@phdthesis{Spohn1999, author = {Spohn, Gunther}, title = {The transcriptional control of virulence gene expression in Helicobacter pylori}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2334}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {1999}, abstract = {The Gram-negative, spiral-shaped, microaerophilic bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of various disorders of the upper gastrointestinal tract, such as chronic superficial gastritis, chronic active gastritis, peptic ulceration and adenocarcinoma. Although many of the bacterial factors associated with disease development have been analysed in some detail in the recent years, very few studies have focused so far on the mechanisms that regulate expression of these factors at the molecular level. In an attempt to obtain an overview of the basic mechanisms of virulence gene expression in H. pylori, three important virulence factors of this pathogen, representative of different pathogenic mechanisms and different phases of the infectious process, are investigated in detail in the present thesis regarding their transcriptional regulation. As an essential factor for the early phase of infection, including the colonisation of the gastric mucosa, the flagella are analysed; the chaperones including the putative adhesion factors GroEL and DnaK are investigated as representatives of the phase of adherence to the gastric epithelium and persistence in the mucus layer; and finally the cytotoxin associated antigen CagA is analysed as representative of the cag pathogenicity island, which is supposed to account for the phenomena of chronic inflammation and tissue damage observed in the later phases of infection. RNA analyses and in vitro transcription demonstrate that a single promoter regulates expression of cagA, while two promoters are responsible for expression of the upstream divergently transcribed cagB gene. All three promoters are shown to be recognised by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Promoter deletion analyses establish that full activation of the cagA promoter requires sequences up to -70 and binding of the C-terminal portion of the alpha subunit of RNA polymerase to an UP-like element located between -40 and -60, while full activation of the major cagB promoter requires sequences upstream of -96 which overlap with the cagA promoter. These data suggest that the promoters of the pathogenicity island represent a class of minimum promoters, that ensure a basic level of transcription, while full activation requires regulatory elements or structural DNA binding proteins that provide a suitable DNA context. Regarding flagellar biosynthesis, a master transcriptional factor is identified that regulates expression of a series of flagellar basal body and hook genes in concert with the alternative sigma factor sigma 54. Evidence is provided that this regulator, designated FlgR (for flagellar regulatory protein), is necessary for motility and transcription of five promoters for seven basal body and hook genes. In addition, FlgR is shown to act as a repressor of transcription of the sigma 28-regulated promoter of the flaA gene, while changes in DNA topology are shown to affect transcription of the sigma 54-regulated flaB promoter. These data indicate that the regulatory network that governs flagellar gene expression in H. pylori shows similarities to the systems of both Salmonella spp. and Caulobacter crescentus. In contrast to the flagellar genes which are regulated by three different sigma factors, the three operons encoding the major chaperones of H. pylori are shown to be transcribed by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Expression of these operons is shown to be regulated negatively by the transcriptional repressor HspR, a homologue of a repressor protein of Streptomyces spp., known to be involved in negative regulation of heat shock genes. In vitro studies with purified recombinant HspR establish that the protein represses transcription by binding to large DNA regions centered around the transcription initiation site in the case of one promoter, and around -85 and -120 in the case of the the other two promoters. In contrast to the situation in Streptomyces, where transcription of HspR-regulated genes is induced in response to heat shock, transcription of the HspR-dependent genes in H. pylori is not inducible with thermal stimuli. Transcription of two of the three chaperone encoding operons is induced by osmotic shock, while transcription of the third operon, although HspR-dependent, is not affected by salt treatment. Taken together, the analyses carried out indicate that H. pylori has reduced its repertoire of specific regulatory proteins to a basic level that may ensure coordinate regulation of those factors that are necessary during the initial phase of infection including the passage through the gastric lumen and the colonisation of the gastric mucosa. The importance of DNA topology and/or context for transcription of many virulence gene promoters may on the other hand indicate, that a sophisticated global regulatory network is present in H. pylori, which influences transcription of specific subsets of virulence genes in response to changes in the microenvironment.}, subject = {Helicobacter-pylori-Infektion}, language = {en} } @phdthesis{Subota2011, author = {Subota, Ines}, title = {Switches in trypanosome differentiation: ALBA proteins acting on post-transcriptional mRNA control}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85707}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Trypanosoma brucei is a digenetic eukaryotic parasite that develops in different tissues of a mammalian host and a tsetse fly. It is responsible for sleeping sickness in sub-saharan Africa. The parasite cycle involves more than nine developmental stages that can be clearly distinguished by their general morphology, their metabolism and the relative positioning of their DNA-containing organelles. During their development, trypanosomes remain exclusively extracellular and encounter changing environments with different physico-chemical properties (nutritional availability, viscosity, temperature, etc.). It has been proposed that trypanosomes use their flagellum as a sensing organelle, in agreement with the established role of structurally-related cilia in metazoa and ciliates. Recognition of environmental triggers is presumed to be at the initiation of differentiation events, leading to the parasite stage that is the best suited to the new environment. These changes are achieved by the modification of gene expression programmes, mostly underlying post-transcriptional control of mRNA transcripts. We first demonstrate that the RNA-binding proteins ALBA3/4 are involved in specific differentiation processes during the parasite development in the fly. They are cytosolic and expressed throughout the parasite cycle with the exception of the stages found in the tsetse fly proventriculus, as shown by both immunofluorescence and live cell analysis upon endogenous tagging with YFP. Knock-down of both proteins in the developmental stage preceding these forms leads to striking modifications: cell elongation, cell cycle arrest and relocalization of the nucleus in a posterior position, all typical of processes acting in parasites found in the proventriculus region. When ALBA3 is over-expressed from an exogenous copy during infection, it interferes with the relocalization of the nucleus in proventricular parasites. This is not observed for ALBA4 over-expression that does not visibly impede differentiation. Both ALBA3/4 proteins react to starvation conditions by accumulating in cytoplasmic stress granules together with DHH1, a recognized RNA-binding protein. ALBA3/4 proteins also partially colocalize with granules formed by polyA+ RNA in these conditions. We propose that ALBA are involved in trypanosome differentiation processes where they control a subset of developmentally regulated transcripts. These processes involving ALBA3/4 are likely to result from the specific activation of sensing pathways. In the second part of the thesis, we identify novel flagellar proteins that could act in sensing mechanisms. Several protein candidates were selected from a proteomic analysis of intact flagella performed in the host laboratory. This work validates their flagellar localization with high success (85\% of the proteins examined) and defines multiple different patterns of protein distribution in the flagellum. Two proteins are analyzed during development, one of them showing down-regulation in proventricular stages. The functional analysis of one novel flagellar membrane protein reveals its rapid dynamics within the flagellum but does not yield a visible phenotype in culture. This is coherent with sensory function that might not be needed in stable culture conditions, but could be required in natural conditions during development. In conclusion, this work adds new pieces to the puzzle of identifying molecular switches involved in developmental mRNA control and environmental sensing in trypanosome stages in the tsetse fly.}, subject = {Trypanosoma brucei}, language = {en} } @phdthesis{BakariSoale2024, author = {Bakari Soale, Majeed}, title = {Regulation of the Variant Surface Glycoprotein (VSG) Expression and Characterisation of the Nucleolar DExD/H box Protein Hel66 in \(Trypanosoma\) \(brucei\)}, doi = {10.25972/OPUS-25809}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-258090}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2024}, abstract = {The variant surface glycoprotein (VSG) of African trypanosomes plays an essential role in protecting the parasites from host immune factors. These trypanosomes undergo antigenic variation resulting in the expression of a single VSG isoform out of a repertoire of around 2000 genes. The molecular mechanism central to the expression and regulation of the VSG is however not fully understood. Gene expression in trypanosomes is unusual due to the absence of typical RNA polymerase II promoters and the polycistronic transcription of genes. The regulation of gene expression is therefore mainly post-transcriptional. Regulatory sequences, mostly present in the 3´ UTRs, often serve as key elements in the modulation of the levels of individual mRNAs. In T. brucei VSG genes, a 100 \% conserved 16mer motif within the 3´ UTR has been shown to modulate the stability of VSG transcripts and hence their expression. As a stability-associated sequence element, the absence of nucleotide substitutions in the motif is however unusual. It was therefore hypothesised that the motif is involved in other essential roles/processes besides stability of the VSG transcripts. In this study, it was demonstrated that the 100 \% conservation of the 16mer motif is not essential for cell viability or for the maintenance of functional VSG protein levels. It was further shown that the intact motif in the active VSG 3´ UTR is neither required to promote VSG silencing during switching nor is it needed during differentiation from bloodstream forms to procyclic forms. Crosstalk between the VSG and procyclin genes during differentiation to the insect vector stage is also unaffected in cells with a mutated 16mer motif. Ectopic overexpression of a second VSG however requires the intact motif to trigger silencing and exchange of the active VSG, suggesting a role for the motif in transcriptional VSG switching. The 16mer motif therefore plays a dual role in VSG in situ switching and stability of VSG transcripts. The additional role of the 16mer in the essential process of antigenic variation appears to be the driving force for the 100 \% conservation of this RNA motif. A screen aimed at identifying candidate RNA-binding proteins interacting with the 16mer motif, led to the identification of a DExD/H box protein, Hel66. Although the protein did not appear to have a direct link to the 16mer regulation of VSG expression, the DExD/H family of proteins are important players in the process of ribosome biogenesis. This process is relatively understudied in trypanosomes and so this candidate was singled out for detailed characterisation, given that the 16mer story had reached a natural end point. Ribosome biogenesis is a major cellular process in eukaryotes involving ribosomal RNA, ribosomal proteins and several non-ribosomal trans-acting protein factors. The DExD/H box proteins are the most important trans-acting protein factors involved in the biosynthesis of ribosomes. Several DExD/H box proteins have been directly implicated in this process in yeast. In trypanosomes, very few of this family of proteins have been characterised and therefore little is known about the specific roles they play in RNA metabolism. Here, it was shown that Hel66 is involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. Hel66 localises to the nucleolus and depleting the protein led to a severe growth defect. Loss of the protein also resulted in a reduced rate of global translation and accumulation of rRNA processing intermediates of both the small and large ribosomal subunits. Hel66 is therefore an essential nucleolar DExD/H protein involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. As very few protein factors involved in the processing of rRNAs have been described in trypanosomes, this finding represents an important platform for future investigation of this topic.}, subject = {Trypanosoma brucei}, language = {en} } @phdthesis{Schuetz2006, author = {Sch{\"u}tz, Wolfgang}, title = {Postmeiotische Expression und funktionelle Charakterisierung von Lamin B3 in der Spermatogenese der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17110}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Die Lamine geh{\"o}ren zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernh{\"u}lle eukaryontischer Zellen. In S{\"a}ugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernh{\"u}lle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enth{\"a}lt eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellul{\"a}ren Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien w{\"a}hrend der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernh{\"u}lle und {\"u}berraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina w{\"a}hrend der S{\"a}uger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in S{\"a}ugern das erste Beispiel f{\"u}r ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen f{\"u}hrt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenf{\"o}rmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Ver{\"a}nderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale St{\"a}bchendom{\"a}ne in Lamin B3 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Dar{\"u}ber hinaus zeigte das Protein eine stark erh{\"o}hte L{\"o}slichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching" (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching" (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Molek{\"u}le eine hohe Mobilit{\"a}t aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze St{\"a}bchendom{\"a}ne begr{\"u}ndet ist. Die Ergebnisse f{\"u}hren zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernh{\"u}lle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung f{\"u}r einige Vorg{\"a}nge in der Spermiogenese sein k{\"o}nnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminos{\"a}uren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde {\"u}ber einen „Pull-Down-Assay" nach m{\"o}glichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie geh{\"o}ren zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und sp{\"a}teren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch {\"u}berpr{\"u}ft werden, w{\"u}rde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernh{\"u}lle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es f{\"u}r die Kernh{\"u}llenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem w{\"a}re es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Dom{\"a}ne von Lamin B3.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Jessen2021, author = {Jessen, Christina}, title = {NRF2 links antioxidant and immune-relevant features in melanoma}, doi = {10.25972/OPUS-23349}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-233495}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {The transcription factor NRF2 is considered as the master regulator of cytoprotective and ROS-detoxifying gene expression. Due to their vulnerability to accumulating reactive oxygen species, melanomas are dependent on an efficient oxidative stress response, but to what extent melanomas rely on NRF2 is only scarcely investigated so far. In tumor entities harboring activating mutations of NRF2, such as lung adenocarcinoma, NRF2 activation is closely connected to therapy resistance. In melanoma, activating mutations are rare and triggers and effectors of NRF2 are less well characterized. This work revealed that NRF2 is activated by oncogenic signaling, cytokines and pro-oxidant triggers, released cell-autonomously or by the tumor microenvironment. Moreover, silencing of NRF2 significantly reduced melanoma cell proliferation and repressed well-known NRF2 target genes, indicating basal transcriptional activity of NRF2 in melanoma. Transcriptomic analysis showed a large set of deregulated gene sets, besides the well-known antioxidant effectors. NRF2 suppressed the activity of MITF, a marker for the melanocyte lineage, and induced expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), thereby stabilizing the dedifferentiated melanoma phenotype and limiting pigmentation markers and melanoma-associated antigens. In general, the dedifferentiated melanoma phenotype is associated with a reduced tumor immunogenicity. Furthermore, stress-inducible cyclooxygenase 2 (COX2) expression, a crucial immune-modulating gene, was regulated by NRF2 in an ATF4-dependent manner. Only in presence of both transcription factors was COX2 robustly induced by H2O2 or TNFα. COX2 catalyzes the first step of the prostaglandin E2 (PGE2) synthesis, which was described to be associated with tumor immune evasion and reduction of the innate immune response. In accordance with these potentially immune-suppressive features, immunocompetent mice injected with NRF2 knockout melanoma cells had a strikingly longer tumor-free survival compared to NRF2-proficient cells. In line with the in vitro data, NRF2-deficient tumors showed suppression of COX2 and induction of MITF. Furthermore, transcriptomic analyses of available tumors revealed a strong induction of genes belonging to the innate immune response, such as RSAD2 and IFIH1. The expression of these genes strongly correlated with immune evasion parameters in human melanoma datasets and NRF2 activation or PGE2 supplementation limited the innate immune response in vitro. In summary, the stress dependent NRF2 activation stabilizes the dedifferentiated melanoma phenotype and facilitates the synthesis of PGE2. As a result, NRF2 reduces gene expression of the innate immune response and promotes the generation of an immune-cold tumor microenvironment. Therefore, NRF2 not only elevated the ROS resilience, but also strongly contributed to tumor growth, maintenance, and immune control in cutaneous melanoma.}, subject = {Melanom}, language = {en} } @phdthesis{Friedrich2009, author = {Friedrich, Torben}, title = {New statistical Methods of Genome-Scale Data Analysis in Life Science - Applications to enterobacterial Diagnostics, Meta-Analysis of Arabidopsis thaliana Gene Expression and functional Sequence Annotation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39858}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Recent progresses and developments in molecular biology provide a wealth of new but insufficiently characterised data. This fund comprises amongst others biological data of genomic DNA, protein sequences, 3-dimensional protein structures as well as profiles of gene expression. In the present work, this information is used to develop new methods for the characterisation and classification of organisms and whole groups of organisms as well as to enhance the automated gain and transfer of information. The first two presented approaches (chapters 4 und 5) focus on the medically and scientifically important enterobacteria. Its impact in medicine and molecular biology is founded in versatile mechanisms of infection, their fundamental function as a commensal inhabitant of the intestinal tract and their use as model organisms as they are easy to cultivate. Despite many studies on single pathogroups with clinical distinguishable pathologies, the genotypic factors that contribute to their diversity are still partially unknown. The comprehensive genome comparison described in Chapter 4 was conducted with numerous enterobacterial strains, which cover nearly the whole range of clinically relevant diversity. The genome comparison constitutes the basis of a characterisation of the enterobacterial gene pool, of a reconstruction of evolutionary processes and of comprehensive analysis of specific protein families in enterobacterial subgroups. Correspondence analysis, which is applied for the first time in this context, yields qualitative statements to bacterial subgroups and the respective, exclusively present protein families. Specific protein families were identified for the three major subgroups of enterobacteria namely the genera Yersinia and Salmonella as well as to the group of Shigella and E. coli by applying statistical tests. In conclusion, the genome comparison-based methods provide new starting points to infer specific genotypic traits of bacterial groups from the transfer of functional annotation. Due to the high medical importance of enterobacterial isolates their classification according to pathogenicity has been in focus of many studies. The microarray technology offers a fast, reproducible and standardisable means of bacterial typing and has been proved in bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The design of the diagnostic microarray of enterobacteria described in chapter 5 is based on the availability of numerous enterobacterial genome sequences. A novel probe selection strategy based on the highly efficient algorithm of string search, which considers both coding and non-coding regions of genomic DNA, enhances pathogroup detection. This principle reduces the risk of incorrect typing due to restrictions to virulence-associated capture probes. Additional capture probes extend the spectrum of applications of the microarray to simultaneous diagnostic or surveillance of antimicrobial resistance. Comprehensive test hybridisations largely confirm the reliability of the selected capture probes and its ability to robustly classify enterobacterial strains according to pathogenicity. Moreover, the tests constitute the basis of the training of a regression model for the classification of pathogroups and hybridised amounts of DNA. The regression model features a continuous learning capacity leading to an enhancement of the prediction accuracy in the process of its application. A fraction of the capture probes represents intergenic DNA and hence confirms the relevance of the underlying strategy. Interestingly, a large part of the capture probes represents poorly annotated genes suggesting the existence of yet unconsidered factors with importance to the formation of respective virulence phenotypes. Another major field of microarray applications is gene expression analysis. The size of gene expression databases rapidly increased in recent years. Although they provide a wealth of expression data, it remains challenging to integrate results from different studies. In chapter 6 the methodology of an unsupervised meta-analysis of genome-wide A. thaliana gene expression data sets is presented, which yields novel insights in function and regulation of genes. The application of kernel-based principal component analysis in combination with hierarchical clustering identified three major groups of contrasts each sharing overlapping expression profiles. Genes associated with two groups are known to play important roles in Indol-3 acetic acid (IAA) mediated plant growth and development as well as in pathogen defence. Yet uncharacterised serine-threonine kinases could be assigned to novel functions in pathogen defence by meta-analysis. In general, hidden interrelation between genes regulated under different conditions could be unravelled by the described approach. HMMs are applied to the functional characterisation of proteins or the detection of genes in genome sequences. Although HMMs are technically mature and widely applied in computational biology, I demonstrate the methodical optimisation with respect to the modelling accuracy on biological data with various distributions of sequence lengths. The subunits of these models, the states, are associated with a certain holding time being the link to length distributions of represented sequences. An adaptation of simple HMM topologies to bell-shaped length distributions described in chapter 7 was achieved by serial chain-linking of single states, while residing in the class of conventional HMMs. The impact of an optimisation of HMM topologies was underlined by performance evaluations with differently adjusted HMM topologies. In summary, a general methodology was introduced to improve the modelling behaviour of HMMs by topological optimisation with maximum likelihood and a fast and easily implementable moment estimator. Chapter 8 describes the application of HMMs to the prediction of interaction sites in protein domains. As previously demonstrated, these sites are not trivial to predict because of varying degree in conservation of their location and type within the domain family. The prediction of interaction sites in protein domains is achieved by a newly defined HMM topology, which incorporates both sequence and structure information. Posterior decoding is applied to the prediction of interaction sites providing additional information of the probability of an interaction for all sequence positions. The implementation of interaction profile HMMs (ipHMMs) is based on the well established profile HMMs and inherits its known efficiency and sensitivity. The large-scale prediction of interaction sites by ipHMMs explained protein dysfunctions caused by mutations that are associated to inheritable diseases like different types of cancer or muscular dystrophy. As already demonstrated by profile HMMs, the ipHMMs are suitable for large-scale applications. Overall, the HMM-based method enhances the prediction quality of interaction sites and improves the understanding of the molecular background of inheritable diseases. With respect to current and future requirements I provide large-scale solutions for the characterisation of biological data in this work. All described methods feature a highly portable character, which allows for the transfer to related topics or organisms, respectively. Special emphasis was put on the knowledge transfer facilitated by a steadily increasing wealth of biological information. The applied and developed statistical methods largely provide learning capacities and hence benefit from the gain of knowledge resulting in increased prediction accuracies and reliability.}, subject = {Genomik}, language = {en} } @phdthesis{Proft2014, author = {Proft, Florian Lukas Patrick}, title = {Molekulare Wirkmechanismen des Antidepressivums Venlafaxin - genetische Untersuchungen in Maus und Mensch}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-109201}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das pers{\"o}nliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekr{\"o}nt. Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der {\"A}tiologie depressiver St{\"o}rungen in Verbindung gebracht. Die prim{\"a}r verfolgten pharmakologischen Ans{\"a}tze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrw{\"o}chigen, regelm{\"a}ßigen Einnahme des Pr{\"a}parates zu einem R{\"u}ckgang der depressiven Symptomatik f{\"u}hren. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsans{\"a}tzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des pr{\"a}synaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters f{\"u}hrt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der pr{\"a}synaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinit{\"a}t eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird. Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu erm{\"o}glichen. Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivit{\"a}t von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die pr{\"a}synaptische Transportkapazit{\"a}t in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Pr{\"a}diktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenh{\"a}nge w{\"u}rde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell ben{\"o}tigten Konzentration erm{\"o}glichen und k{\"o}nnte die Effektivit{\"a}t der Therapie steigern. F{\"u}r die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-M{\"a}use {\"u}ber einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen {\"u}ber das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Ver{\"a}nderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert best{\"a}tigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design w{\"a}hrend der ersten und der f{\"u}nften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik f{\"u}r Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universit{\"a}tsklinikums W{\"u}rzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe k{\"o}nnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorg{\"a}nge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war. Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren f{\"u}r Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos. Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin erm{\"o}glichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von M{\"a}usen wurde mit reduziertem Angstverhalten und h{\"o}herer Exzitabilit{\"a}t von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorg{\"a}ngen bei synaptischer Plastizit{\"a}t und damit potentiell bei Lernvorg{\"a}ngen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-{\"a}hnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgepr{\"a}gte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen. Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgef{\"u}hrten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bez{\"u}glich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbeg{\"u}nstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet. Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, k{\"o}nnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquit{\"a}ren Mediatorent{\"a}tigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endg{\"u}ltig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zuk{\"u}nftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren. In die Untersuchung der Expressionsaktivit{\"a}t der f{\"u}r die prim{\"a}ren Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Pr{\"a}diktivit{\"a}t des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik f{\"u}r Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universit{\"a}tsklinikums W{\"u}rzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden f{\"u}r SLC6A2 der SNP rs28386840 und f{\"u}r SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die ph{\"a}notypische Transportkapazit{\"a}t der pr{\"a}synaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und f{\"u}r die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert. Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war. Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps k{\"o}nnte f{\"u}r den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben. Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren.}, subject = {Wirkmechanismus}, language = {de} } @phdthesis{Lang2002, author = {Lang, Carmen}, title = {Molekulare Charakterisierung, Expressionsmuster und Interaktionen der Lamina-assoziierten Polypeptide 2 (LAP2) in Xenopus laevis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3844}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Lamina-assoziierte Polypeptide 2 (LAP2) in Vertebraten sind bis auf zwei Ausnahmen integrale Membranproteine der inneren Kernmembran, die durch unterschiedliches Spleißen eines einzigen Gens entstehen. W{\"a}hrend die aminoterminale Dom{\"a}ne, die allen LAP2 Isoformen gemeinsam ist, in Interphasezellen mit Chromatin und dem DNA-Bindungsprotein BAF interagiert, beinhaltet der carboxyterminale Bereich die Lamin Bindungsdom{\"a}ne und eine Transmembrandom{\"a}ne. Diese beiden carboxyterminalen Dom{\"a}nen bewirken die Lokalisation der Proteine an die Kernh{\"u}lle. In dieser Arbeit konnten drei LAP2 Isoformen von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, die alle integrale Membranproteine sind. In somatischen Zellen werden vorwiegend die beiden Isoformen LAP2\&\#947; und LAP2ß exprimiert, in fr{\"u}hen Entwicklungsstadien dagegen die gr{\"o}ßte Isoform, das LAP2\&\#969;. In allen bekannten funktionellen Dom{\"a}nen weisen die LAP2 Proteine von Xenopus eine hohe Sequenz{\"u}bereinstimmung mit den LAP2 Proteinen in S{\"a}ugern auf. Allerdings finden sich in Xenopus zus{\"a}tzliche Isoform-spezifische Proteindom{\"a}nen, die zwischen der amino-terminalen Dom{\"a}ne und der Lamin Bindungsdom{\"a}ne eingeschoben sind. Eine dem Xenopus LAP2\&\#969; im Aufbau und in der Expression vergleichbare Isoform wurde bisher nur beim Zebrafisch nachgewiesen. Auch die somatisch exprimierten LAP2 Isoformen des Zebrafisch (ZLAP2b und ZLAP2g) entsprechen den beiden somatischen Xenopus Isoformen. Um Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den drei LAP2 Isoformen feststellen zu k{\"o}nnen, wurden die Proteine des Zebrafischs als GFP Fusionsproteine in Xenopus A6 Zellen exprimiert. ZLAP2\&\#969; und LAP2ß wurden vorwiegend an mitotische Chromosomen gebunden, dagegen war der gr{\"o}ßte Teil des ZLAP2g im Cytoplasma verteilt. Mutanten der drei Proteine, denen jeweils die Lamin Bindungsdom{\"a}ne einschließlich der Transmembrandom{\"a}ne fehlte, zeigten dasselbe Verhalten. Somit scheinen diese b- und w-spezifischen Dom{\"a}nen Chromatin-Bindungseigenschaften zu besitzen. In Amphibien liegt das XLAP2ß in der Interphase in einem Proteinkomplex mit A- und B-Typ Laminen vor. Diese Proteinkomplexe konnten durch Immunpr{\"a}zipitationen von GFP-XLAP2ß Fusionsproteinen mit GFP Antik{\"o}rpern nachgewiesen werden. Die Extrakte f{\"u}r die Immunpr{\"a}zipitationen wurden aus stabil transfizierten Xenopus A6 Zelllinien gewonnen. Diese Ergebnisse sind in {\"U}bereinstimmung mit in vitro Bindungsstudien mit GST- XLAP2ß Fusionsproteinen. F{\"u}r die Bildung des Lamin-LAP2ß Proteinkomplexes und auch f{\"u}r die korrekte Lokalisation des Proteins an die Kernh{\"u}lle reicht ein in Vertebraten hochkonservierter Bereich von 36 Aminos{\"a}uren in Kombination mit der Transmembrandom{\"a}ne aus. Zudem scheint diese kurze carboxyterminale LAP2ß Sequenz in Xenopus, Zebrafisch und Ratte mit dem endogenen LAP2ß um Bindungsstellen in der Kernlamina zu konkurrieren. Sowohl in Amphibien- wie auch in S{\"a}ugerzellen konnte in transient transfizierten Zellen eine betr{\"a}chtliche Verminderung des endogenen LAP2ß beobachtet werden, ohne dass dabei die Kernmorphologie und die Verteilung anderer Kernmembranproteine beeintr{\"a}chtigt wurde. Somit scheint die Lamin-Bindungsdom{\"a}ne des LAP2ß in Vertebraten stark konserviert zu sein.}, subject = {Glatter Krallenfrosch}, language = {de} } @phdthesis{Treichel2003, author = {Treichel, Dieter}, title = {Isolierung, evolutive Einordnung und funktionelle Charakterisierung von Knopfkopf, einem buttonhead-Ortholog in der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5867}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Isolierung des Sp1-verwandten Transkriptionsfaktors Knopfkopf mittels eines PCR-basierten Homologie-Screens in der Maus. Das Gen Knopfkopf wurde anschließend hinsichtlich der evolutiven Verwandtschaftsbeziehungen zum Drosophila-Gen buttonhead eingeordnet. Eine funktionelle Charakterisierung erfolgte mit Hilfe einer gezielten Geninaktivierung durch homologe Rekombination (knock out). Es konnte gezeigt werden, dass das Gen in der Embryogenese der Maus essentiell ist f{\"u}r die Entwicklung der Extremit{\"a}ten, der Nase und des Zentralen Nervensystems sowie der sekund{\"a}ren Gastrulation.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Hansen2001, author = {Hansen, Immo A.}, title = {Hexamerine und Neuropeptide in der postembryonalen Entwicklung der Insekten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180084}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung neuartige Ans{\"a}tze zur Identifizierung von biologisch aktiven Wirkstoffen, die in die Metamorphose von holometabolen Insekten eingreifen. Hexamerine und Neuropeptide besitzen sehr unterschiedliche Funktionen. W{\"a}hrend Neuropeptide zusammen mit anderen Gewebshormonen auf einer {\"u}bergeordneten regulatorischen Ebene wirken, sind Hexamerine als Speicher- und Verteidigungsproteine ein Endglied dieser hormonellen Regulationskaskade. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1) Im ersten Projekt sollten allatotrope Substanzen im Gehirn der großen Wachsmotte Galleria mellonella durch Screening einer Expressionsbibliothek mit polyklonalen Antiseren identifiziert werden. Dabei wurde das Neuropeptid Corazonin identifiziert. Die vollst{\"a}ndige Corazonin-mRNA wurde kloniert und sequenziert. Das Expressionsmuster der Corazonin-mRNA und des Peptids wurde mittels Northern-Analyse und in-situ-Hybridisierung charakterisiert. Corazonin wird in vier Zellpaaren, die zu den lateralen neurosekretorischen Zellen geh{\"o}ren, exprimiert. Die Axone dieser Zellen verlaufen ipsilateral zu den Nervi corpori cardiaci I+II, feine Fasern verzweigen sich in die am {\"O}sophagus angrenzende Hirnregion hinein. Corazonin wird offensichtlich an den Axon- Endigungen in den Corpora cardiaca in die H{\"a}molymphe freigesetzt. Einige feine Fasern enden in den Corpora allata bzw. am Vorderdarm. Der Nachweis, dass Corazonin tats{\"a}chlich eine allatotrope Wirkung hat, konnte nicht erbracht werden. 2) Die Protein/Protein-Interaktion zwischen Hexamerinen und dem Hexamerinrezeptor der Schmeißfliege Calliphora vicina wurde durch Two-Hybrid-Experimenten analysiert. Durch Interaktionstest mit trunkierten Proteinfragmenten wurden die Bindungsdom{\"a}nen beider Proteine kartiert. Als rezeptorbindende Dom{\"a}ne des Arylphorins wurde ein 49 AS großes Peptid in der Dom{\"a}ne-3 des Arylphorin- Monomers identifiziert. Die Ligandenbindungsdom{\"a}ne des Hexamerinrezeptors wurde in den ersten 24 AS des N-Terminus kartiert. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein HTS-Protokoll entwickelt, das zur Identifizierung von Substanzen verwendet werden kann, welche die Bindung dieser beiden Proteine beeinflussen. Eine Two-Hybrid-Bibliothek wurde ausgehend von 7dL-Fettk{\"o}rper-RNA konstruiert und mit "Hexamerinrezeptor-K{\"o}dern" gescreent. Dabei wurden zwei neue Interaktionspartner des Hexamerinrezeptors gefunden und genauer charakterisiert. Der erste identifizierte Interaktionspartner - d-AP-3 - ist Teil eines Adaptin- Komplexes, der als Adapter zwischen membranst{\"a}ndigen Rezeptoren und Clathrin oder {\"a}hnlichen Proteinen an der rezeptorvermittelten Endozytose beteiligt ist. Die Adaptin-Interaktionsdom{\"a}ne liegt innerhalb des ABP64-Spaltprodukts des Hexamerinrezeptors. Die Funktion des zweiten Interaktionspartners - AFP - ist unbekannt. AFP wird im anterioren Teil des Fettk{\"o}rpers und in H{\"a}mozyten exprimiert. Die Interaktion zwischen dem Hexamerinrezeptor und AFP ist demnach auf diesen Teil des Fettk{\"o}rpers beschr{\"a}nkt. Die mit AFP interagierende Dom{\"a}ne des Hexamerinrezeptors liegt innerhalb des P30-Spaltprodukts.}, subject = {Blaue Fleischfliege}, language = {de} } @phdthesis{Weniger2007, author = {Weniger, Markus}, title = {Genome Expression Pathway Analysis Tool - Analyse und Visualisierung von Microarray Genexpressionsdaten unter genomischen, proteomischen und metabolischen Gesichtspunkten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25392}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Messung der Genexpression ist f{\"u}r viele Bereiche der Biologie und Medizin wichtig geworden und unterst{\"u}tzt Studien {\"u}ber Behandlung, Krankheiten und Entwicklungsstadien. Microarrays k{\"o}nnen verwendet werden, um die Expression von tausenden mRNA-Molek{\"u}len gleichzeitig zu messen und erm{\"o}glichen so einen Einblick und einen Vergleich der verschiedenen zellul{\"a}ren Bedingungen. Die Daten, die durch Microarray-Experimente gewonnen werden, sind hochdimensional und verrauscht, eine Interpretation der Daten ist deswegen nicht einfach. Obwohl Programme f{\"u}r die statistische Auswertung von Microarraydaten existieren, fehlt vielen eine Integration der Analyseergebnisse mit einer automatischen Interpretationsm{\"o}glichkeit. In dieser Arbeit wurde GEPAT, Genome Expression Pathway Analysis Tool, entwickelt, das eine Analyse der Genexpression unter dem Gesichtspunkten der Genomik, Proteomik und Metabolik erm{\"o}glicht. GEPAT integriert statistische Methoden zum Datenimport und -analyse mit biologischer Interpretation f{\"u}r Genmengen oder einzelne Gene, die auf dem Microarray gemessen werden. Verschiedene Typen von Oligonukleotid- und cDNAMicroarrays k{\"o}nnen importiert werden, unterschiedliche Normalisierungsmethoden k{\"o}nnen auf diese Daten angewandt werden, anschließend wird eine Datenannotation durchgef{\"u}hrt. Nach dem Import k{\"o}nnen mit GEPAT verschiedene statische Datenanalysemethoden wie hierarchisches, k-means und PCA-Clustern, ein auf einem linearen Modell basierender t-Test, oder ein Vergleich chromosomaler Profile durchgef{\"u}hrt werden. Die Ergebnisse der Analysen k{\"o}nnen auf H{\"a}ufungen biologischer Begriffe und Vorkommen in Stoffwechselwegen oder Interaktionsnetzwerken untersucht werden. Verschiedene biologische Datenbanken wurden integriert, um zu jeder Gensonde auf dem Array Informationen zur Verf{\"u}gung stellen zu k{\"o}nnen. GEPAT bietet keinen linearen Arbeitsablauf, sondern erlaubt die Benutzung von beliebigen Teilmengen von Genen oder biologischen Proben als Startpunkt einer neuen Analyse oder Interpretation. Dabei verl{\"a}sst es sich auf bew{\"a}hrte Datenanalyse-Pakete, bietet einen modularen Ansatz zur einfachen Erweiterung und kann auf einem verteilten Computernetzwerk installiert werden, um eine große Zahl an Benutzern zu unterst{\"u}tzen. Es ist unter der LGPL Open-Source Lizenz frei verf{\"u}gbar und kann unter http://gepat.sourceforge.net heruntergeladen werden.}, subject = {Microarray}, language = {de} } @phdthesis{Altrock2002, author = {Altrock, Stefanie}, title = {Genetische Organisation und Transkription eines Virulenz-assoziierten, instabilen Chromosomenabschnitts von Listeria ivanovii}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3303}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Unter den sechs Arten der Gattung Listeria finden sich nur zwei pathogene Spezies. L. monocytogenes ist pathogen f{\"u}r Mensch und Tier, L. ivanovii nur tierpathogen. Beide Arten besitzen ein Virulenzgencluster, das auch als Pathogenit{\"a}tsinsel LIPI-1 bezeichnet wird. Pathogenit{\"a}tsinseln (PAIs) sind bei gram-negativen Bakterien weit verbreitet, wurden bei gram-positiven Pathogenen bisher jedoch nur selten beschrieben. In L. ivanovii wurde nun ein weiterer Virulenz-assoziierter, instabiler Chromosomenabschnitt entdeckt, der in einem Teilbereich Eigenschaften einer Pathogenit{\"a}tsinsel besitzt. Ausgehend von einem spontanen, aber reproduzierbaren Deletionsereignis eines großen Genomabschnitts, der einige schon bekannte Virulenz-assoziierte Gene umfasst (i-inlE, i-inlF, smcL), wurden in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern an der "Universidad Complutense de Madrid", insbesondere mit G. Dom{\´i}nguez-Bernal die komplette deletierte Region sowie flankierende Genombereiche genauer analysiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten rechts von dem bereits charakterisierten Gen smcL 13 neue Open Reading Frames (ORFs) bzw. Gene (ydeI, rnaH, norA) von L. ivanovii identifiziert werden, die gr{\"o}ßtenteils in der Deletionsmutante L. ivanovii GD-3 deletiert waren. F{\"u}r die meisten Open Reading Frames konnten Homologien zu ORFs in den Genomsequenzen von L. monocytogenes und der apathogenen Art L. innocua gefunden werden. Eigene experimentelle Analysen zeigten zudem, dass diese ORFs in {\"a}hnlicher Anordnung auch in den apathogenen Arten L. seeligeri und L. welshimeri vorhanden sind, was wahrscheinlich macht, dass sie nicht an der Virulenz von Listerien beteiligt sind. G. Dom{\´i}nguez-Bernal fand im links von smcL liegenden Bereich eine Reihe neuer Internalingene, die alle spezifisch f{\"u}r L. ivanovii sind. F{\"u}r die Gene i-inlE, i-inlF und smcL ist bereits bekannt, dass diese Virulenz-assoziiert sind. Dies f{\"u}hrte zur Definition einer neuen, LIPI-2 genannten Pathogenit{\"a}tsinsel in L. ivanovii, die außer smcL und i-inlFE alle neu gefundenen Internalingene umfasst. In dieser Arbeit durchgef{\"u}hrte Untersuchungen der LIPI-2 flankierenden Bereiche zeigten, dass diese in L. monocytogenes und auch den apathogenen Arten L. innocua, L. seeligeri und L. welshimeri bemerkenswert konserviert sind. Durch Transkriptionsuntersuchungen mittels RT-PCR wurde die Expression der neu identifizierten Gene analysiert. Hierbei wurden verschiedene Kulturbedingungen untersucht sowie die Transkription nach Infektion mehrerer Zelllinien bestimmt. Bei der Sequenzanalyse wurde f{\"u}r fast alle Internalingene eine PrfA-Box identifiziert und es best{\"a}tigte sich in dieser Arbeit, dass die meisten der Internalingene PrfA-abh{\"a}ngig exprimiert werden. Allerdings wiesen die einzelnen Gene kein einheitliches Transkriptionsprofil unter verschiedenen in vitro-Bedingungen auf. Eine Analyse der Genexpression nach Infektion verschiedener Zelllinien zeigte schließlich, dass die Internalingene w{\"a}hrend einer Infektion differentiell transkribiert werden und m{\"o}glicherweise am Infektionsgeschehen beteiligt sind. Das Expressionsmuster der zu LIPI-2 benachbarten Open Reading Frames best{\"a}tigte, dass diese Gene PrfA-unabh{\"a}ngig und unter verschiedenen Bedingungen konstitutiv exprimiert werden. Das Expressionsmuster dieser Gene l{\"a}ßt den Schluss zu, dass sie vermutlich nicht zur Virulenz von L. ivanovii beitragen. Die Untersuchung der Virulenzclustergene in LIPI-1 schließlich zeigte eine deutliche PrfA-Abh{\"a}ngigkeit der Genexpression. Es konnte best{\"a}tigt werden, dass deren Transkription unter PrfA-induzierenden Bedingungen verst{\"a}rkt wird. Zudem fand sich auch nach Infektion eine deutliche Expression dieser Gene.}, subject = {Listeria ivanovii}, language = {de} } @phdthesis{Koerner2004, author = {K{\"o}rner, Ulrich}, title = {Funktionelle Rolle von HMGN-Proteinen w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung von Xenopus laevis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9166}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die F{\"a}higkeit, Chromatin aufzulockern. Sie erm{\"o}glichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterst{\"u}tzen DNA-abh{\"a}ngige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine w{\"a}hrend der Embryogenese am Beispiel des s{\"u}dafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zellul{\"a}re Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung f{\"u}hrte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in sp{\"a}teren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenb{\"u}rstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine g{\"a}nzlich. W{\"a}hrend der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifit{\"a}t hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erh{\"o}hte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine ({\"U}berexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen R{\"u}cken, stark verk{\"u}rzten und gebogenen K{\"o}rperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zellul{\"a}re HMGN Proteinmenge f{\"u}r eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays" und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression w{\"a}hrend der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene w{\"a}hrend der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass ver{\"a}nderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquit{\"a}ren Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schl{\"u}sselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erkl{\"a}ren.}, subject = {Glatter Krallenfrosch}, language = {de} } @phdthesis{Stoll2009, author = {Stoll, Sascha}, title = {Funktionelle Analyse von Blochmannia floridanus, dem prim{\"a}ren Endosymbionten der Rossameise Camponotus floridanus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37238}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Ameisen der Gattung Camponotus beherbergen bakterielle Symbionten der Gattung Blochmannia in spezialisierten Zellen des Mitteldarms (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schr{\"o}der et al., 1996). Die Genomsequenzierung dieser Symbionten zeigte, dass Blochmannia, {\"a}hnlich den Symbionten von Blattl{\"a}usen, haupts{\"a}chlich Gene der Aminos{\"a}urebiosynthese beibehalten hat (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). Die Relevanz dieser nahrungsaufwertenden Funktion konnte experimentell best{\"a}tigt werden (Feldhaar et al., 2007). Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Aufkl{\"a}rung der dynamischen Interaktion der beiden Partner w{\"a}hrend des komplexen Lebenszyklus des holometabolen Wirtes. Fr{\"u}here Studien deuteten darauf hin, dass die Symbiose vor allem w{\"a}hrend der Larven- und Puppenphasen von Bedeutung sein k{\"o}nnte (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). Mit fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) und konfokaler Laserscanning Mikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit die Lokalisierung von B. floridanus w{\"a}hrend der wichtigsten Entwicklungsstadien aufgekl{\"a}rt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Symbionten schon im ersten Larvenstadium in spezialisierten Zellen um den Darm angeordnet sind, aber in sp{\"a}teren Stadien nicht, wie bisher angenommen, auf diese Bakteriozyten beschr{\"a}nkt sind, sondern bis zum Schlupf der jungen Arbeiterinnen massiv andere Darmzellen infizieren. {\"U}bereinstimmend mit Bestimmungen der Zellzahl in den verschiedenen Wirtsstadien ist die Anzahl der Symbionten gegen Ende der Metamorphose am h{\"o}chsten. Die Symbiose degeneriert in sehr alten Arbeiterinnen, gut gef{\"u}llte Bakteriozyten werden jedoch noch monatelang beibehalten. Mit Macroarray- und qRT- PCR- basierten Transkriptomanalysen wurde die Expression der bakteriellen Gene in charakteristischen Entwicklungsstadien des Wirtes untersucht. Allgemein zeigen vor allem Gene f{\"u}r molekulare Chaperons und bestimmte bakterielle Grundfunktionen eine hohe Expression. Aber auch viele Gene, die m{\"o}glicherweise wichtige Funktionen in der Symbiose besitzen, wie die Biosynthese essentieller Aminos{\"a}uren und das Recycling von Stickstoffverbindungen, zeigen ein hohes absolutes Transkriptlevel. Zudem besteht eine positive Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und dem GC- Gehalt der Gene, die in dem h{\"o}heren Selektionsdruck und damit einer geringeren Mutationsrate der essentiellen Gene begr{\"u}ndet liegt (Schaber et al., 2005). Durch Proteinanalysen konnte best{\"a}tigt werden, dass die Faktoren mit der h{\"o}chsten absoluten Transkription die dominanten Proteine der Symbionten darstellen. In den unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigen viele Gene eine deutliche Dynamik, deren Ausmaß aber, verglichen mit freilebenden Bakterien, gering ist. Aus den Expressionsprofilen aufeinanderfolgender Gene lassen sich m{\"o}gliche Transkriptionseinheiten ableiten, die teilweise auch experimentell best{\"a}tigt wurden. Oftmals zeigen auch Gene, die nicht in Transkriptionseinheiten angeordnet sind, aber verwandten Stoffwechselwegen angeh{\"o}ren, {\"a}hnliche Muster. Dies deutet auf das Vorhandensein grundlegender Genregulations-mechanismen hin, obwohl im Genom von B. floridanus nur noch sehr wenige Transkriptionsfaktoren codiert sind (Gil et al., 2003). Auf {\"u}bergeordneter Ebene zeigt sich, dass bei Symbionten aus sp{\"a}ten Puppenstadien viele symbioserelevante Gene im Vergleich zu Genen des Grundmetabolismus eine erh{\"o}hte Expression zeigen. Dies betrifft besonders die Biosynthese aromatischer und verzweigter Aminos{\"a}uren, die in diesen Stadien vom Wirt in hoher Menge ben{\"o}tigt werden, w{\"a}hrend die internen Reserven gleichzeitig zur Neige gehen. Dies {\"a}ußert sich auch im deutlichen Abfallen der Speicherproteinmenge des Wirts gegen Ende der Puppenphase. Die festgestellte Ver{\"a}nderung der Symbiontenzahl {\"u}bertrifft das geringe Ausmaß der Genregulation um ein Vielfaches. Die Bakterien liegen in jedem Stadium polyploid mit bis zu 100 Genomkopien vor, dieser Polyploidiegrad bleibt jedoch w{\"a}hrend der gesamten Wirtsentwicklung weitestgehend konstant. Somit scheint die Kontrolle des Wirts {\"u}ber die bakterielle Vermehrung der entscheidende Faktor dieser Symbiose zu sein. Die verbleibenden regulatorischen F{\"a}higkeiten der Bakterien stellen m{\"o}glicherweise eine Feinjustierung von optimierten Produktionseinheiten dar, deren Anzahl nach den Bed{\"u}rfnissen des Wirtes ver{\"a}ndert wird. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in das komplexe Zusammenleben von Blochmannia und Camponotus gewonnen werden, die zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der biologischen Funktion und der grundlegenden Mechanismen dieser Symbiose f{\"u}hren. Eine der wichtigsten Fragestellungen nach dem Sinn einer nahrungsaufwertenden Symbiose f{\"u}r einen Nahrungsgeneralisten konnte mit starken Hinweisen auf eine stadienabh{\"a}ngige Relevanz der Symbiose beantwortet werden, die den enormen evolution{\"a}ren Erfolg dieser Ameisengattung erkl{\"a}ren k{\"o}nnte.\&\#8195;}, subject = {Intrazellul{\"a}re Symbiose}, language = {de} } @phdthesis{Schaefer2011, author = {Sch{\"a}fer, Ingo}, title = {Fremdgenexpression in humanen Mitochondrien}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85202}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Bei einer Vielzahl neuromuskul{\"a}rer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, k{\"o}nnen Mutationen in beiden Genomen die Ausl{\"o}ser dieser Erkrankungen darstellen. Ver{\"a}nderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Ausl{\"o}ser behandelt werden k{\"o}nnen. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste gr{\"u}n fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsf{\"a}higkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielf{\"u}hrend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung f{\"u}r die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden k{\"o}nnen. Durch eine Ans{\"a}uerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigs{\"a}ure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Gr{\"o}ße des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen f{\"u}r die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig gr{\"u}n fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt f{\"u}r die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor m{\"u}ssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine h{\"o}here Transfektionseffizienz zu erreichen.}, subject = {Mitochondrium}, language = {de} } @phdthesis{Busold2006, author = {Busold, Christian}, title = {Facilitating functional interpretation of microarray data by integration of gene annotations in Correspondence Analysis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21150}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {DNS-Chips ('Microarrays') haben sich zu einer der Standardmethoden zur Erstellung von genomweiten Expressionsstudien entwickelt. Mittlerweile wurden dazu eine Vielzahl von Methoden zur Identifizierung von differentiell regulierten Genen ver{\"o}ffentlicht. Ungeachtet dessen stellt die abschliessende funktionelle Interpretation der Ergebnisse einen der Engp{\"a}sse in der Analyse von Chip-Daten dar. Die Mehrzahl der Analysemethoden stellt die signifikant regulierten Gene in Listen dar, aus denen in einem weiteren Schritt gemeinsame funktionelle Eigenschaften abgeleitet werden m{\"u}ssen. Dies stellt nicht nur eine arbeitsintensive Arbeit dar, die mit steigender Anzahl an experimentellen Konditionen immer weniger praktikabel wird, sondern ist auch fehleranf{\"a}llig, da diese Auswertung im allgemeinen auf dem visuellen Vergleich von Listen beruht. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden f{\"u}r eine rechnergest{\"u}tzte Auswertung von funktionellen Geneigenschaften entwickelt und validiert. Hierzu wurde die 'Gene Ontology' als Quelle f{\"u}r die Annotationsdaten ausgew{\"a}hlt, da hier die Daten in einem Format gespeichert sind, das sowohl eine leichte menschliche Interaktion sowie die statistische Analyse der Annotationen erm{\"o}glicht. Diese Genannotation wurden als Zusatzinformationen in die Korrespondenzanalyse integriert, welches eine simultane Darstellung von Genen, Hybridisierungen und funktionellen Kategorien in einer Grafik erm{\"o}glicht. Aufgrund der st{\"a}ndig wachsenden Anzahl an verf{\"u}gbaren Annotationen und der Tatsache, daß zwischen den meisten experimentellen Bedingungen nur wenige funktionelle Prozesse differentiell reguliert sind, wurden Filter entwickelt, die die Anzahl der dargestellten Annotationen auf eine im gegebenen experimentellen Kontext relevante Gruppe reduzieren. Die Anwendbarkeit der Visualisierung und der Filter wurde auf Datens{\"a}tzen unterschiedlicher Komplexit{\"a}t getestet: beginnend mit dem gut verstandenen Glukosestoffwechsel im Modellorganismus S. cerevisiae, bis hin zum Vergleich unterschiedlicher Tumortypen im Menschen. In beiden F{\"a}llen generierte die Methode gut zu interpretierende Grafiken, in denen die funktionellen Hauptunterschiede durch die dargestellten Annotationen gut beschrieben werden [90]. W{\"a}hrend die Integration von Annotationsdaten wie GO die funktionelle Interpretation vereinfacht, fehlt die M{\"o}glichkeit zur Identifikation einzelner relevanter Schl{\"u}sselgene. Um eine solche Analyse zu erm{\"o}glichen, wurden Daten zum Vorkommen von Transskriptionsfaktorbindestellen in den 5'-Bereichen von Genen integriert. Auch diese Methode wurde an Datens{\"a}tzen von S. cerevisiae und vergleichenden Studien von humanen Krebszelllinien validiert.In beiden F{\"a}llen konnten Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die f{\"u}r die beobachteten transkriptionellen Unterschiede von entscheidender Bedeutung sind [206]. Zusammenfassend, erm{\"o}glicht die Integration von Zusatzinformationen in die Korrespondenzanalyse eine simultane Visualisierung von Genen, Hybridisierungen und Annotationsdaten in einer einzigen, gut zu interpretierenden Grafik. Dies erlaubt auch in komplexen experimentellen Bedingungen eine intuitive Identifizierung von relevanten Annotationen. Der hier vorgestellte Ansatz, ist nicht auf die gezeigten Datenstrukturen beschr{\"a}nkt, sondern kann auf die Mehrzahl der verf{\"u}gbaren Annotationsdaten angewendet werden.}, subject = {Microarray}, language = {en} } @phdthesis{Niederfuehr1999, author = {Niederf{\"u}hr, Alexandra}, title = {Expressionskartierung des menschlichen Chromosoms 11p13}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1803}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {1999}, abstract = {In die Region p13 des menschlichen Chromosoms 11 kartieren mehrere krankheitsrelevante Gene wie das Wilms' Tumor Gen WT1 oder das f{\"u}r die Aniridie verantwortliche Gen PAX6. Beide Gene k{\"o}nnen bei Patienten mit dem WAGR-Syndrom deletiert sein, was das Auftreten von Wilms' Tumoren oder Aniridie bei diesen Patienten erkl{\"a}rt. Die genetische Ursache f{\"u}r weitere Symptome des WAGR-Syndroms, wie beispielsweise die geistige Retardierung, ist bisher nicht gekl{\"a}rt. Des weiteren wurden Allelverluste auf 11p13 in Verbindung mit verschiedenen Tumoren (Lunge, Blase, Brust, Ovar) beobachtet, ohne daß die urs{\"a}chlichen Gene hierf{\"u}r beschrieben werden konnten. Eine Kartierung und anschließende Sequenzierung dieser Region dient als Grundlage f{\"u}r die Identifizierung neuer Gene, die m{\"o}glicherweise im Zusammenhang mit diesen Krankheiten stehen. Mit dem Ziel der Sequenzierung dieser Region wurde ausgehend von einem YAC-Contig, das 8 Mb des Chromosoms 11p13-14.1 abdeckt, eine Feinkartierung der Region 11p13 durchgef{\"u}hrt. {\"U}ber ein Screening einer humanen PAC-Bibliothek mit 11p13-spezifischen Proben, wurden PAC-Klone erhalten, die aus dieser Region stammen. Mit einem Teil dieser Klone konnte mittels "chromosome walking" ein 4,5 Mb großes PAC-Contig erstellt werden. Zur Sequenzierung des Chromosomenabschnitts 11p13 am Sanger Centre/UK wurden die PAC-Klone des "minimal tiling path" gew{\"a}hlt. Auf der Grundlage des PAC-Contigs wurden auf experimentellem Weg mit Hilfe des Exontrappings neue Transkripte isoliert. Hierf{\"u}r wurden sechs PAC-Klone, die etwa 700 kb des Chromosoms 11p13 abdecken, herangezogen. Zus{\"a}tzlich wurden erste Sequenzabschnitte (insgesamt ca. 640 kb) der PAC-Klone {\"u}ber eine computergest{\"u}tze Auswertung mit dem Programmpaket NIX/HGMP analysiert. Insgesamt konnten mit Hilfe des Exontrappings und der in silico Analyse f{\"u}nf neue potentielle Transkripte identifiziert werden. Eine erste Untersuchung dieser Transkripte wurde mit Hilfe von Datenbankvergleichen und Expressionsstudien auf Northern Blots und in situ Hybridisierungen durchgef{\"u}hrt. Aussagen {\"u}ber eine m{\"o}gliche Funktion konnten bei zwei der identifizierten Transkripte anhand von Datenbankvergleichen getroffen werden. Es handelt sich zum einen um ein Transkript mit Homologien zum Gen cca3 aus der Ratte, f{\"u}r das aufgrund der enthaltenen BTB-Dom{\"a}ne eine regulatorische Funktion auf DNA-Ebene postuliert werden kann. Zum anderen wurde ein Gen mit {\"A}hnlichkeiten zu einem Transkript aus Achlya ambisexualis isoliert. Letzteres besitzt m{\"o}glicherweise die Funktion eines Steroidrezeptors. Zus{\"a}tzlich zu den hier beschriebenen Transkripten, k{\"o}nnen aus dem erstellten PAC-Contig neue Gene auf der Basis von cDNA-Selektion, Exontrapping oder, nach Fertigstellung der gesamten Sequenz, {\"u}ber in silico Analysen identifiziert werden.}, subject = {Mensch}, language = {de} } @phdthesis{Zirn2006, author = {Zirn, Birgit}, title = {Expressions- und Mutationsanalysen in kindlichen Wilms Tumoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20338}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {kumulative Dissertation, vgl. Abstracts der angeh{\"a}ngten Publikationen}, subject = {Nephroblastom}, language = {de} } @phdthesis{Jager2002, author = {Jager, Tertia ¬de¬}, title = {Estrogen action in the myocardium}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1182573}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Cardiovascular disease is the leading cause of mortality in both men and women in the Western world. Earlier observations have pointed out that pre-menopausal women have a lower risk of developing cardiovascular disease than age-matched men, with an increase in risk after the onset of menopause. This observation has directed the attention to estrogen as a potential protective factor in the heart. So far the focus of research and clinical studies has been the vascular system, leaving the current knowledge on the role of estrogen in the myocardium itself rather scarce. Functional estrogen receptor-alpha as well as -beta have recently been identified in the myocardium, making the myocardium an estrogen target organ. The focus of this thesis was 1) to investigate the role of estrogen and estrogen receptors in modulating myocardial gene expression both in vivo in an animal model for cardiac hypertrophy (spontaneously hypertensive rats; SHR), as well as in vitro in isolated neonatal cardiomyocytes, 2) to investigate the mechanisms of the rapid induction of an estrogen target gene, the early growth response gene-1 (Egr-1) and 3) to initiate the search for novel estrogen target genes in the myocardium. 1) The effects of estrogen on the expression of one of the major myocardial specific contractile proteins, the alpha-myosin heavy chain (alpha-MHC) have been investigated. In ovarectomised animals treated either with 17beta-estradiol alone or in combination with a specific estrogen receptor antagonist, ICI 182780, it was shown that both alpha-MHC mRNA and protein were upregulated by estrogen in an estrogen receptor specific manner. The in vivo results were confirmed in vitro in isolated neonatal cardiomyocytes which showed that estrogen has a direct action on the myocardium potent enough to upregulate the expression of alpha-MHC. Furthermore it was shown that the alpha-MHC promoter is induced by estrogen in an estrogen receptor-dependent manner and first investigations into the mechanisms involved in this upregulation identified Egr-1 as a potential transcription factor which, upon induction by estrogen, drives the expression of the alpha-MHC promoter. 2) Previously it was shown that Egr-1 is rapidly induced by estrogen in an estrogen receptor-dependent manner which was mediated via 5 serum response elements (SREs) in the promoter region and surprisingly not via the estrogen response elements (EREs). In this study it was shown that estrogen-treatment of cardiomyocytes resulted in the recruitment of serum response factor (SRF), or an antigenically related protein, to the SREs in the Egr-1 promoter, which was specifically inhibited by the estrogen receptor antagonist ICI 182780. Transfection experiments showed that estrogen induced a heterologous promoter consisting only of 5 tandem repeats of the c-fos SRE in an ER-dependent manner, which identified SREs as promoter elements able to confer an estrogen response to target genes. 3) Potentially new target genes regulated by estrogen in vivo were analysed using hearts of ovarectomised animals as well as ovarectomised animals treated with estrogen. Analyses of cDNA microarray filters containing 1250 known genes identified 24 genes that were modified by estrogen in vivo. Among these genes, some might have potentially important functions in the heart and further analyses of these genes will create a more global picture of the role and function of estrogen in the myocardium. Taken together, the results showed that estrogen does have a direct action on the myocardium both by regulating the expression of myocardial specific genes in vivo, as well as exerting rapid non-nuclear effects in cardiac myocytes. It was shown that SREs in the promoter region of genes can confer an estrogen response to genes identifying SREs as important elements in regulation of genes by estrogen. Furthermore, 24 potentially new estrogen targets were identified in the myocardium, contributing to the general understanding of estrogen action in the myocardium.}, subject = {Herzmuskel}, language = {en} } @phdthesis{Brambrink2002, author = {Brambrink, Tobias}, title = {Entwicklung und Evaluierung eines Verfahrens zur Genexpressionsanalyse bei individuellen pr{\"a}implantatorischen S{\"a}ugerembryonen {\"u}ber die cDNA-Array-Technologie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1787}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Untersuchungen der Transkriptionsebene individueller pr{\"a}implantatorischer Embryonalstadien k{\"o}nnen wertvolle Informationen {\"u}ber den physiologischen Status der betrachteten Embryonen, die z.B. zur Verbesserung der Systeme zur In vitro-Produktion von Embryonen genutzt werden k{\"o}nnen, liefern. Bisher fehlte es jedoch an einer geeigneten Technologie, um eine große Anzahl von Transkripten in einzelnen Embryonen zu erfassen. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, ein Verfahren zur globalen Amplifikation embryonaler mRNA-Pr{\"a}parationen zu entwickeln, das die Analyse der Transkriptionsebene einzelner pr{\"a}implantatorischer Embryonalstadien {\"u}ber die cDNA-Array-Technologie erm{\"o}glicht. Dazu wurde die Strategie gew{\"a}hlt, zwei bereits etablierte Amplifikationsverfahren, Polymerasekettenreaktion und In vitro-Transkription, zu kombinieren, um so synergistische Effekte beider Verfahren zu nutzen. Die Evaluierung des entwickelten Verfahrens zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit der erhaltenen Genexpressionsdaten und belegte, dass die relativen Mengenverh{\"a}ltnisse einzelner mRNA-Spezies zueinander w{\"a}hrend der globalen mRNA-Amplifikation nur unwesentlich ver{\"a}ndert wurden. Die entwickelte Methodik ist somit geeignet, komplexe Genexpressionsprofile einzelner Blastozysten zu erstellen und Unterschiede in der Expressionsst{\"a}rke einzelner Transkripte zu detektieren. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass es m{\"o}glich ist, {\"u}ber heterologe Hybridisierung Genexpressionsprofile boviner Blastozysten mit cDNA-Arrays, die murine Probensequenzen enthalten, reproduzierbar darzustellen. Neben der Detektion individueller Unterschiede in den Genexpressionsprofilen diverser muriner Embryonalstadien und boviner Blastozysten lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit in der Untersuchung der Auswirkungen verschiedener in vitro-Produktionssysteme auf die embryonale Genexpression. Die erhaltenen cDNA-Array Expressionsdaten muriner Oozyten, Zweizeller und Blastozysten befanden sich dabei in {\"U}bereinstimmung mit Daten fr{\"u}herer Publikationen anderer Arbeitsgruppen. Genexpressionsprofile in vitro fertilisierter boviner Blastozysten ließen eine Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Proteinsupplemente des Kulturmediums auf die embryonale Genexpression zu. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal Genexpressionsprofile einzelner pr{\"a}implantatorischer S{\"a}ugerembryonen {\"u}ber cDNA-Array-Analyse erstellt. Die entwickelte Technologie erm{\"o}glicht es -bei Verwendung entsprechender cDNA-Array-Systeme-, eine theoretisch unbegrenzte Zahl von Transkripten in individuellen S{\"a}ugerembryonen semiquantitativ zu erfassen. Dies ist ein wichtiger Schritt hin zu einem besseren Verst{\"a}ndnis komplexer Regulationsabl{\"a}ufe w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Embryonalentwicklung und einer besseren Beurteilung der Lebensf{\"a}higkeit und Entwicklungskompetenz in vitro produzierter Embryonen, was f{\"u}r die Verbesserung von In vitro-Produktionssystemen f{\"u}r Embryonen sowohl bei Tieren als auch beim Menschen unerl{\"a}sslich ist.}, subject = {Embryo}, language = {de} }