@phdthesis{Denker2006,
  author    = {Denker, Katrin},
  title     = {Isolation and characterization of channel-forming proteins in the outer membrane of E. coli and Borrelia species},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16955},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {In this study pore forming proteins of the gram-negative bacteria B. burgdorferi, B. duttonii and E.coli were investigated. Therefore the study is subdivided into three parts. In the first part outer membrane preparation of three relapsing fever Borrelia were investigated. In the second part the putative TolC homologue BB0124 of B. burgdorferi, the Lyme borreliosis agent, was studied. In the last part the influence of point mutants within the greasy slide of the maltose specific porin (LamB) of E. coli were shown. In the first part of this study outer membrane preparations of three Borrelia relapsing fever strains have been studied for pore-forming activity in the black lipid bilayer assay. Histograms of conductance fluctuations were obtained from single-channel experiments with outer membrane preparations of B. hermsii, B. recurentis and B. duttonii. All strains had a different conductance fluctuation pattern with a broad range of single-channel conductance values varying from 0.5 nS - 11 nS. Common for all three strains was a high pore-forming activity at around 0.5 nS. Furthermore the proteins of the outer membrane of B. duttonii were separated by chromatographic methods. Some eluate fractions contained a channel-forming protein, which was forming stable channels with a single-channel conductance of 80 pS in 1 M KCl. Characterization of this channel showed that it is slightly anionic selective and voltage independent. The small single-channel conductance suggests that it is a specific pore. However, a substrate specificity could not be determined. In the second part, for the B. burgdorferi HB19 and p66 knock out strain HB19/K02, their outer membrane preparations were characterized in the black lipid bilayer assay. Comparing the histograms of single-channel conductions fluctuations of both strains showed no single-channel activity at 11.5 nS for the p66 knock out strain. This verifies earlier studies that P66 is a pore-forming protein in B. burgdorferi. Furthermore, one fraction obtained by anion exchange chromatography of the p66 knock out outer membrane protein preparation showed a uniform channel-forming activity with a single channel conductance of 300 pS. The electrophysically characterization of the 300 pS channel showed that it is not ionselective or voltage dependent. By mass spectrometry using peptide mass finger prints, BB0142 could be identified as the sole channel forming candidate in the active fraction. A BLAST search and a conserved domain search showed that BB0142 is a putative TolC homologue in B. burgdorferi. Furthermore the location of the bb0142 gene within the chromosome is in an operon encoding a multidrug efflux pump. In this study the expression of an outer membrane component of a putative drug efflux system of B. burgdorferi was shown for the first time. In the third part functional studies of the maltooligosaccharide-specific LamB channel were performed. The 3D-structure of LamB suggests that a number of aromatic residues (Y6, Y41, W74, F229, W358 and W420) within the channel lumen is involved in carbohydrate and ion transport. All aromatic residues were replaced by alanine (A) scanning mutagenesis. Furthermore, LamB mutants were created in which one, two, three, four and five aromatic residues were replaced to study their effects on ion and maltopentaose transport through LamB. The purified mutant proteins were reconstituted into lipid bilayer membranes and the single-channel conductance was studied. The results suggest that all aromatic residues provide some steric hindrance for ion transport through LamB. Highest impact is provided by Y6 and Y41, which are localized opposite to Y118, which forms the central constriction of the LamB channel. Stability constants for binding of maltopentaose to the mutant channels were measured using titration experiments with the carbohydrate. The mutation of one or several aromatic amino acids led to a substantial decrease of the stability constant of binding. The highest effect was observed when all aromatic amino acids were replaced by alanine because no binding of maltopentaose could be detected in this case. However, binding was again possible when Y118 was replaced by tryptophane (W). The carbohydrate-induced block of the channel function could also be used for the study of current noise through the different mutant LamB-channels. The analysis of the power density spectra of some of the mutants allowed the evaluation of the on- and off-rate constants (k1 and k-1) of carbohydrate binding to the binding-site inside the channels. The results suggest that both on- and off-rate constants were affected by the mutations. For most mutants k1 decreased and k-1 increased.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Thein2009,
  author    = {Thein, Marcus},
  title     = {Porins of Lyme Disease and Relapsing Fever Spirochetes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35158},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Die Gattung Borrelia geh{\"o}rt zur Abteilung der Spiroch{\"a}ten, einem alten Zweig der Bakteriendom{\"a}ne, der nur entfernt mit Gram-negativen Bakterien verwandt ist. S{\"a}mtliche Arten dieser Gattung sind obligate Parasiten. Borrelien k{\"o}nnen in die Erreger zweier humaner Krankheiten eingeteilt werden: die Lyme-Borreliose und das R{\"u}ckfallfieber. Borrelien besitzen mit 0.91 Mb ein sehr kleines Chromosom und sind daher in ihren metabolischen F{\"a}higkeiten eingeschr{\"a}nkt. Folglich ist das {\"U}berleben s{\"a}mtlicher Borrelienarten absolut abh{\"a}ngig von N{\"a}hrstoffen, die von ihren Wirten bereitgestellt werden. Der Transport dieser N{\"a}hrstoffe und anderer Molek{\"u}le {\"u}ber die {\"a}ußere Membran wird durch porenformende Proteine, so genannte Porine erm{\"o}glicht. Porine sind wassergef{\"u}llte Kan{\"a}le, die in zwei Klassen unterteilt werden k{\"o}nnen: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Aus dem Lyme-Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi wurden bisher drei mutmaßliche Porine charakterisiert und beschrieben: P13, Oms28 und P66. Demgegen{\"u}ber sind die Kenntnisse {\"u}ber Porine in R{\"u}ckfallfieberarten rudiment{\"a}r und es wurde bisher noch kein einziges Porin f{\"u}r Vertreter dieser Krankheit identifiziert. Unter Ber{\"u}cksichtigung dieses Hintergrunds war die allgemeine Zielsetzung dieser Arbeit, einen Einblick in die Porinzusammensetzung von sowohl Lyme Borreliose- als auch R{\"u}ckfallfieber-Spiroch{\"a}ten zu erlangen. Dieses Ziel konnte erreicht werden, indem Porine aus den Außenmembranen von Borrelien isoliert und identifiziert wurden und anschließend biophysikalisch in k{\"u}nstlichen Lipidmembranen charakterisiert wurden. Ein Kapitel dieser Arbeit beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung des ersten Porins aus R{\"u}ckfallfiebererregern. Das porenformende Protein wurde aus den Außenmembranen von Borrelia duttonii, Borrelia hermsii und Borrelia recurrentis isoliert und Oms38 genannt, f{\"u}r „outer membrane-spanning protein of 38 kDa". Die biophysikalische Charakterisierung mit der „black lipid bilayer" Methode zeigte, dass Oms38 kleine, wassergef{\"u}llte Kan{\"a}le mit einer Einzelkanalleitf{\"a}higkeit von 80 pS in 1 M KCl bildet. Diese Kan{\"a}le sind nicht spannungsabh{\"a}ngig und leicht selektiv f{\"u}r Anionen mit einem Permeabilit{\"a}tsverh{\"a}ltnis von Kationen zu Anionen von 0,41 in KCl. Ein homologes Protein zu Oms38 wurde in den Lyme Borreliose Erregern Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii und Borrelia afzelii identifiziert. Das porenformende Protein dieser Arten weist eine hohe Sequenzhomologie zu Oms38 auf und zeigt {\"a}hnliche biophysikalische Eigenschaften, das heißt es formt Poren von 50 pS in 1 M KCl. Durch Titrationsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Pore teilweise durch Dicarboxylate blockiert werden kann. Eine Auswertung dieser Versuche legte nahe, dass dieses Protein keine allgemeine Diffusionspore darstellt, sondern einen Kanal mit einer spezifischen Bindestelle f{\"u}r diese Komponenten. Daher wurde dieses Porin DipA genannt, was f{\"u}r „dicarboxylate-specific porin A" steht. In einer anderen Versuchsreihe wurde gezeigt, dass das Porin P66 sowohl in Lyme Borreliose Erregern als auch in R{\"u}ckfallfieberarten vorhanden ist. Hierf{\"u}r wurden die Außenmembranen der Lyme Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii und Borrelia garinii und der R{\"u}ckfallfieberarten Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis und Borrelia hermsii genauer untersucht. Mit Ausnahme des P66 Homologs von Borrelia hermsii rekonstituierten P66 Proteine aus allen Arten sehr aktiv in k{\"u}nstliche Membranen und formten Poren zwischen 9 und 11 nS in 1 M KCl. Die biophysikalischen Eigenschaften der Homologe wurden in Experimenten mit „black lipid bilayer" Membranen ausf{\"u}hrlich verglichen. Des Weiteren wurden Porendurchmesser und Konstitution des Borrelia burgdorferi Porins P66 genau untersucht. Hierf{\"u}r wurde die P66 Einzelkanalleitf{\"a}higkeit in Anwesenheit von verschiedenen Nichtelektrolyten in k{\"u}nstlichen Lipidmembranen analysiert. Der effektive Durchmesser des P66 Wasserlumens wurde auf ~1.9 nm bestimmt. Dar{\"u}ber hinaus konnte P66 mit bestimmten Nichtelektrolyten wie PEG 400, PEG 600 und Maltohexaose blockiert werden. Weitere Blockierungsexperimente auf Einzelkanalebene deckten sieben Unterzust{\"a}nde von P66 auf, die auf ein P66 Heptamer schließen ließen. Dieser heptamere Charakter konnte durch Blue native PAGE Analysen best{\"a}tigt werden. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von Porinen aus sowohl Lyme Borreliose- als auch R{\"u}ckfallfieber-Borrelien. Erkenntnisse aus dieser Arbeit bringen das Verstehen der N{\"a}hrstoffaufnahme {\"u}ber Außenmembranen dieser streng wirtsabh{\"a}ngigen, pathogenen Spiroch{\"a}ten einen großen Schritt vorw{\"a}rts. Ein fundiertes Wissen {\"u}ber oberfl{\"a}chenexponierte Proteine wie Porine ist Vorraussetzung f{\"u}r die Herstellung erfolgreicher Impfstoffe und Therapeutika gegen die von Borrelien verursachten Krankheiten.},
  subject      = {Porin},
  language  = {en}
}
@phdthesis{BarcenaUribarri2010,
  author    = {Barcena Uribarri, Ivan},
  title     = {Porins in the genus Borrelia : Characterization of P66 and P13},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55339},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die Gattung Borrelia geh{\"o}rt zur Familie der Spirochaetes, welche sich den Gram-negativen Bakterien zuordnen lassen. F{\"u}r diese Familie charakteristisch ist eine l{\"a}ngliche, helikale Form, die L{\"a}ngen von 5 - 250 µm erreichen kann. Den Spirochaeten geh{\"o}ren diverse Pathogene an wie Treponema und Leptospira, die Erreger der Syphillis und der Leptospirose. Borrelien verursachen beim Menschen zwei schwere Krankheiten: Die Lyme-Borreliose (LB) und das R{\"u}ckfallfieber (RF). Als Pathogen besitzen Borrelien einen Lebenszyclus, in dem sie zwischen Gliederf{\"u}ßern als Vektoren und S{\"a}ugetieren (oft kleinen Nagetieren) als Wirt wechseln. Um das {\"U}berleben in derart unterschiedlichen Organismen zu sichern und die Immunantwort des Wirtes zu unterdr{\"u}cken, ben{\"o}tigt ein Organismus mit einem solch komplexen Lebenszyklus eine außergew{\"o}hnliche Regulierung der Proteinexpression. Die Lyme-Borelliose stellt eine multisystemische Krankheit dar, die verschiedene Organe, wie Haut, Gelenke und das Nervensystem betreffen kann. H{\"a}ufig kommt es zu einer sich kreisf{\"o}rmig ausbreitenden R{\"o}tung, die erythema migrans genannt wird, die zur klinischen Diagnose genutzt wird. Sie erscheint nach einem Zeckenbiss und kann einen Durchmesser von bis zu 15 cm weit erreichen. R{\"u}ckfallfieber erkennt man an pl{\"o}tzlich auftretenden Fiebersch{\"u}ben, die von weiteren Symptomen wie Sch{\"u}ttelfrost, Kopfschmerzen, Muskel und Gelenkschmerzen oder {\"U}belkeit begleitet werden. Beide Krankheiten k{\"o}nnen in fr{\"u}hen Stadien der Infektion leicht mit der Gabe von Antibiotika behandelt werden. Die verschiedenen Arten der Gattung Borrelia besitzen ein relativ kleines Genom. Da außerdem viele der vorhandenen Gene f{\"u}r Virulenzfaktoren und wirtsspezifische Anpassungen codieren, fehlen den Borrelien wichtige Genen f{\"u}r die Biosynthese von Aminos{\"a}uren, Fetts{\"a}uren oder Nukleotiden. Diese metabolischen Defizite werden durch die Aufnahme von durch den Wirt produzierten N{\"a}hrstoffen ausgeglichen. Den ersten Schritt der N{\"a}hrstoffaufnahme {\"u}bernehmen Porine. Dies sind wassergef{\"u}llte Kan{\"a}le, die die Aufnahme und den Transport von essentiellen Molek{\"u}len {\"u}ber die {\"a}ußere Membran erm{\"o}glichen. P66, P13 und Oms28 wurden bei Borrelia burgdorferi, Oms38 bei R{\"u}ckfallfieber verursachenden Spirochaeten gefunden. P66 ist ein einzelnes Porin mit einer extrem hohen Leitf{\"a}higkeit von 11 nS. P13 ist ein kleines Protein (13kDa) mit einer α helikalen Sekund{\"a}rstruktur, die keinerlei {\"A}hnlichkeit zu den bisherigen Modellen von bekannten Porinen aufweist. Aufgrund seiner Assoziation mit der periplasmatischen Seite der Membran wurde die Funktion als Porin f{\"u}r Oms28 in letzter Zeit stark angezweifelt. Oms38 ist ein Dicarboxylat-spezifisches Porin mit Homologen bei Lyme-Borreliose verursachenden Arten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war das vorhandene Wissen {\"u}ber P66 und P13 als Porine der Gattung Borrelia zu erweitern. Die beiden Proteine unterscheiden sich strukturell stark von den bisher bekannten Porine Gram-negativer Bakterien und sind daher geeignete Forschungsobjekte, um die speziellen Anforderungen an Borrelienporinen zu erforschen. Das Ziel dieser Arbeit war die Erforschung der beiden in Borrelien beschriebenen Proteine P66 und P13. Gerade weil sich beide in Aufbau und Gr{\"o}ße von bekannten Porinen Gram-negativer Bakterien unterscheiden und somit in spezifische Prozesse bei der Gattung Borrelia involviert sein k{\"o}nnten, ist die Forschung auf diesem Gebiet auch weiterhin von h{\"o}chstem Interesse. Im ersten Projekt dieser Arbeit wurden das Vorkommen und die porenformende Aktivit{\"a}t von P66 in verschiedenen Borrelia-Arten (Lyme-Borreliose und R{\"u}ckfallfieber) untersucht. Bei P66 handelt es sich um das am besten untersuchte Porin der Borrelien, das eine Doppelfunktion als Porin und als Adhesin besitzt. Da sich alle bisherigen Ergebnisse auf B. burgdorferi beziehen, ist wenig bis gar nichts {\"u}ber homologe Proteine in anderen Borrelien-Arten bekannt. Deswegen wurden jeweils drei Arten, die Lyme-Borreliose und R{\"u}ckfallfieber verursachen, ausgew{\"a}hlt und an deren P66-Homologe die porenformende Aktivit{\"a}t {\"u}berpr{\"u}ft. F{\"u}nf von sechs zeigten dabei eine {\"a}hnliche Einzelkanalleitf{\"a}higkeit wie P66, die im Bereich von 9 - 11 nS lagen, bei gleichzeitig kaum vorhandener Selektivit{\"a}t f{\"u}r eine bestimmte Ionensorte. Auch eine Spannungsabh{\"a}ngigkeit, die bei 30 - 70 mV begann, war messbar. Nur im Fall von B. hermsii konnten keine Poren gefunden werden. Dabei ist noch nicht gekl{\"a}rt, ob das Fehlen der porenbildenden Aktivit{\"a}t einem evolution{\"a}ren Verlust der Funktion als Pore oder einer h{\"o}heren Anf{\"a}lligkeit gegen{\"u}ber den verwendeten Detergenzien geschuldet ist. In einem weiteren Projekt wurde der kontrovers diskutierte Porendurchmesser von P66 aus B.burgdorferi mit empirischen Mitteln analysiert. In fr{\"u}heren theoretischen Studien wurde der Kanaldurchmesser auf 2,6 nm gesch{\"a}tzt. Dieser sehr große Durchmesser w{\"u}rde allerdings die Schutzfunktion der Außenmembran verhindern. Mit Hilfe von ungeladenen Substanzen gelang eine Bestimmung des Innendurchmessers von P66 auf 1,8 nm am Eingang und 0,8 nm an der Engstelle der Pore. Zus{\"a}tzlich f{\"u}hrte eine unerwartete Blockierung der Pore durch einige dieser Substanzen zu der Erkenntnis, dass P66 einen oligomeren (wahrscheinlich oktameren) Aufbau besitzt. Ein solcher Aufbau konnte bisher noch nie nachgewiesen werden und k{\"o}nnte von daher ein einzigartiges Merkmal von Borrelien oder Spirochaeten sein. Das dritte Projekt besch{\"a}ftigte sich mit der rekombinanten Produktion eines Proteins von B. burgdorferi mit immunogenen Eigenschaften. Dieses k{\"o}nnte dazu verwendet werden, neue Diagnose Tests und Therapien zu entwickeln. P13 kommt in verschiedenen LB- und RF-Arten vor und besitzt kein bekanntes bakterielles Homolog. Diese Fakten machen aus P13 einen geeigneten Kandidaten als therapeutisches Ziel. Aus diesem Grund wurde das P13-Gen in zwei unterschiedliche Organismen kloniert. Zum einen in E. coli, wo zwei verschiedene Konstrukte zur Kl{\"a}rung der Rolle des periplasmatisch verdauten C-Terminus dienen sollten. Zum anderen in Tabakpflanzen {\"u}ber Agrobacterium tumefaciens, mittels eines Virus. Dabei vermehrt sich der Vektor in den Zellen der Pflanze, breitet sich aus und produziert gleichzeitig das gew{\"u}nschte Protein. Mit Hilfe dieser zweiten Expressionsmethode sollte es m{\"o}glich sein, große Mengen des rekombinanten Proteins zu erzeugen und gleichzeitig die Kosten und den Zeitbedarf zu senken. Das letzte Projekt besch{\"a}ftigte sich mit dem Außenmembran-Komplexom von B. burgdorferi und konzentrierte sich dabei auf die Komplexe von P13 und P66. Blue Native PAGE und 2D-SDS PAGE wurden als Techniken ausgew{\"a}hlt. Es konnte gezeigt werden, dass P66 das einzige Protein ist, das am vermutlich oktameren Aufbau der 11 nS Pore beteiligt ist. Zus{\"a}tzlich gelang es, den Komplex in zwei H{\"a}lften zu spalten, die ungef{\"a}hr das halbe Molekulargewicht bei einer Leif{\"a}higkeit von 5,5 nS zeigten. Im Fall des P13-Komplexes konnte eine m{\"o}gliche Verkn{\"u}pfung mit OspC entdeckt werden. Die Gelelution des Komplexes und anschließende Tests mit Hilfe der Black-Lipid-Bilayer-Methode ergaben eine Aktivit{\"a}t von 0,6 nS. Dies steht im starken Gegensatz zu der vorher f{\"u}r P13beschriebenen Gr{\"o}ße von 3,5 nS. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass P66 ein in vielen Borrelienarten vorkommendes und damit weit verbreitetes Porin mit Homologen in LB- und RF-Spezies ist, die {\"a}hnliche Charakteristika besitzen. Der Durchmesser dieser Pore konnte unter Ber{\"u}cksichtigung der Eigenschaften eines molekularen Siebes genauer bestimmt werden. Im Fall von P13 k{\"o}nnte dessen rekombinante Produktion es erlauben, dieses Protein als Hilfsmittel zur Diagnose und zur medizinischen Therapie einzusetzen. Zus{\"a}tzlich k{\"o}nnte der gefundene Bezug zu OspC dazu beitragen, in Zukunft mehr {\"u}ber die Funktion dieses interessanten Proteins herauszufinden.},
  subject      = {Porins},
  language  = {en}
}