}glichen Arbeiten der Bienen im Brutbereich, sondern eine aktive und Energie- und Zeitaufw{\"a}ndige eigene T{\"a}tigkeit. Arbeiterinnen ziehen sich mit ihren Beinen an die Brutoberfl{\"a}che, dr{\"u}cken ihren warmen Thorax auf die Brutdeckel und verharren so f{\"u}r einige Minuten um mit der eigenen K{\"o}rperw{\"a}rme die Brut zu temperieren (Bujok et al. 2002). Wie erwartet korrelierte die Thoraxtemperatur einer Arbeiterin mit der Frequenz der abdominalen Atembewegungen, bei sehr hohen Thoraxtemperaturen ({\"u}ber 40°C) erreichten die Bienen Atemfrequenzen von {\"u}ber 8Hz. Eine weitere Methode die Brut effektiv zu w{\"a}rmen {\"u}bten Bienen aus, die leere Zellen im gedeckelten Brutbereich besuchen (Kleinhenz et al. 2003). Arbeiterinnen gingen dabei bevorzugt in Zellen, die von m{\"o}glichst vielen gedeckelten Zellen umgeben waren. Sowohl die Dauer der Zellbesuche, als auch die mittlere Thoraxtemperatur bei Ein- und Austritt der Zelle korrelierten mit der Anzahl der benachbarten Brutzellen - je mehr Brutzellen eine leere Zelle in ihrer direkten Nachbarschaft hatte umso l{\"a}nger dauerte der Besuch einer Biene und umso h{\"o}her ist die Ein- bzw. Austrittstemperatur der Biene. Mindestes 48 Stunden alte Bienen unterschieden sich signifikant in ihrem W{\"a}rmeverhalten von j{\"u}ngeren Bienen. Tote gedeckelte Brut wurde in manchen F{\"a}llen {\"u}ber viele Tage (durchgehend bis 10 Tage) gew{\"a}rmt, sie unterschied sich in ihrer Temperatur nicht von unbehandelter gedeckelter Brut. In weiteren Versuchen lag die Bruttemperatur von toter Brut zwar unter der eines Kontrollbereiches, die Temperatur lag aber weiterhin im optimalen Bereich von 33,5 bis 35°C (Groh et al. 2004). In diesen Versuchen wurde die tote Brut vor dem Einsetzen in den Beobachtungsstock wieder auf 35°C erw{\"a}rmt. Wachskegel in gedeckelten Zellen wurden erkannt und ausger{\"a}umt. Aktive Signale, die von der Brut ausgehen scheinen also nicht notwendig f{\"u}r die effektive Bruttemperaturregulierung zu sein. Untersuchungen mittels Laser-Doppler-Vibrometrie zeigten auch keine Hinweise auf eine mechanische Kommunikation zwischen den Puppen und den Arbeiterinnen. Das Brutw{\"a}rmen scheint eine Aktion zu sein, die von den Bienen nur in Gemeinschaft sinnvoll durchgef{\"u}hrt werden kann. In einigen F{\"a}llen kam es w{\"a}hrend der Puppenphase zu unerkl{\"a}rlichen Abf{\"a}llen in der Bruttemperatur, die nur durch einen positiven R{\"u}ckkopplungseffekt seitens der Arbeiterinnen erkl{\"a}rt werden kann. Beim Brutw{\"a}rmen spielen die Antennen der Arbeiterinnen wahrscheinlich eine wichtige Rolle. W{\"a}hrend sich die Bienen beim aktiven Brutw{\"a}rmen den Brutdeckel ann{\"a}hern sind die Antennenspitzen immer auf die Brutdeckel gerichtet. Fehlen den Arbeiterinnen die Antennen, dann ist die Thermoregulation eingeschr{\"a}nkt oder unzureichend. Die Bruttemperatur korreliert mit der Anzahl der abgetrennten Antennensegmente, je mehr Antennensegmente fehlen, desto weniger gut wird die Temperatur im Brutbereich hoch und konstant gehalten. Zus{\"a}tzlich scheint es eine Lateralit{\"a}t in der Antennenfunktion zu geben, wurde die rechte Antenne gek{\"u}rzt w{\"a}rmten die Bienen die Brut signifikant schlechter, als beim K{\"u}rzen der linken Antenne. Durch das K{\"u}rzen der Antennen {\"a}nderte sich auch das Verhalten der Tiere: Kontrollbienen verharrten ruhig im Brutbereich, w{\"a}hrend Bienen mit gek{\"u}rzten Antennen teilweise {\"a}hnlich warm waren, aber nicht mehr das oben beschriebene aktive Brutw{\"a}rmeverhalten zeigten.}, subject = {Biene}, language = {de} } @phdthesis{Schuetz2005, author = {Sch{\"u}tz, Monika}, title = {Dynamik und Funktion der HMG-Proteine}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15627}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {HMG-Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und regulieren durch ihre Bindung an das Chromatin auf verschiedene Weise DNA-abh{\"a}ngige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Um zu verstehen, wie HMG-Proteine ihre vielf{\"a}ltigen Funktionen erf{\"u}llen k{\"o}nnen, wurde mit Hilfe von EGFP- und DsRed2-Fusionsproteinen ihre Funktion in vivo untersucht. Im Wesentlichen wurde dabei mit Hilfe von Bleichtechniken ihr dynamisches Verhalten charakterisiert. Daneben wurde f{\"u}r die HMGN-Proteine ihr bislang unbekanntes Expressionsverhalten in Tumorzellen bestimmt. So konnte f{\"u}r die HMGN-Proteine gezeigt werden, dass bestimmte Tumorzelllinien (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) eine relativ erh{\"o}hte Expression von HMGN2 aufweisen, die mit der Tumordifferenzierung korreliert. Eine relativ verringerte Expression von HMGN1 steht dagegen in Mammakarzinomen und Non-Hodgkin-Lymphomen in direktem Zusammenhang mit der Aggressivit{\"a}t der Tumore. Somit kann die HMGN-Expression bei diesen Tumoren als diagnostischer Marker verwendet werden. FRAP-Analysen mit EGFP-Fusionsproteinen f{\"u}hrten zu der Erkenntnis, dass HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b und HMGB1 sich sehr schnell durch den Zellkern bewegen und nur transient an das Chromatin gebunden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifischen DNA/Chromatin-Bindungsmotive im Wesentlichen entscheiden, wo die Bindung der HMG-Proteine in vivo erfolgt, ihre Verweildauer im Euchromatin, Heterochromatin und zellzyklusabh{\"a}ngig dann aber durch Modifikationen (Phosphorylierungen, Acetylierungen) reguliert wird. Dies wurde beispielhaft durch punktmutierte und deletierte Fusionsproteine, sowie durch Inkubation der Zellen mit spezifischen Drogen f{\"u}r die HMGA1a-Proteine gezeigt. FRAP-Analysen haben außerdem gezeigt, dass die Spleißvarianten hHMGA1a und hHMGA1b unterschiedliche kinetische Parameter besitzen. Dies zeigt, dass beiden Varianten unterschiedliche Funktionen zugesprochen werden k{\"o}nnen. Die gefundenen spezifischen, transienten Verweildauern der einzelnen HMG-Proteine f{\"u}hren zu einem Modell eines dynamischen Chromatin-Netzwerkes, wobei alle HMG-Proteine in Wechselwirkungen innerhalb eines dynamischen Chromatinprotein-Cocktails DNA-abh{\"a}ngige Prozesse regulieren k{\"o}nnen. Die jeweiligen, wie hier gezeigt, durch Modifikationen regulierten Verweildauern der HMG-Proteine bestimmen dar{\"u}ber, welche anderen Chromatinproteine wie lange am Chromatin verbleiben und bestimmte Funktionen, wie beispielsweise die Modifikation der Core-Histone, {\"u}bernehmen k{\"o}nnen. Die dynamischen Parameter einzelner HMG-Proteine erkl{\"a}ren so, wie diese Proteine ihre vielf{\"a}ltigen Funktionen als Architekturelemente und bei der Regulation DNA-abh{\"a}ngiger Prozesse erf{\"u}llen k{\"o}nnen. Einige Vertreter, wie die HMGB1-Proteine, bewegen sich so schnell durch den Zellkern, dass ihre kinetischen Parameter durch das beschr{\"a}nkte zeitliche Aufl{\"o}sungsverm{\"o}gen konfokaler Mikroskope der {\"a}lteren Generation nicht erfassbar sind. Die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Drogen, welche die kinetischen Parameter von HMGB1-Proteinen beeinflussen k{\"o}nnen, ist inzwischen mit Mikroskopen der neuen Generation m{\"o}glich. Im Verlaufe der Arbeit zeigte sich, dass andere verwendete Fluorophore wie DsRed2 die kinetischen Eigenschaften von HMG-Fusionsproteinen beeinflussen k{\"o}nnen. Durch eine erh{\"o}hte Verweildauer k{\"o}nnen auch sehr transiente Interaktionen sichtbar gemacht werden. Wie gezeigt wurde, kann eine erh{\"o}hte Verweildauer aber auch zur Verdr{\"a}ngung anderer Proteine f{\"u}hren, die die gleichen Bindungsstellen benutzen und so eine Modulation des Chromatins bewirken. Die Nutzung von DsRed-Fluorophoren erm{\"o}glicht interessante neue Erkenntnisse. Diese m{\"u}ssen aber stets vor dem Hintergrund eines ver{\"a}nderten dynamischen Verhaltens der Fusionsproteine interpretiert werden. Zusammengenommen liefern die hier vorgestellten Ergebnisse zur Dynamik der HMG-Proteine grundlegende Informationen, die zur Kl{\"a}rung ihrer Funktion bei Chromatinmodulationen, etwa bei Differenzierungsprozessen oder der Entstehung von Tumorzellen entscheidend beitragen. Die Erkenntnis, dass diese Proteine lediglich transiente Interaktionen mit ihren Bindungspartnern eingehen k{\"o}nnen, sind im Hinblick auf die Behandlung von Tumoren, bei denen HMG-Proteine im Vergleich zu Normalgewebe h{\"a}ufig {\"u}berexprimiert sind, von großer Bedeutung.}, subject = {HMG-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Mai2005, author = {Mai, Nikola}, title = {Expression und Isolierung des BMP-bindenden Proteins Ep45}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15311}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Die BMPs (Bone morphogenetic proteins) sind Zytokine, die in fast allen Tieren exprimiert werden und zur TGF-\&\#946; Superfamilie geh{\"o}ren. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Knochenentwicklung, unter anderem auf Grund ihrer F{\"a}higkeit, die Neubildung von Knochen auszul{\"o}sen. Eine weitere Aufgabe der BMPs liegt in der Beeinflussung der Embryogenese. Hier tragen sie zur Differenzierung der einzelnen Keimbl{\"a}tter bei und werden w{\"a}hrend der Organogenese in vielen Organanlagen exprimiert. Ep45, ein Protein aus Xenopus laevis, geh{\"o}rt zur Familie der Serinproteaseinhibitoren und ist ein extrazellul{\"a}rer Ligand von BMP4, ohne jedoch dessen Rezeptorbindung bzw. dessen Aktivit{\"a}t zu beeinflussen. Ep45, auch bekannt unter dem Namen pNiXa, wird in der Embryogenese von Xenopus laevis wirksam: Es induziert die Reifung von Oozyten, kann im weiteren Verlauf in verschiedenen Organanlagen nachgewiesen werden und wird in Zusammenhang gebracht mit Teratogenit{\"a}t, die durch Ni2+ hervorgerufen wird. Um auf die aufwendige Isolierung von Ep45 aus Xenopus-Oozyten bzw. -Embryonen verzichten zu k{\"o}nnen, sollte in dieser Arbeit eine Methode zur rekombinanten Expression und Isolierung von aktivem Ep45 entwickelt werden. Zun{\"a}chst wurde die Expression von Ep45 in E. coli als l{\"o}sliches Einzelprotein mit dem Vektor pET25b(+) angestrebt. Da sich jedoch zeigte, dass das Protein zum Großteil als unsl{\"o}sliche Aggregate in Form von inclusion bodies vorlag, wurden diese pr{\"a}pariert, denaturiert und eine Isolierung von Ep45 durch verschiedene Chromatographie-Verfahren (Kationenaustauschers{\"a}ule, Gelchromatographie) unternommen. Durch die nachfolgenden Renaturierungsversuche konnte jedoch kein aktives Protein gewonnen werden. Zum Nachweis von aktivem Ep45 dienten ein Enzymassay, der auf der Serinproteaseinhibitor-Funktion von Ep45 beruht, sowie ein Bindungsassay. Dieser weist den Ep45-Chymotrypsin-Komplex nach, der bei der Inhibition von Chymotrypsin durch Ep45 entsteht. Als alternatives Expressionssystem kam deshalb das pMal™-Fusionsprotein-System zur Anwendung. Dazu wurde Ep45 an MBP gekoppelt, so dass eine Aufreinigung mittels Chromatographie an einer Amyloses{\"a}ule m{\"o}glich werden sollte. Nach Spaltung durch Faktor Xa sollten die beiden Proteine durch Chromatographie voneinander getrennt werden, so dass schließlich Ep45 als reines aktives Protein vorliegt. Trotz des Einsatzes diverser Chromatographie-Verfahren (Ionentauschers{\"a}ule, hydrophobe S{\"a}ule, Nickels{\"a}ule) gelang keine Isolierung von Ep45. Da in E. coli zwar eine Expression jedoch keine Aufreinigung von aktivem Ep45 gelang, wurde ein Expressionssystem unter Verwendung von Sf9-Zellen (Insektenzellen) eingesetzt. Nach Herstellung des Plasmids pIZT/V5-xEp45 wurden Versuche zur transienten Expression von Ep45 in Sf9-Zellen mittels des InsectSelect™ Systems durchgef{\"u}hrt, die bis zum Abschluss meiner praktischen Arbeit nicht zum Erfolg f{\"u}hrten, aber innerhalb der Arbeitsgruppe weiter bearbeitet werden.}, language = {de} } @phdthesis{Williams2005, author = {Williams, Tatjana}, title = {Untersuchungen zur Rolle des Phosphoproteins Stathmin in Listeria monocytogenes-infizierten S{\"a}ugerzellen und Molekulare Charakterisierung der listeriellen Zweikomponetensysteme}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15388}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Das fakultativ intrazellul{\"a}re Bakterium Listeria monocytogenes besitzt die F{\"a}higkeit, eukaryotische Wirtszellen zu penetrieren, sich in diesen zu vermehren, fortzubewegen und zwischen den Zellen auszubreiten. Im Zuge des intrazellul{\"a}ren Lebenszyklus gehen Listerien Wechselwirkungen mit ver-schiedenen zellul{\"a}ren Proteinen ein. Als eines dieser Proteine konnte das zellul{\"a}re Phosphoprotein Stathmin identifiziert werden. Dieses Protein bindet an Untereinheiten des Tubulins und destabilisiert dadurch Mikrotubuli (MT). Es wird durch Phosphorylierung von vier spezifischen Serinresten in seiner MT-destabilisierenden Aktivit{\"a}t reguliert. Da Stathmin als Antwort auf externe Signale zellul{\"a}re Funktionen, z. B. Zell-Proliferation und Differenzierung reguliert, vermutet man seine Funktion in einer Art Relais welches verschiedene Signale aus dem Umfeld der Zelle integriert. In mit L. monocytogenes infizierten Wirtszellen wird Stathmin an die Oberfl{\"a}che intrazellul{\"a}rer Bakterien rekrutiert. Inwiefern diese Rekrutierung das Phosphorylierungsmuster von Stathmin und damit dessen Aktivit{\"a}t beeinflusst, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht gekl{\"a}rt werden. Stathmin knock-out M{\"a}use sollten sich gut eignen, um die Rolle von Stathmin w{\"a}hrend einer Infektion mit L. monocytogenes EGD in vitro und in vivo zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass in Stathmin(-/-)-Makrophagen der intrazellul{\"a}re Lebenszyklus der Listerien nicht signifikant beeinflusst ist. Nach intraven{\"o}ser Verabreichung von 5x103 L. monocytogenes waren drei Tage nach der Infektion in Leber und Milz der knock-out M{\"a}use allerdings signifikant mehr Listerien nachzuweisen, als in den Organen wildtypischer M{\"a}use. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und einem anti-Stathmin-Antiersum konnte an mit verschiedenen L. monocytogenes-Mutanten infizierten Zellen gezeigt werden, dass Stathmin mit der Oberfl{\"a}che intrazellul{\"a}rer Listerien kolokalisiert. Allerdings konnten dabei die Angaben in der Literatur nicht best{\"a}tigt werden, wonach f{\"u}r diese Kolokalisation die Expression von ActA notwendig ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Gegensatz zu den publizierten Daten daf{\"u}r, dass Stathmin {\"u}ber einen bisher noch unbekannten Mechanismus ActA-unabh{\"a}ngig an intrazellul{\"a}re Listerien rekrutiert wird. Zweikomponentensysteme erm{\"o}glichen Bakterien eine rasche Anpassung an sich ver{\"a}ndernde Umweltbedingungen, da sie extra- und intrazellul{\"a}re Stimuli in zellul{\"a}re Signale umwandeln. Um die 16 in der Genomsequenz von L. mono-cytogenes EGDe identifizierten Zweikomponentensysteme charakterisieren zu k{\"o}nnen, wurden individuelle Mutanten konstruiert, in denen individuelle Response Regulatorgene deletiert sind. Die erhaltenen Mutanten wurden in vitro und in vivo auf ihr Wachstumsverhalten hin untersucht. Es zeigte sich, dass unter den angewandten Kultur- und Versuchsbedingungen keines der Zweikomponentensysteme eine signifikante Rolle bei der Anpassung an Temperatur, sowie an oxidativen oder osmotischen Stress spielt. Die Zugabe von 5 \% Ethanol hatte einen stark hemmenden Effekt auf das Wachstum von 4 Mutanten, wohingegen zwei andere Mutanten in Gegenwart des Alkohols deutlich besser wuchsen. Unter anaeroben Bedingungen konnte kein Unterschied im Wachstum beobachtet werden. Die Expression wichtiger Virulenzgene war in keiner der untersuchten Mutanten im Vergleich zum Ausgangsstamm ver{\"a}ndert. Die intrazellul{\"a}re Replikation sowie intrazellul{\"a}re Bewegung und Ausbreitung im Zellrasen waren durch die Deletion der Response Regulatorgene nicht beeintr{\"a}chtigt. Abgesehen von geringen Unterschieden in der Invasivit{\"a}t einiger Deletionsmutanten f{\"u}r Cos-1 und Caco-2 Zellen zeigte sich keiner der Response Regulatoren f{\"u}r den intrazellul{\"a}ren Lebenszyklus von L. monocytogenes erforderlich. Es zeigte sich, dass der in der vorliegenden Arbeit verwendete L. monocyto-genes-Wildstamm auch bei der f{\"u}r die Flagellenexpression normalerweise nicht-permissiven Temperatur von 37° C noch beweglich ist. Die L. monocytogenes \&\#916;degU-Mutante war dagegen auf Weichagar temperaturunabh{\"a}ngig unbeweglich. Die elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass dieser Stamm im Gegensatz zum Wildtyp auch bei 24° C keine Flagellen ausbildet. Durch vergleichende Proteomanalysen konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes \&\#916;degU bei 24° C wesentliche Proteine des Flagellenapparates nicht synthetisiert. Mittels Transkriptomanalysen konnten die Ergebnisse der Proteomanalysen best{\"a}tigt werden. Es wurden neben Genen, die f{\"u}r Proteine der Flagellenbiosynthese und Chemotaxis codieren, noch weitere Gene identifiziert, die offensichtlich unter der transkriptionellen Kontrolle des Response Regulators DegU stehen. Die Ergebnisse der in vivo Studien zeigten, dass L. monocytogenes \&\#916;degU deutlich virulenzattenuiert ist. F{\"u}r die restlichen L. monocytogenes \&\#916;TCS-Mutanten waren im Vergleich zum Wildtyp die Unterschiede in Leber und Milz nur leicht ver{\"a}ndert und statistisch nicht signifikant.}, subject = {Phosphoproteine}, language = {de} } @phdthesis{Schrama2004, author = {Schrama, David}, title = {T-Zell-priming außerhalb sekund{\"a}rer lymphatischer Gewebe}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15060}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {T-Zellimmunantworten werden normalerweise durch folgenden Weg initiiert: unreife dendritische Zellen nehmen Antigen in der Peripherie auf, wandern in die sekund{\"a}ren lymphatischen Organe, wobei sie auf ihrem Weg sowohl reifen als auch das Antigen prozessieren. In den sekund{\"a}ren lymphatischen Organen angekommen, pr{\"a}sentieren sie als reife dendritische Zellen den T-Zellen die Antigene in Form von Peptiden zusammen mit kostimulierenden Molek{\"u}len. Dadurch rufen sie eine spezifische T-Zellantwort hervor. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob nicht Situationen herbeigef{\"u}hrt werden k{\"o}nnen, die ein T-Zell priming außerhalb der sekund{\"a}ren lymphatischen Organe erlauben. Dazu wurden ein murines Modell, bei dem das Zytokin Lymphotoxin-alpha spezifisch am Tumor angereichert wurde, und ein humanes Modell, bei dem reife, antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden, untersucht. Im murinen Modell zeigte sich, dass die gerichtete Anreicherung von Lymphotoxin-alpha am Tumor zu dessen Zerst{\"o}rung f{\"u}hrte, welche durch T-Zellen vermittelt wurde, und mit der Induktion eines terti{\"a}ren lymphatischen Gewebes am Tumor assoziiert war. Dieses terti{\"a}re lymphatische Gewebe war durch die Kompartimentalisierung von T- und B-Zellen und der Pr{\"a}senz von high endothelial venules charakterisiert und besaß zudem mit dendritischen Zellen und na{\"i}ven T-Zellen alle Voraussetzungen f{\"u}r ein in loco priming. Dementsprechend konnte in der Folge der gerichteten Lymphotoxin-alpa Therapie im Tumor ein Anstieg am T-Zellinfiltrat, welches sich oligoklonal zusammensetzte, beobachtet werden. In vitro Experimente verdeutlichte die Tumorspezifit{\"a}t der Therapie-induzierten T-Zellantwort, da die T-Zellen auf ein Tumorantigen mit der Aussch{\"u}ttung von Interferon gamma reagierten und die Tumorzellen lysierten. Im humanen Modell wurden Hautbiopsien von Melanompatienten untersucht, denen im Rahmen einer klinischen Studie autologe, in vitro generierte und antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden. Die Patienten erlaubten die Entnahme von Hautbiopsien aus den Injektionsstellen f{\"u}r wissenschaftliche Untersuchungen. Eine Induktion bzw. Verst{\"a}rkung einer spezifischen T-Zellantwort durch die Vakzinierung mit antigenbeladenen dendritischen Zellen konnte bereits in zahlreichen Arbeiten und auch in dem in dieser Arbeit untersuchten Patientenkollektiv gezeigt werden. Bei der Analyse der Injektionsstellen zeigt sich, dass ein großer Teil der injizierten dendritischen Zellen in der Vakzinierungsstelle verharren und dass diese unabh{\"a}ngig von einer Beladung mit Antigen zu einer Induktion von high endothelial venules Charakteristika f{\"u}hrte. Waren die dendritischen Zellen mit Antigen beladen, so f{\"u}hrte dies zu einem st{\"a}rkeren T-Zellinfiltrat in den Injektionsstellen, wobei sowohl na{\"i}ve als auch central memory T-Zellen nachgewiesen wurde. Diese Zellen wurden vermutlich durch die {\"U}berexpression der DC CK1 und SDF1 Chemokinen in den Injektionsstellen, die chemotaktisch auf T-Zellen wirken, angezogen. Das Infiltrat in den Injektionsstellen war oligoklonal und wies tumorspezifische T-Zellen auf. Nachdem diese T-Zellklone im Blut der Patienten vor der Vakzinierung nicht nachweisbar waren, m{\"u}ssen sie zumindest in den Injektionsstellen expandiert sein. Interessanterweise konnte einer dieser Klone in Metastasen nachgewiesen werden, die nach der Vakzinierung dem Patienten entfernt wurden. In beiden Modellen wurde also durch die Manipulation des Mikromilieus, d.h. Lymphotoxin-alpa Anreicherung am Tumor bzw. Injektion von reifen dendritischen Zellen in die Haut, Strukturen wie z.B. high endothelial venules induziert, die ein in loco priming erm{\"o}glichen sollten. Dementsprechend riefen diese Ver{\"a}nderungen ein Tumorantigen-spezifisches Infiltrat hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zell priming auch außerhalb sekund{\"a}rer lymphatischer Organe erfolgen kann. Prinzipiell scheint also nur der Kontakt von reifen, antigenbeladenen dendritischen Zellen mit den entsprechenden antigenspezifischen, na{\"i}ven T-Zellen entscheiden zu sein. Die M{\"o}glichkeit des in vitro primings bekr{\"a}ftigt diese These. In vivo erfolgt dieses Aufeinandertreffen normalerweise in den sekund{\"a}ren lymphatischen Organen, doch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Ver{\"a}nderungen des Mikromilieus diesen Kontakt auch in anderen Geweben erm{\"o}glicht.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{Rock2005, author = {Rock, Rebecca}, title = {Charakterisierung des Vertebraten-Gens four-jointed x1 (fjx1) und Analyse des planaren Zellpolarit{\"a}tssignalwegs (PCP-Signalweg)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14815}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Das four-jointed (fj) Gen in Drosophila ist zum einen am proximo-distalen L{\"a}ngenwachstum der Extremit{\"a}ten beteiligt, zum anderen spielt es auch eine Rolle in dem in neuerer Zeit verst{\"a}rkt untersuchten planaren Zellpolarit{\"a}tssignalweg (PCP-Signalweg). {\"U}ber das in der Maus identifizierte homologe fjx1 Gen ist dagegen vergleichsweise wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war daher die n{\"a}here Charakterisierung von fjx1 sowie die Identifizierung m{\"o}glicher Interaktionspartner. Durch RNA in situ Hybridisierung wurde zun{\"a}chst das r{\"a}umliche und zeitliche Expressionsmuster von fjx1 in Embryonen und adulten Organen untersucht. Dabei zeigte sich, dass fjx1 in allen Stadien vor allem im Gehirn, aber auch in epithelialen Strukturen verschiedener Organe exprimiert war. Obwohl die Expression von fjx1 ebenso wie die von fj {\"u}ber den Notch-Signalweg reguliert wird, konnte im Gegensatz zu Drosophila jedoch keine Regulation von fjx1 {\"u}ber den Wnt- und/oder den JAK/STAT-Signalweg nachgewiesen werden. Da Fj in Drosophila zumindest teilweise sezerniert wird und nicht-zellautomome Effekte zeigt, wurde ein Fjx1-Rezeptor gesucht. Mit Hilfe eines Fjx1-AP Fusionsproteins konnten Bindungsstellen {\"u}berlappend bzw. angrenzend zu Regionen mit fjx1-Expression gefunden werden. Beispielsweise zeigten in der embryonalen Lunge und der Niere sowohl die in situ Hybridisierung (fjx1-Expression) als auch die Inkubation mit dem Fusionsprotein (Lokalisation des Bindungspartners) F{\"a}rbung in epithelialen Strukturen, w{\"a}hrend im adulten Gehirn die F{\"a}rbungen in jeweils benachbarten Schichten des Hippocampus und des Kleinhirns detektiert wurden. Durch Expressionsklonierung bzw. Coimmunpr{\"a}zipitation konnte der Rezeptor jedoch nicht identifiziert werden. Aufgrund der Tatsache dass fj in Drosophila in enger Beziehung zu dachsous (ds) und fat (ft) steht, wurden die homologen Gene in der Maus gesucht und deren Expressionsmuster analysiert. In Embryonalstadien war dchs1 komplement{\"a}r zu fjx1 in mesenchymalen Geweben zu finden, {\"a}hnlich der Situation in Drosophila, wo fj und ds in gegenl{\"a}ufigen Gradienten exprimiert sind. Das homologe Gen von ft, fat-j, war hingegen nicht ubiquit{\"a}r exprimiert, sondern wie dchs1 im Mesenchym. Erg{\"a}nzend dazu wurden die fat-like (ftl) Homologen, fat1-3, epithelial detektiert. Die Expression in adulten Organen wurde mit Real-Time-PCR untersucht, die zeigte, dass alle Gene (fj, ds und fat Homologe) relativ stark im adulten Gehirn zu finden sind. Mit Hilfe von RNA in situ Hybridisierungen konnten die Gene im Riechhirn, im Hippocampus und im Kortex des Großhirns sowie in der K{\"o}rnerschicht des Kleinhirns lokalisiert werden. Um Hinweise auf die Funktion von Fjx1 zu erhalten, wurde in Datenbanken nach Proteinen mit {\"a}hnlicher Aminos{\"a}uresequenz gesucht, die eventuell Auskunft {\"u}ber m{\"o}gliche Proteindom{\"a}nen geben sollten. Bei den gefundenen f{\"u}nf Mausproteinen handelte es sich jedoch um hypothetische bzw. noch nicht untersuchte Proteine, so dass R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Funktion von Fjx1 nicht m{\"o}glich waren. Die Expression dieser Gene war nach Datenbankangaben entweder sehr spezifisch, beschr{\"a}nkt auf ein bestimmtes Gewebe (z.B. Milchdr{\"u}se oder Nebenniere) oder schwach und daf{\"u}r ubiquit{\"a}r, was sich auch durch eine schwache, einheitliche F{\"a}rbung in der RNA in situ Hybridisierung best{\"a}tigte. Die Proteinstruktur von Fjx1 und der Fjx1-{\"a}hnlichen Proteine sowie die Art der konservierten Reste geben Grund zu der Annahme, dass es sich um (sezernierte) Glykosyltransferasen handeln k{\"o}nnte, was durch die zumindest zeitweise Lokalisation von Fjx1 im Golgi-Apparat best{\"a}rkt wird. Auch die in Drosophila gefundenen Ergebnisse sprechen f{\"u}r eine derartige Funktion von Fj, obwohl auch hier noch keine konkreten biochemischen Belege vorliegen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine Konservierung des in Drosophila entdeckten Fj/Ds/Ft-Siganlwegs in Vertebraten hin, wenn auch der genaue Mechanismus der Interaktion zwischen den Proteinen noch nicht gekl{\"a}rt ist und weiterer Untersuchungen bedarf.}, language = {de} } @phdthesis{Pick2004, author = {Pick, Simon}, title = {Kinematik und visuelle Steuerung des Kletterverhaltens und der Beinplatzierung der Fliege Drosophila melanogaster und {\"U}bertragung auf die Robotik}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12737}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Im Rahmen dieser Arbeit wurden visuelle Einfl{\"u}sse auf die Beinplatzierung beim Laufen und auf das Kletterverhalten der Fliege Drosophila melanogaster analysiert. W{\"a}hrend sich die Beinplatzierung als vorwiegend taktil gesteuert herausstellte, ist das Klettern sowohl bez{\"u}glich der Entscheidung zur Durchf{\"u}hrung (Motivationssteuerung) als auch bez{\"u}glich der Ausf{\"u}hrung selbst unter pr{\"a}ziser visueller Kontrolle. F{\"u}r die Untersuchungen wurde ein L{\"u}cken-{\"U}berwindungsparadigma entwickelt und die Kinematik des Kletterns {\"u}ber verschieden breite L{\"u}cken mit einer eigens entwickelten 3D-Hochgeschwindigkeits-Videoanlage erstmals quantitativ beschrieben. Drei wesentliche Verhaltensanpassungen sorgen daf{\"u}r, dass die Fliegen die maximal m{\"o}gliche Spannbreite ihrer Beine voll ausn{\"u}tzen und L{\"u}cken von bis zu 170\% der eigenen K{\"o}rperl{\"a}nge {\"u}berqueren k{\"o}nnen. Das Kletterverhalten wird abh{\"a}ngig von der L{\"u}ckenbreite initiiert und sinnlose Versuche an un{\"u}berwindbar breiten L{\"u}cken vermieden. Die visuelle L{\"u}ckenbreitenmessung wurde analysiert; sie beruht auf der Auswertung von Bewegungsparallaxe beim Anlauf. Einige Erkenntnisse aus der Laufforschung an Fliegen wurden auf einem im Rahmen dieser Arbeit modifizierten hexapoden Laufroboter umgesetzt und die Verbesserungen quantifiziert.}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @phdthesis{Stuebs2004, author = {St{\"u}bs, Dorothee}, title = {Identifizierung und Regulation von k{\"a}lteinduzierbaren Faktoren aus B. bronchiseptica}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12704}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {K{\"a}lteschockproteine werden in Bakterien, gleichermaßen wie die gut charakterisierten Hitzeschockproteine, bei hohen Temperaturschwankungen stark induziert und erm{\"o}glichen der Zelle durch unterschiedliche Funktionen ein Wachstum in der K{\"a}lte. In dieser Promotionsarbeit wurde begonnen, die K{\"a}lteschock-Antwort von Bakterien des Genus Bordetella zu charakterisieren. Sowohl B. bronchiseptica als auch B. pertussis codieren f{\"u}r f{\"u}nf K{\"a}lteschockproteine, die als CspA, CspB, CspC, CspD und CspE bezeichnet werden. Die f{\"u}nf Proteine weisen eine signifikante Homologie zum Haupt-K{\"a}lteschockprotein CspA aus E. coli auf. W{\"a}hrend in den Modellorganismen E. coli und B. subtilis mindestens vier (E. coli) bzw. alle drei (B. subtilis) csp-Gene deletiert sein m{\"u}ssen, um einen Wachstumsdefizit zu erkennen, gen{\"u}gt im Falle von B. bronchiseptica eine einzige Insertionsmutation im Gen cspB, um einen temperaturunabh{\"a}ngigen Wachstumsdefekt zu beobachten. Nach einem K{\"a}lteschock werden in B. bronchiseptica drei der f{\"u}nf csp-Gene, cspA, cspB und cspC, deutlich induziert. Betrachtet man das Expressionsmuster der f{\"u}nf csp-Gene unter verschiedenen Stressbedingungen, wie Zugabe von translationshemmenden Antibiotika, Hitzeschock oder osmotischer Stress, so l{\"a}sst sich ein komplexes Expressionsmuster aufzeichnen. Außerdem besitzen die drei k{\"a}lteinduzierbaren Gene cspA, cspB und cspC mehrere Transkriptionsstartpunkte, deren Transkriptmengen unter den verschiedenen Schockbedingungen stark variieren. Es stellte sich heraus, dass eine {\"U}berexpression von CspB aus B. bronchiseptica f{\"u}r die E. coli - Zelle toxisch ist, daher wurde das CspB-Protein als GST-Fusionsprotein exprimiert und {\"u}ber Glutathion-Sepharose aufgereinigt. Um eine potentielle Funktion von CspB in der Zelle zu untersuchen, wurden Filterbindeassays mit CspB::GST durchgef{\"u}hrt. Es wurde eine hochaffine, aber unspezifische Bindung an ssDNA festgestellt, was auf eine m{\"o}gliche Funktion von CspB als Chaperon hindeutet. Nach Synthese eines CspB-spezifischen Antik{\"o}rpers wurde die K{\"a}lteinduktion von CspB auch auf Proteinebene nachgewiesen. Durch 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrische Charakterisierung konnten 17 weitere k{\"a}lteinduzierbare Proteine aus B. bronchiseptica identifiziert werden. Darunter waren u. a. ein Chaperon mit {\"A}hnlichkeit zu GroES, ein Translationsinhibitor BB2940 und das CspB. Diese k{\"a}lteinduzierbaren Proteine {\"a}hneln den CIPs aus E. coli. Weiterhin konnten noch das UspA und mehrere am Metabolismus beteiligte Proteine als CIPs aus B. bronchiseptica identifiziert werden, was signifikante Unterschiede in Bezug auf die K{\"a}lteadaptation zwischen den beiden Organismen aufzeigt. Betrachtet man die Promotorbereiche aller identifizierten csp-Gene, so f{\"a}llt eine f{\"u}r diese Gene typische sehr lange 5'UTR auf. Innerhalb dieser upstream Region findet man in vier der f{\"u}nf csp-Gene einen 9 bp langen Consensus mit der Sequenz TCCTTGATT, der in nahezu gleichem Abstand vom postulierten Startcodon vorkommt. Diese identifizierte 9bp-box ist f{\"u}r eine effiziente Transkription in der K{\"a}lte jedoch nicht von Bedeutung. Auf posttranskriptioneller Ebene wird die lange 5'UTR f{\"u}r die Stabilisierung der cold-shock mRNA in der K{\"a}lte verantwortlich gemacht. Außerdem ist das Vorhandensein der kompletten 5'UTR essentiell f{\"u}r eine effiziente Translation bei niedriger Temperatur, wobei eine Mutation der 9bp-box einen geringen, aber signifikanten negativen Effekt auf die Translation aus{\"u}bt. Sechs Gene, der neu identifizierten CIPs, beinhalten ebenfalls eine 9bp-box in ihrer upstream Region. Interessanterweise werden zwei der f{\"u}nf csp-Gene, cspC und cspD, vom BvgAS Zweikomponentensystem, dem Haupttranskriptionsregulator der Virulenzgene im Genus Bordetella, reguliert. Die beiden Gene geh{\"o}ren zu den Bvg-negativ regulierten Genen, die in der Bvg-minus-Phase exprimiert werden. Weiterhin beeinflusst eine leichte {\"U}berexpression von CspB aus B. pertussis die Expression der Adenylatzyklase sowohl in B. pertussis, als auch in B. bronchiseptica negativ. Dieser f{\"u}r das CspB spezifische Effekt erinnert an das strukturell verwandte Tex-Protein (Fuchs et al, 1996; K{\"o}nig et al, 2002). Beide Proteine beeinflussen die Expression der Virulenzfaktoren negativ, wobei f{\"u}r CspB gezeigt werden konnte, dass es einen direkten Einfluss auf die verminderte cyaA-Expression auf Transkriptionsebene besitzt. Dies zeigt eine Verbindung der K{\"a}lteschockantwort mit dem Virulenz-Regulon der Bordetellen, deren Rolle im Infektionszyklus bislang ungekl{\"a}rt ist.}, subject = {Bordetella bronchiseptica}, language = {de} } @phdthesis{Keller2004, author = {Keller, Sascha}, title = {Struktur- und Funktionsanalysen an BMP Ligand-Rezeptor-Komplexen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12467}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {F{\"u}r BMPs wie auch die anderen Mitglieder der TGF-beta-Superfamilie beginnt der Signalweg mit der Bindung des Liganden an zwei Typen transmembran{\"a}rer Rezeptoren. Die Ligand-Rezeptor Interaktionen sind dabei durch unterschiedliche Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t gekennzeichnet und bilden wahrscheinlich die Grundlage f{\"u}r das breite Spektrum biologischer Funktionen. In dieser Arbeit wurde mittels einer Struktur- und Funktionsanalyse von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen die molekulare Basis f{\"u}r die Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t dieser Wechselwirkungen untersucht. Hierf{\"u}r wurde die Kristallstruktur des BMP-2 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplexes bei einer Aufl{\"o}sung von 1,9{\AA} ermittelt. Mit der h{\"o}heren Aufl{\"o}sung war die Charakterisierung der geometrischen Parameter eines Netzwerks von zehn Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen in der Interaktionsfl{\"a}che zwischen BMP-2 und BR-IAec m{\"o}glich. Deren zentrale Bedeutung f{\"u}r dieWechselwirkung konnte auch durch funktionelle Analyse best{\"a}tigt werden. So stellen die im Zentrum der Bindungsfl{\"a}che liegenden Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen BMP-2 Leu51 (N) : BR-IAec Gln86 (OE1) und BMP-2 Leu51 (O) : BR-IAec Gln86 (NE1), sowie die BMP-2 Asp53 (N) : BR-IAec Cys77 (O) H-Br{\"u}cke die Hauptdeterminanten der Ligand-Rezeptor Bindung dar. Dar{\"u}ber hinaus ließ sich aus der strukturellen Analyse des "wrist"-Epitops von BMP-2 eine besondere Bedeutung der Pr{\"a}-Helix Schleife L2, sowie der im Kontakt eingeschlossenen Wassermolek{\"u}le f{\"u}r die Anpassung der Bindungsfl{\"a}che an unterschiedliche Interaktionspartner ableiten. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage f{\"u}r ein neues Modell zur Beschreibung von Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t der hochaffinen BMP-Typ I Rezeptor Interaktion. Dabei stellen die Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen den Hauptanteil zur Bindungsenergie, w{\"a}hrend die hydrophobe Umgebung in der Interaktionsfl{\"a}che die Bildung von Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen energetisch beg{\"u}nstigen und hydrophobe Wechselwirkungen nur geringf{\"u}gigen Einfluss auf die Affinit{\"a}t nehmen. Die vorliegenden Arbeit beschreibt zudem die Pr{\"a}paration und Kristallisation von bin{\"a}ren Ligand-Typ I Rezeptor Komplexen f{\"u}r BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie die der tern{\"a}ren Komplexe von BMP-2, BR-IAec und ActR-IIec bzw. BR-IIec. Die extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der hierf{\"u}r verwendeten Rezeptoren wurden durch Expression in E.coli oder Sf-9 Insektenzellen erhalten. Ihre funktionelle Charakterisierung erfolgte durch BIAcore Interaktionsanalyse an immobilisierten Liganden, wobei in Abh{\"a}ngigkeit vom Ligand-Rezeptor Komplex unterschiedliche Affinit{\"a}ten ermittelt werden konnten. In {\"U}bereinstimmung mit den hierbei erhaltenen Daten wurden die Ligand-BMP Typ IB Rezeptor Komplexe f{\"u}r BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie der GDF-5 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplex pr{\"a}pariert. Des Weiteren konnte die Bildung des tern{\"a}ren BMP-2 : BR-IAec : ActR-IIec Ligand-Rezeptor Komplexes in L{\"o}sung nachgewiesen werden. F{\"u}r all diese Komplexe konnten Kristallisationsbedingungen ermittelt werden. Trotz Optimierung dieser Bedingungen reichte die Qualit{\"a}t der erhaltenen Kristalle nicht f{\"u}r eine Aufkl{\"a}rung der Struktur aus. F{\"u}r eine detailliertes Verst{\"a}ndnis der Mechanismen der Rezeptoraktivierung muss die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen fortgef{\"u}hrt werden. Die pr{\"a}sentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass {\"u}ber die Kenntnis der einzelnen Affinit{\"a}ten und die gezielte Modifikation der Interaktionspartner eine erfolgreiche Strukturanalyse dieser Ligand-Rezeptor Komplexe m{\"o}glich ist.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Mronz2004, author = {Mronz, Markus}, title = {Die visuell motivierte Objektwahl laufender Taufliegen (Drosophila melanogaster) - Verhaltensphysiologie, Modellbildung und Implementierung in einem Roboter}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11748}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Im Rahmen dieser Arbeit wurden offene Fragen zur Objektwahl, zur Objektbeibehaltung und zur Aufgabe von Zielobjekten bei laufenden Taufliegen (Drosophila melanogaster) untersucht. Die Erkenntnisse zur Objektwahl wurden als kybernetisches Modell formuliert, auf einem eigens daf{\"u}r konstruierten, autonom navigierenden Roboter mit Kameraauge implementiert und dessen Verhalten bei verschiedenen Landmarkenkonstellationen quantitativ mit dem Orientierungsverhalten laufender Fliegen verglichen. Es war bekannt, dass Drosophila in einer Wahlsituation zwischen unterschiedlich weit entfernten Objekten eine ausgepr{\"a}gte Pr{\"a}ferenz f{\"u}r nahe Objekte zeigt, wobei die Entfernung {\"u}ber das Ausmaß der retinalen Bildverschiebung auf dem Auge (Parallaxe) erfasst wird. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob die Parallaxe streng aus der Eigenbewegung der Fliege resultieren muss oder ob Eigenbewegung der Objekte N{\"a}he vort{\"a}uschen und deren Attraktivit{\"a}t erh{\"o}hen kann. Es wurde gezeigt, dass die Pr{\"a}ferenz f{\"u}r ein Objekt bei Drosophila umso gr{\"o}ßer wird, je mehr Bewegung dessen Abbild auf der Retina erzeugt; die relative Verschiebung des Objektabbildes muss dabei nicht mit der Eigenbewegung der Fliege gekoppelt sein. {\"U}berraschenderweise verschwand die Pr{\"a}ferenz f{\"u}r nahe Objekte, wenn eine zusammenstehende Gruppe aus einer nahen und mehreren fernen Objekten pr{\"a}sentiert wurden, solange sie zusammen einen Sehwinkel von weniger als etwa 90° einnahmen. Diese Beobachtung ist konform mit einer Vorstellung, wonach Bewegung {\"u}ber gr{\"o}ßere Augenbereiche integriert und nicht einzelnen Objekten zugeordnet wird. Obwohl Drosophila bei gleichem Pr{\"a}sentationsort auf der Retina die gr{\"o}ßere parallaktische Bewegung bevorzugte, wurden bei gleicher Entfernung dennoch frontalere gegen{\"u}ber lateraleren Objekten bevorzugt. Es wird postuliert, dass der frontale und der caudale Sehbereich eine Verst{\"a}rkung erfahren, die die physikalisch bedingt geringere Parallaxe {\"u}berkompensiert. Laufende Fliegen reagieren verz{\"o}gert auf die Pr{\"a}sentation eines Objekts; dies wird im Sinne einer zeitlichen Bewegungsintegration interpretiert. Die darauf folgende Richtungs{\"a}nderung h{\"a}ngt vom Pr{\"a}sentationswinkel des Objektes ab. Erscheint das Objekt frontolateral, findet eine Hinwendung statt, erscheint es caudolateral, kommt es bevorzugt zur Abwendung. Eine weitere wichtige kognitive Leistung der Fliege ist das Aufgeben eines zuvor ausgew{\"a}hlten Ziels, wenn sich dieses Ziel w{\"a}hrend des Anlaufs als unerreichbar herausstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Fliegen mit stark reduzierten Pilzk{\"o}rpern erheblich mehr Zeit ben{\"o}tigen als wildtypische Fliegen, um vom gew{\"a}hlten Zielobjekt abzulassen. Dieser dem Perseveranzverhalten bei Parkinson-kranken Menschen {\"a}hnliche Ph{\"a}notyp wurde unabh{\"a}ngig von der Methode der Ausschaltung der Pilzk{\"o}rper gefunden. Die Dauer der Perseveranz nahm mit zunehmender Attraktivit{\"a}t des Zielobjekts, d. h. mit abnehmender Distanz, zu. Es wird vorgeschlagen, dass die Pilzk{\"o}rper f{\"u}r die Evaluierung von eingehender sensorischer Information oder f{\"u}r Entscheidungsfindungen im Allgemeinen ben{\"o}tig werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Minimalmodell f{\"u}r die visuelle Orientierung nach Landmarken entwickelt. Das Modell beinhaltet eine zeitliche Integration des optischen Flusses in einem frontolateralen und einem caudolateralen Kompartiment pro Auge. Je nachdem, in welchem Kompartiment eine festgesetzte Schwelle zuerst erreicht wird, kommt es entweder zu einer Hin- (frontolateral) oder zu einer Abwendungsreaktion (caudolateral). Eine Gewichtungsfunktion kompensiert die geringe parallaktische Verschiebung in diesen Sehregionen. Das Modell wurde in einem mobilen Roboter mit Kameraauge implementiert und mit dem visuellen Orientierungsverhalten der Fliege quantitativ verglichen. Der Roboter war in der Lage, viele Aspekte der Landmarkenwahl von laufenden Fliegen erfolgreich zu reproduzieren und fliegen{\"a}hnliches, autonomes Orientierungsverhalten unter verschiedenen Landmarkenkonfigurationen zu zeigen.}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @phdthesis{Pruefert2004, author = {Pr{\"u}fert, Kristina}, title = {Lamina assoziierte Polypeptide 2, Lamin-B-Rezeptor und Lamine : Untersuchungen an Vertebratenmodellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11619}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Der Zellkern ist ein wichtiges Organell von eukaryotischen Zellen, der durch eine Doppelmembran vom Cytoplasma abgetrennt wird. Mit Hilfe des Zebrafischs als Modellorganismus und kultivierten Zellen verschiedener Vertebraten wurde in mehreren Teilprojekten Untersuchungen an integralen (Lamina assoziiertes Polypeptid 2, Lamin B Rezeptor) und peripheren Membranproteinen (Lamine) der in inneren Kernmembran durchgef{\"u}hrt. Eines der am besten untersuchten integralen Membranproteine der inneren Kernmembran ist das Lamina assoziierte Polypeptid 2 (LAP2). Durch alternatives Splicen entstehen aus einem einzigen Gen eine Reihe verschiedener Isoformen die entwicklungs- und gewebespezifisch exprimiert werden. In S{\"a}uger sind 6 verschiedene Isoformen (LAP2\&\#945;, \&\#946;, \&\#948;, \&\#949;, \&\#947;, \&\#950;) bekannt, von denen alle mit Ausnahmen von LAP2\&\#945; und \&\#950;, in die innere Kernmembran integriert sind. Das LAP2\&\#945; ist ausschließlich im Nukleoplasma lokalisiert und wurde bis jetzt nur bei S{\"a}ugern beschrieben. Durch die Identifikation eines genomischen Klons ICRFc 7101293Q5 (RZPD) sowie vergleichende Datenbankanalysen konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LAP2-Gens ermittelt werden. Das Gen kodiert innerhalb von 19 kb (ohne regulatorische Sequenzen) 15 Exons aus denen durch alternatives Splicen 3 verschieden Isoformen hervorgehen (zLAP2 \&\#946;, \&\#947;, \&\#969;). Mit Hilfe des "Radiation Hybrid mappings" wurde das LAP2 Gen auf der "Linkage group" 4 des Zebrafischs, zwischen den EST-Markern fc01g04 (213,97) und fb49f01 (215,69cR) lokalisiert. Aufgrund der zus{\"a}tzlichen Identifikation der genomischen Sequenz des H{\"u}hner LAP2-Gens konnten die genomischen Sequenzen der LAP2 Gene von niederen Vertebraten (Zebrafisch), {\"u}ber die V{\"o}gel (Huhn), bis zum S{\"a}uger (Mensch) miteinander verglichen werden. Dabei zeigte sich einerseits, dass die \&\#969; Isoform des Zebrafischs nicht im Genom von Huhn und S{\"a}ugern vorhanden ist: Andererseits ist die \&\#945; Isoform der S{\"a}uger ebenfalls in keinem der anderen Spezies (Huhn, Zebrafisch) zu finden ist. Weiterhin konnte bei zus{\"a}tzliche Proteinanalysen mit monoklonalen und polyklonalen Antik{\"o}rpern, gegen die konservierte aminoterminale Dom{\"a}ne der LAP2 Proteine, in 10 Tage alten H{\"u}hner Embryonen nur ein Protein mit einem vergleichbaren Molekulargewicht zum LAP2\&\#946; anderer Spezies eindeutig detektiert werden. Aufgrund dieser Befunde und der Tatsache, dass die kodierenden Exonsequenzen zwischen Mensch und Huhn eine gr{\"o}ßere {\"A}hnlichkeit zeigen als zwischen Mensch und Zebrafisch, liegt die Vermutung nahe, dass die \&\#945;-Isoform eine Neuheit der S{\"a}ugern darstellt. Ein weiteres integrales Membranprotein, dass erstmals beim Zebrafisch untersucht wurde, ist der Lamin B Rezeptor (zLBR). Mit Hilfe von radioaktiv markierten Sonden, konnte zwei Klone identifiziert werden die sowohl die gesamte cDNA-Sequenz (MPMGp567K10194Q3 (RZPD) als auch die gesamte genomische Sequenz (ICRFc71M10137Q5 (RZPD) beinhalten. Anhand von vergleichenden Datenbankanalysen, konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LBR-Gens ermittelt werden. Dieses kodiert innerhalb von 12 kb (ohne regulatorische Sequenzen) mit 13 Exons f{\"u}r ein 616 Aminos{\"a}ure großes Protein. Vergleichbar mit dem LBR anderer Spezies besitzt der Zebrafisch LBR ebenfalls 8 Transmembrandom{\"a}nen in seiner carboxyterminalen Dom{\"a}ne mit denen er in der inneren Kernmembran verankert ist. Der Aminos{\"a}urenvergleich mit anderen Spezies zeigte, dass die Aminos{\"a}urensequenz sowohl des aminoterminalen Bereichs als auch im Bereich der Transmembrandom{\"a}nen hoch konserviert ist. Weiterhin wurden polyklonalen Antik{\"o}rpern gegen die ersten 210 Aminos{\"a}uren des zLBRs hergestellt, die f{\"u}r zuk{\"u}nftige immunologische Analysen verwendet werden k{\"o}nnen. Ebenso wie die integralen Membranproteine spielen auch die Lamine eine wichtige Rolle bei nukle{\"a}ren Prozessen. Die B-Typ Lamine zeichnen sich alle durch ein konserviertes CxxMMotiv am Carboxyterminus aus. Das CxxM-Motiv wird nach posttranslational modifiziert, wodurch es lipophile Eigenschaften erlangt und somit f{\"u}r die anf{\"a}ngliche Verankerung der Lamine in der inneren Kernmembran verantwortlich ist. Bei A-Typ Laminen ist dieses Motiv nicht in der Prim{\"a}rsequenz enthalten oder es wird nach dem Einbau in die Kernlamina proteolytisch abgespalten. Eine Besonderheit stellt das meiotische Lamin C2 dar, welches ein Spliceprodukt des Lamin A Gens der S{\"a}uger ist. Das Lamin C2 besitzt zwar kein CxxMMotiv an seinem Aminoterminus, daf{\"u}r aber ein Hexapeptid (GNAEGR) nach dem Startmethionin. Die posttranslationale Modifikation dieser Sequenz verleiht dem Protein lipoplile Eigenschaften. Anhand von funktionellen Analysen konnte durch die {\"U}berexpression GFP-Fusionsproteinen verschiedener wildtypischer Lamine und Lamin Mutanten gezeigt werden, dass die Interaktion der Lamine {\"u}ber das CxxM-Motiv oder das GNAEGR-Motiv mit der inneren Kernmembran, das Wachstum der Kernh{\"u}lle induziert. In einem letzten Projekt konnte mit Hilfe spezifischer "antisense-" Oligonukleotide, die als "Morpholinos" bezeichnet werden, die Expression von LAP2, LBR und den B-Typ Laminen B1 und B2 in Zebrafisch Embryonen reprimiert werden. Die Blockade der mRNA-Translation der entsprechenden Gene erfolgte in allen F{\"a}llen innerhalb der ersten 24 Stunden vollst{\"a}ndig. Obwohl die Anzahl der beobachteten Embryonen relativ gering war, so zeigte sich bei allen Embryonen eine deutliche Entwicklungsverz{\"o}gerung und unterschiedlich starke Entwicklungsst{\"o}rungen. Die morphologischen Auswirkungen waren bei der Reduktion des LAP2 oder der Lamine geringer als bei der Reduktion des LBR, da in beiden F{\"a}llen maternale Proteine, wie das LA2\&\#969; oder das B-Typ Lamin LIII, nicht reduziert werden konnten.}, subject = {Wirbeltiere}, language = {de} } @phdthesis{Spall2004, author = {Spall, Thomas}, title = {Optische Visualisierung neuronaler Aktivit{\"a}t : Etablierung des in-vivo Calcium-Imaging mit dem genetisch codierten Sensor Yellow Cameleon 2.1 und Untersuchung der olfaktorischen Codierung im Gehirn von Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11575}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Die Messung der r{\"a}umlich aufgel{\"o}sten Aktivit{\"a}t von neuronalen Zellverb{\"a}nden ist ein wichtiges Werkzeug, um die Funktionsweise von Gehirnen zu verstehen. F{\"u}r diese Arbeit diente die Fruchtfliege Drosophila melanogaster mit ihrer gut beschriebenen Genetik und Neurobiologie als Untersuchungsobjekt. Bei der vorgelegten Arbeit lag eine zweigeteilte Aufgabenstellung vor: Zum einen wurde die Technik des in - vivo Calcium - Imagings mit Hilfe des genetisch codierten Sensors Yellow Cameleon 2.1 am Lehrstuhl komplett neu etabliert, zum anderen wurde mit der neuen Technik das Zusammenspiel der funktionellen Elemente neuronaler Systeme anhand der Fliegenolfaktorik untersucht. Sowohl die Experimente zur Depolarisation durch KCl, als auch die Experimente zur olfaktorischen Codierung, wurden mit dem Calciumsensor Yellow Cameleon 2.1 durchgef{\"u}hrt. Es wurde ausgehend von der Vorg{\"a}ngerversion Yellow Cameleon 2.0 durch gezielte Mutagenese von S{\"o}ren Diegelmann erstellt. Eine Photomultiplier - basierte in - vitro Funktionsanalyse des rekombinanten Sensorproteins ergab eine Zunahme der Ratio EYFP / ECFP mit steigender Calciumkonzentration. Dabei konnte auch der ratiometrische FRET - Effekt des Cameleons verdeutlicht werden: Mit steigender Calciumkonzentration verschiebt sich das Verh{\"a}ltnis von EYFP - Fluoreszenz zu ECFP - Fluoreszenz zu h{\"o}heren Ratiowerten. Durch Zugabe des Calciumchelators EGTA konnte außerdem die reversible Arbeitsweise des Sensors nachgewiesen werden. Das in die Fliege eingebrachte Yellow Cameleon 2.1 - Konstrukt wurde mittels der GAL4 - UAS - Technik in verschiedenen olfaktorischen Gehirnzentren exprimiert. Von besonderer Relevanz f{\"u}r die Experimente zur olfaktorischen Codierung war dabei die GAL4 - Treiberlinie GH146. Mit ihrer Hilfe konnte das Fusionsprotein in den olfaktorischen Projektionsneuronen des Fliegengehirns exprimiert, und so die Duftrepr{\"a}sentation im postsynaptischen Neuropil der Antennalloben bzw. in den pr{\"a}synaptischen Neuropilen der Calyces und des lateralen Protocerbrums untersucht werden: Die Stimulation von 3 individuellen Fliegen mit den D{\"u}ften Benzaldehyd, Isoamylacetat und Octanol liefert duftspezifische neuronale Aktivit{\"a}tsmuster im Antenallobus. Die auf die Duftstimuli mit Calciumsignalen reagierenden Areale haben eine Gr{\"o}ße von 10 - 30 µm, liegen also in der Gr{\"o}ßenordnung von individuellen Glomeruli. Die Duftrepr{\"a}sentation in den Antennalloben zeigt außerdem einen kombinatorischen Aspekt: Jeder Duft evoziert ein charakteristisches Aktivit{\"a}tsmuster bestehend aus einem oder mehreren Glomeruli. Die Aktivit{\"a}tsmuster verschiedener D{\"u}fte k{\"o}nnen sich {\"u}berlagern, d.h. individuelle Glomeruli k{\"o}nnen durch verschiedene D{\"u}fte aktiviert werden, das gesamte Aktivit{\"a}tsmuster, d.h. die Summe der aktivierten Glomeruli eines bestimmten Duftes, ist jedoch charakteristisch. Die Duftrepr{\"a}sentation in den Antennalloben von Drososophila geschieht also in Form eines glomerul{\"a}ren Codes, ein Prinzip der Duftverarbeitung, das auch in anderen Insekten und Vertebraten nachgewiesen werden konnte. F{\"u}r den Calyx des Pilzk{\"o}rpers ergaben sich innerhalb eines Individuums, bei wiederholter Stimulation mit demselben Duft, ebenfalls duftspezifische Aktivit{\"a}tsmuster. Dabei waren die auf den Duftstimulus hin antwortenden neuronalen Areale diskret {\"u}ber den Calyx hinweg verteilt. Insgesamt zeigt das hohe Maß an Reproduzierbarkeit der Aktivit{\"a}tsmuster f{\"u}r einen gegebenen Duft, dass im Calyx, wie in den Antennalloben, eine duftspezifische r{\"a}umliche Repr{\"a}sentation vorliegt. Der kombinatorische Aspekt der Codierung konnte auch hier beobachtet werden. Die einzelnen Spots der im Calyx gemessenen Aktivit{\"a}tsmuster liegen in der Gr{\"o}ßenordnung von 5 +/- 2 µm und entsprechen somit in ihrer Gr{\"o}ße den elektronenmikroskopisch beschriebenen Microglomeruli. Durch die Calcium - Imaging Experimente am lateralen Protocerebrum konnte nachgewiesen werden, dass die Erh{\"o}hung der Duftkonzentration eine r{\"a}umliche Ausdehnung des aktivierten Neuropils zur Folge hat. Die EYFP -, ECFP - und Ratio - Intensit{\"a}ten, die aus einer "Region of Interest" im anterioren Bereich des lateralen Protocerebrums berechnet wurden, zeigen weiterhin, dass mit steigender Duftkonzentration auch die St{\"a}rke des Calciumsignals zunimmt. Dabei gibt es zwischen den 4 getesteten D{\"u}ften statistisch signifikante Unterschiede: Methylcyclohexanol evoziert {\"u}ber den gesamten Verd{\"u}nnungsbereich hinweg die schw{\"a}chste neuronale Aktivit{\"a}t, Isoamylacetat evoziert in den Verd{\"u}nnungsstufen 10-3 und 10-1 die st{\"a}rkste neuronale Aktivit{\"a}t. D.h. neben der r{\"a}umlichen Ausdehnung des Signals, f{\"u}hrt die Konzentrationserh{\"o}hung auch zu einer gesteigerten Intensit{\"a}t des Calciumsignals, wobei sich die Signalintensit{\"a}ten f{\"u}r verschiedene D{\"u}fte und Verd{\"u}nnungsstufen unterscheiden k{\"o}nnen. Mit der verwendeten Versuchsanordnung und Datenauswertung, war es jedoch bislang nicht m{\"o}glich eine r{\"a}umliche Repr{\"a}sentation der D{\"u}fte im lateralen Protocerebrum nachzuweisen.}, subject = {Terpyridinderivate <2}, language = {de} } @phdthesis{Hassel2003, author = {Hassel, Jessica C.}, title = {Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11319}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {{\"U}berexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus f{\"u}hrt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung f{\"u}hrt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden k{\"o}nnen, scheinen somit {\"u}ber entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion verf{\"u}gen zu m{\"u}ssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu geh{\"o}ren die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk, deren extrazellul{\"a}rer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellul{\"a}rer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abh{\"a}ngigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen f{\"u}hrt zu IL-3 unabh{\"a}ngigem Wachstum und zu Langzeit{\"u}berleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeit{\"u}berleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeit{\"u}berleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer h{\"o}heren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verk{\"u}rzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß f{\"u}r die Ausl{\"o}sung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, w{\"a}hrend f{\"u}r eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und f{\"u}r Langzeit{\"u}berleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf f{\"u}r die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine f{\"u}hrt, w{\"a}hrend der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß f{\"u}r die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber m{\"o}glicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verst{\"a}rken. F{\"u}r die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das f{\"u}r ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schw{\"a}chere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, w{\"a}hrend der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 f{\"u}hren. Da diese Mutante kein Langzeit{\"u}berleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend f{\"u}r Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeit{\"u}berleben zu sichern. Expression der Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk in murinen Melanozyten f{\"u}hrt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivit{\"a}t von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, w{\"a}hrend STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivit{\"a}t aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein {\"a}hnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen f{\"u}hrt (Wellbrock, unver{\"o}ffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend f{\"u}r die Antiapoptose von Melanomen zu sein.}, language = {de} }