@phdthesis{Zeller2004,
  author    = {Zeller, Michael-Wulf},
  title     = {Untersuchungen zum Scherstress-responsiven Element des PDGF-Promotors},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15779},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Untersuchungen zum Scherstress-responsiven Element des PDGF-Promotors Zellen sind im menschlichen Organismus st{\"a}ndig mechanischen Kr{\"a}ften ausgesetzt. Eine dieser Kr{\"a}fte ist die spezielle Schubkraft, die durch Fl{\"u}ssigkeitsstrom auf Zellen ausge{\"u}bt wird und als Scherstress bezeichnet wird. Die Stimulation von Zellen durch Scherstress f{\"u}hrt zu diversen Reaktionen, die von Wanderungsvorg{\"a}ngen, {\"u}ber Umbau des Zytoskeletts bis hin zur gesteigerten Expression verschiedener Gene reichen. F{\"u}r die Induktion des Gens der B-Kette des Pl{\"a}ttchen-Wachstumsfaktors (PDGF) wurde von Resnick 1993 ein sechs Basenpaare langes cis-aktives Scherstress-responsives Promotorelement (SSRE) identifiziert, das an der Transkriptionsinduktion des Gens durch Scherstress beteiligt ist. In der hier vorliegenden Arbeit sollten die Eigenschaften dieses SSRE gezeigt werden, indem ein Reportergen-Assay mit dem gr{\"u}n fluoreszierenden Proteins EGFP in Zellen der Linie ECV304 ausgetestet wurde. Eine Fragestellung der Arbeit bestand darin, zu pr{\"u}fen ob das SSRE notwendig und ausreichend f{\"u}r die Scherstressresponsivit{\"a}t eines Promotors ist und ob die Expressionsst{\"a}rke des Reporterproteins EGFP mit der St{\"a}rke und Dauer der Scherstressstimulation korreliert. Zudem sollte der Effekt verschiedenar-tiger pharmakologischer Substanzen auf den PDGF-Promotor unter Scherstress gezeigt werden. Dazu wurde ein neues arithmetisches Verfahren entwickelt, das erlaubt, Zellen unter Einwirkung von Scherkraft angemessen zu vermessen und statistisch auszuwerten. Durch den Einsatz des EGFP und einer hochsensitiven ICCD-Photonenkamera war es m{\"o}glich, die Messung der Expressionskinetik des Reportergens in Echtzeit durchzuf{\"u}h-ren. Dabei konnte gezeigt werden, dass in ECV304-Zellen unter Scherstress von 0,5, 12 und 30 dyn/cm² die Expression des intakten PDGF-Promotors mit der St{\"a}rke und Dauer der Scherstressstimulation korreliert. Dieser Effekt ist nicht zu beobachten, wenn das SSRE aus dem PDGF-Promotor entfernt wird. Ebenfalls zu keiner Steigerung der Genexpression kommt es, wenn das Reportergen hinter den Promotor des Cytomegalie-Virus (CMV) geschaltet ist, der kein bekanntes Scherstress-responsives Promotor-Element enth{\"a}lt. Inseriert man in den CMV-Promotor das SSRE, so zeigt der Promotor unter Scherstress-Einwirkung ebenfalls eine gesteiger-te Expression, die allerdings hinter der des PDGF-Vollkonstrukts zur{\"u}ckbleibt. Es konnte damit gezeigt werden, dass das SSRE in einen nicht Scherstress-responsiven Promotor verbracht diesen f{\"u}r Str{\"o}mungskr{\"a}fte suszeptibel macht. Der PDGF-Promotor enth{\"a}lt eine bekannte Phorbolester-Bindungsstelle. In der vorlie-genden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ECV304-Zellen bei Inkubation in mit Phor-bolester versetztem Medium die Transkription des Reportergens deutlich steigern. Ebenfalls zu einer Steigerung der Expression des PDGF-Vollkonstrukts kommt es bei appliziertem Scherstress von 12 dyn/cm² und gleichzeitiger Hemmung der Proteinkinase C (PK-C). Zwar zeigt die Hemmung mit Chelerythrin eine schw{\"a}chere Lichtintensit{\"a}ts-zunahme, wie sie beim Einsatz von Calphostin C, beide Messungen ergaben aber eine Steigerung der Lichtintensit{\"a}t gegen{\"u}ber der Messung des PDGF-Vollkonstrukts bei 12 dyn/cm² in normalem Kulturmedium.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Dziewior2001,
  author    = {Dziewior, Frank},
  title     = {Messung der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration in Gef{\"a}ßendothelzellen unter rheologischer Beanspruchung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181128},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Die den Zellstoffwechsel und das Zytoskelett betreffenden Adaptationsvorg{\"a}nge in Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung sind von besonderem klinischen Interesse, da Gef{\"a}ßwandsch{\"a}den eine entscheidende pathogenetische Relevanz bei der Entstehung vaskul{\"a}rer Erkrankungen wie z.B. der Arteriosklerose zukommt. Der intrazellul{\"a}re Signalweg, {\"u}ber den die Zelle einen rheologischen Reiz in eine entsprechende Zellantwort umsetzt, ist bisher weitgehend ungekl{\"a}rt geblieben, wobei eine Erh{\"o}hung der zytosolischen Calciumkonzentration als Signalgeber diskutiert wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen Messplatz zu etablieren, der es gestattet, Ver{\"a}nderungen in der zytosolischen Calciumkonzentration in kultivierten Endothelzellen nach Applikation von Ca2+-erh{\"o}henden Agonisten, Calciumionophoren sowie w{\"a}hrend rheologischer Beanspruchung in Echtzeit zu dokumentieren. Die Eignung des verwendeten rheologischen Systems f{\"u}r Scherstressexperimente konnte durch die Beobachtung der f{\"u}r Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung typischen zytoskelettalen Umbauvorg{\"a}nge im Sinne einer Neuordnung der Aktinfilamente mit der Ausbildung von Stressfasern gezeigt werden. Erstmalig konnte dabei auch die Reaktion mikrovaskul{\"a}rer Endothelzellen der MyEnd-Zelllinie der Maus auf Scherstressbeanspruchung gesehen werden. Bei diesen Zellen konnte eine Vermehrung des F-Aktin-Gehaltes beobachtet werden, im Gegensatz zu kultivierten Endothelzellen des Truncus pulmonalis des Hausschweins blieb aber eine signifikante Bildung von Stressfasern aus. Diese unterschiedliche Verhalten ist wahrscheinlich der andersartigen Zellmorphologie der MyEnd-Zellen zuzuschreiben. Es konnte in zwei verschiedenen Endothelzellsystemen gezeigt werden, daß Gef{\"a}ßendothelzellen den Kontakt mit verschiedenen endogenen Stimuli bzw. Calciumionophoren mit einer zytosolischen Calciumerh{\"o}hung unterschiedlichen Ausmaßes beantworten. Bei einsetzendem oder sich verst{\"a}rkenden Fl{\"u}ssigkeitsscherstress konnte von uns hingegen keine Calciumantwort beobachtet werden. An der Induktion zytoskelettaler Umbauvorg{\"a}nge scheint Calcium als Botenstoff in den hier untersuchten Zellsystemen also nicht prim{\"a}r beteiligt zu sein},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Altmann2023,
  author    = {Altmann, Stephan},
  title     = {Characterization of Metabolic Glycoengineering in Mesenchymal Stromal Cells for its Application in thermoresponsive Bioinks},
  doi       = {10.25972/OPUS-29100},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-291003},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {This work developed during the first funding period of the subproject B05 in the framework of the interdisciplinary research consortium TRR 225 'From the Fundamentals of Biofabrication toward functional Tissue Models' and was part of a cooperation between the Orthopedic Department represented by Prof. Dr. Regina Ebert and the Institute of Organic Chemistry represented by Prof. Dr. J{\"u}rgen Seibel. This project dealed with cellular behavior during the bioprinting process and how to influence it by modifying the cell glycocalyx with functional target molecules. The focus was on the impact of potential shear stress, that cells experience when they get processed in thermoresponsive bioinks, and a way to increase the cell stiffness via metabolic glycoengineering to attenuate shear forces. For the characterization of the metabolic glycoengineering, four different peracetylated and four non-acetylated modified monosaccharides (two mannose and two sialic acid sugars) were tested in primary human mesenchymal stromal cells (hMSC) and telomerase-immortalized hMSC (hMSC-TERT). Viability results demonstrated a dose-dependent correlation for all sugars, at which hMSC-TERT seemed to be more susceptible leading to lower viability rates. The assessment of the incorporation efficiencies was performed by click chemistry using fluorescent dyes and revealed also a dose-dependent correlation for all mannose and sialic acid sugars, while glucose and galactose variants were not detected in the glycocalyx. However, incorporation efficiencies were highest when using mannose sugars in the primary hMSC. A subsequent analysis of the temporal retention of the incorporated monosaccharides showed a constant declining fluorescence signal up to 6 d for azido mannose in hMSC-TERT, whereas no signal could be detected for alkyne mannose after 2 d. Investigation of the differentiation potential and expression of different target genes revealed no impairment after incubation with mannose sugars, indicating a normal phenotype for hMSC-TERT. Following the successful establishment of the method, either a coumarin derivative or an artificial galectin 1 ligand were incorporated into the cell glycocalyx of hMSC-TERT as functional target molecule. The biophysical analysis via shear flow deformation cytometry revealed a slightly increased cell stiffness and lowered fluidity for both molecules. A further part of this project aimed to control lectin-mediated cell adhesion by artificial galectin 1 ligands. As that hypothesis was settled in the work group of Prof. Dr. J{\"u}rgen Seibel, this work supported with an initial characterization of galectin 1 as part of the hMSC biology. A stable galectin 1 expression at gene and protein level in both hMSC and hMSC-TERT could be confirmed, at which immunocytochemical stainings could detect the protein only in the glycocalyx. The treatment of hMSC-TERT with a galectin 1 ligand in different concentrations did not show an altered gene expression of galectin 1. However, these first data in addition to the investigation of stiffness confirmed the applicability of specific and artificial IV galectin 1 ligands in biofabrication approaches to alter cell properties of hMSC. To conclude, metabolic glycoengineering has been successfully implemented in hMSC and hMSC-TERT to introduce glycocalyx modifications which reside there for several days. A proof of concept was carried out by the increase of cell stiffness and fluidity by the incorporation of a coumarin derivative or an artificial galectin 1 ligand. For the characterization of shear stress impact on cells after printing in thermoresponsive bioinks, the processing of hMSC-TERT (mixing or additionally printing) with Pluronic F127 or Polyoxazoline-Polyoxazine (POx-POzi) polymer solution was investigated. While there were no changes in viability when using POx-POzi bioink, processing with Pluronic F127 indicated slightly lower viability and increased apoptosis activity. Assessment of cellular responses to potential shear stress showed no reorganization of the cytoskeleton independent of the bioink, but highly increased expression of the mechanoresponsive proto-oncogene c Fos which was more pronounced when using Pluronic F127 and just mixed with the bioinks. Interestingly, processing of the mechanoresponsive reporter cell line hMSC-TERT-AP1 revealed slightly elevated mechanotransduction activity when using POx-POzi polymer and just mixed with the bioinks as well. In conclusion, hMSC-TERT embedded in thermoresponsive bioinks might shortly experience shear stress during the printing process, but that did not lead to remarkable cell damage likely due to the rheological properties of the bioinks. Furthermore, the printing experiments also suggested that cells do not sense more shear stress when additionally printed.},
  subject      = {Glykobiologie},
  language  = {en}
}