@phdthesis{Fuhl2024,
  author    = {Fuhl, Isabell},
  title     = {Untersuchung der synaptischen Lokalisation des heteromeren Glycin-Rezeptors in einem neuen Mausmodell der \(Startle\) Erkrankung - mit Fokus auf die GlyR-β-Untereinheit -},
  doi       = {10.25972/OPUS-34832},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-348328},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {Der Glycin-Rezeptor ist Teil der inhibitorischen liganden-gesteuerten Ionenkan{\"a}le im ZNS und wird am st{\"a}rksten im adulten R{\"u}ckenmark sowie im Hirnstamm exprimiert. In der Nerv-Muskel-Synapse sind GlyR f{\"u}r die rekurrente Hemmung der Motoneuronen wichtig und steuern das Gleichgewicht zwischen Erregung und Hemmung der Muskelzellen. F{\"u}r die glycinerge Neurotransmission sind neben den pr{\"a}synaptischen GlyR 𝛼1 insbesondere postsynaptische GlyR 𝛼1/𝛽 verantwortlich. Durch Mutationen des GlyR entsteht das Erkrankungsbild der Hyperekplexie mit {\"u}bersteigerter Schreckhaftigkeit, Muskelsteifheit und Apnoe. Haupturs{\"a}chlich daf{\"u}r sind Mutationen im GLRA1-Gen. Die shaky Maus stellt ein gutes Modell zur Erforschung dieser seltenen Erkrankung dar. Die shaky Missense-Mutation Q177K in der extrazellul{\"a}ren 𝛽8-𝛽9 Schleife der Glycin- Rezeptor-𝛼1-Untereinheit zeigte strukturell ein gest{\"o}rtes Wasserstoffbr{\"u}ckennetzwerk. Funktionell konnten eingeschr{\"a}nkt leitf{\"a}hige Ionenkan{\"a}le identifiziert werden. Der letale Ph{\"a}notyp {\"a}ußert sich beim homozygoten shaky Tier durch Schrecksymptome mit einem einhergehenden zunehmenden Gewichtsverlust. Die Quantifizierung der Oberfl{\"a}chenexpression deutete auf einen Verlust synaptischer GlyR 𝛼1/𝛽 hin. Aussagen bez{\"u}glich der GlyR-𝛽-Untereinheit, die Teil des synaptischen GlyR Komplexes ist, waren aufgrund fehlender stabiler Antik{\"o}rper bisher nicht m{\"o}glich. Das neuartige KI- Mausmodell Glrb eos exprimiert endogen fluoreszierende 𝛽 -Untereinheiten und erm{\"o}glicht damit erstmalig eine Betrachtung der GlyR- 𝛽-Expression in Tiermodellen der Startle Erkrankung. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der shaky Mutation auf die Interaktion mit der 𝛽 -Untereinheit und Gephyrin zu erforschen. Daf{\"u}r wurden Markerproteine der glycinergen Synapse in R{\"u}ckenmarksneuronen der Kreuzung Glrb eos x Glra1 sh gef{\"a}rbt und quantifiziert. Die durchgef{\"u}hrte Gewichtsbestimmung der Nachkommen im zeitlichen Verlauf zeigte keinen Einfluss der eingef{\"u}gten mEos4b-Sequenz auf das K{\"o}rpergewicht der Tiere und schließt damit funktionelle Einschr{\"a}nkungen bedingt durch die mEos4b-Sequenz aus. Zur Verst{\"a}rkung des 𝛽 eos-Signals wurde ein Antik{\"o}rper verwendet. Die Quantifizierung der GlyR- 𝛽- Untereinheit an R{\"u}ckenmarksneuronen zeigte f{\"u}r homozygote shaky Tiere im Vergleich zum Wildtyp signifikant reduzierte 𝛽eos Oberfl{\"a}chenexpressionen in Gephyrin Clustern sowie signifikant erniedrigte Kolokalisationen von Gephyrin/𝛼1, 𝛽eos/𝛼1 und 𝛽eos/Gephyrin. Die mutierte GlyR-𝛼1- Untereinheit wurde hingegen vermehrt an der Oberfl{\"a}che in shaky Tieren exprimiert. Die Ergebnisse der R{\"u}ckenmarksschnitte unterst{\"u}tzen diese Befunde aus den Prim{\"a}rneuronen. Die Untersuchung der Pr{\"a}synapse erbrachte f{\"u}r Glrb eos/eos x Glra1 sh/sh eine signifikant verminderte Synapsin und Synapsin/𝛼1 Expression. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern die Daten fr{\"u}herer Arbeiten zur shaky Maus und zeigen einen starken Verlust synaptischer GlyR 𝛼 1/ 𝛽 an der Oberfl{\"a}che von Motoneuronen. Ein m{\"o}glicher kompensatorischer Versuch durch erh{\"o}hte 𝛼1 Expression bleibt infolge der Funktionsbeeintr{\"a}chtigung dieser mutierten GlyR- 𝛼 1 Rezeptoren erfolglos mit letalem Ausgang. In vorherigen Arbeiten wurde vermutet, dass die Mutation in der extrazellul{\"a}ren Bindungsstelle in der Lage ist, Konformations{\"a}nderungen in die TM3-TM4-Schleifenstruktur zu {\"u}bertragen und dadurch die Gephyrin Bindung und synaptische Verankerung zu st{\"o}ren. Die Daten dieser Arbeit st{\"u}tzen diese Annahme und weisen dar{\"u}ber hinaus auf eine gest{\"o}rte Rezeptorkomplexbindung hin. Die vorliegende Arbeit tr{\"a}gt somit zum besseren Verst{\"a}ndnis der Startle Erkrankung auf synaptischer Ebene bei.},
  subject      = {Glycinrezeptor},
  language  = {de}
}
@article{PiroEckesKasaragodetal.2021,
  author    = {Piro, Inken and Eckes, Anna-Lena and Kasaragod, Vikram Babu and Sommer, Claudia and Harvey, Robert J. and Schaefer, Natascha and Villmann, Carmen},
  title     = {Novel Functional Properties of Missense Mutations in the Glycine Receptor β Subunit in Startle Disease},
  series = {Frontiers in Molecular Neuroscience},
  volume    = {14},
  journal   = {Frontiers in Molecular Neuroscience},
  issn      = {1662-5099},
  doi       = {10.3389/fnmol.2021.745275},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-246676},
  year      = {2021},
  abstract  = {Startle disease is a rare disorder associated with mutations in GLRA1 and GLRB, encoding glycine receptor (GlyR) α1 and β subunits, which enable fast synaptic inhibitory transmission in the spinal cord and brainstem. The GlyR β subunit is important for synaptic localization via interactions with gephyrin and contributes to agonist binding and ion channel conductance. Here, we have studied three GLRB missense mutations, Y252S, S321F, and A455P, identified in startle disease patients. For Y252S in M1 a disrupted stacking interaction with surrounding aromatic residues in M3 and M4 is suggested which is accompanied by an increased EC\(_{50}\) value. By contrast, S321F in M3 might stabilize stacking interactions with aromatic residues in M1 and M4. No significant differences in glycine potency or efficacy were observed for S321F. The A455P variant was not predicted to impact on subunit folding but surprisingly displayed increased maximal currents which were not accompanied by enhanced surface expression, suggesting that A455P is a gain-of-function mutation. All three GlyR β variants are trafficked effectively with the α1 subunit through intracellular compartments and inserted into the cellular membrane. In vivo, the GlyR β subunit is transported together with α1 and the scaffolding protein gephyrin to synaptic sites. The interaction of these proteins was studied using eGFP-gephyrin, forming cytosolic aggregates in non-neuronal cells. eGFP-gephyrin and β subunit co-expression resulted in the recruitment of both wild-type and mutant GlyR β subunits to gephyrin aggregates. However, a significantly lower number of GlyR β aggregates was observed for Y252S, while for mutants S321F and A455P, the area and the perimeter of GlyR β subunit aggregates was increased in comparison to wild-type β. Transfection of hippocampal neurons confirmed differences in GlyR-gephyrin clustering with Y252S and A455P, leading to a significant reduction in GlyR β-positive synapses. Although none of the mutations studied is directly located within the gephyrin-binding motif in the GlyR β M3-M4 loop, we suggest that structural changes within the GlyR β subunit result in differences in GlyR β-gephyrin interactions. Hence, we conclude that loss- or gain-of-function, or alterations in synaptic GlyR clustering may underlie disease pathology in startle disease patients carrying GLRB mutations.},
  language  = {en}
}
@article{SchaeferRoemerJanzenetal.2018,
  author    = {Schaefer, Natascha and Roemer, Vera and Janzen, Dieter and Villmann, Carmen},
  title     = {Impaired Glycine Receptor Trafficking in Neurological Diseases},
  series = {Frontiers in Molecular Neuroscience},
  volume    = {11},
  journal   = {Frontiers in Molecular Neuroscience},
  number    = {291},
  doi       = {10.3389/fnmol.2018.00291},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-227531},
  pages     = {1-24},
  year      = {2018},
  abstract  = {Ionotropic glycine receptors (GlyRs) enable fast synaptic neurotransmission in the adult spinal cord and brainstem. The inhibitory GlyR is a transmembrane glycinegated chloride channel. The immature GlyR protein undergoes various processing steps, e.g., folding, assembly, and maturation while traveling from the endoplasmic reticulum to and through the Golgi apparatus, where post-translational modifications, e.g., glycosylation occur. The mature receptors are forward transported via microtubules to the cellular surface and inserted into neuronal membranes followed by synaptic clustering. The normal life cycle of a receptor protein includes further processes like internalization, recycling, and degradation. Defects in GlyR life cycle, e.g., impaired protein maturation and degradation have been demonstrated to underlie pathological mechanisms of various neurological diseases. The neurological disorder startle disease is caused by glycinergic dysfunction mainly due to missense mutations in genes encoding GlyR subunits (GLRA1 and GLRB). In vitro studies have shown that most recessive forms of startle disease are associated with impaired receptor biogenesis. Another neurological disease with a phenotype similar to startle disease is a special form of stiff-person syndrome (SPS), which is most probably due to the development of GlyR autoantibodies. Binding of GlyR autoantibodies leads to enhanced receptor internalization. Here we focus on the normal life cycle of GlyRs concentrating on assembly and maturation, receptor trafficking, post-synaptic integration and clustering, and GlyR internalization/recycling/degradation. Furthermore, this review highlights findings on impairment of these processes under disease conditions such as disturbed neuronal ER-Golgi trafficking as the major pathomechanism for recessive forms of human startle disease. In SPS, enhanced receptor internalization upon autoantibody binding to the GlyR has been shown to underlie the human pathology. In addition, we discuss how the existing mouse models of startle disease increased our current knowledge of GlyR trafficking routes and function. This review further illuminates receptor trafficking of GlyR variants originally identified in startle disease patients and explains changes in the life cycle of GlyRs in patients with SPS with respect to structural and functional consequences at the receptor level.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kitzenmaier2020,
  author    = {Kitzenmaier, Alexandra},
  title     = {GlyT2-Mutationen als zweith{\"a}ufigste Ursache bei Hyperekplexie - Pathologischer Mechanismus der Mutation P429L},
  doi       = {10.25972/OPUS-20257},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-202574},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Mutationen im Glycintransporter 2 (GlyT2) stellen die pr{\"a}synaptische Komponente der neurologischen Erkrankung Hyperekplexie oder Startle Disease dar. Der neuronale Na+/Cl- -abh{\"a}ngige GlyT2 ist f{\"u}r das Recycling von Glycin verantwortlich und bildet an inhibitorischen glycinergen Synapsen die Hauptquelle des freigesetzten Transmitters. Dominante, rezessive und zusammengesetzte heterozygote Mutationen wurden bereits identifiziert, von denen die meisten zu einer beeintr{\"a}chtigten Glycinaufnahme f{\"u}hren. In dieser Arbeit konnten wir eine neue pathogene Mutation innerhalb des neuronalen Glycintransporter-2-Gens (SLC6A5, OMIM604159) in einer Familie identifizieren, in der beide Elternteile heterozygote Tr{\"a}ger waren. Ein homozygotes Kind litt an schweren neuromotorischen Defiziten, wohingegen Heterozygote keine Symptome aufwiesen. Die neue rezessive Mutation c.1286C>T erzeugte einen missense Aminos{\"a}ureaustausch von Prolin gegen Leucin an Position 429 (pP429L) in der Transmembrandom{\"a}ne 5. Wir haben die GlyT2P429L-Variante mittels Homologiemodellierung, immuncytochemischer F{\"a}rbungen, Western Blot Analysen, Biotinylierung und funktioneller Glycinaufnahmetests charakterisiert. Der mutierte GlyT2 zeigte beim Proteintransport durch verschiedene intrazellul{\"a}re Kompartimente zur Zelloberfl{\"a}che keine Defizite. Die gesamte Proteinexpression war jedoch signifikant verringert. Obwohl GlyT2P429L an der Zelloberfl{\"a}che vorhanden ist, zeigte er einen Verlust der Proteinfunktion. Die Co-Expression der Mutante mit dem Wildtyp-Protein, die die Situation der Eltern widerspiegelte, hatte keinen Einfluss auf die Transporterfunktion und erkl{\"a}rte somit ihren nicht symptomatischen Ph{\"a}notyp. Wenn jedoch die Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Protein im {\"U}berschuss exprimiert wurde, war die Glycinaufnahme signifikant verringert. Die Strukturanalyse ergab, dass der eingef{\"u}hrte Leucinrest an Position 429 zu Konformations{\"a}nderungen in der α-Helix 5 f{\"u}hrt, die in unmittelbarer N{\"a}he zur Natriumbindungsstelle des Transporters lokalisiert sind. Dies deutet darauf hin, dass die Zugangsmechanismen des GlyT2 gest{\"o}rt sein k{\"o}nnten und einen vollst{\"a}ndigen Verlust der Transportaktivit{\"a}t verursachen. Unsere Ergebnisse belegen, dass P429 in GlyT2 ein strukturell wichtiger Aminos{\"a}urerest ist, der eine wichtige funktionelle Rolle beim Glycintransport spielt.},
  subject      = {Glycin},
  language  = {de}
}
@article{SchaeferZhengvanBrederodeetal.2018,
  author    = {Schaefer, Natascha and Zheng, Fang and van Brederode, Johannes and Berger, Alexandra and Leacock, Sophie and Hirata, Hiromi and Paige, Christopher J. and Harvey, Robert J. and Alzheimer, Christian and Villmann, Carmen},
  title     = {Functional Consequences of the Postnatal Switch From Neonatal to Mutant Adult Glycine Receptor α1 Subunits in the Shaky Mouse Model of Startle Disease},
  series = {Frontiers in Molecular Neuroscience},
  volume    = {11},
  journal   = {Frontiers in Molecular Neuroscience},
  number    = {167},
  issn      = {1662-5099},
  doi       = {10.3389/fnmol.2018.00167},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-196056},
  year      = {2018},
  abstract  = {Mutations in GlyR α1 or β subunit genes in humans and rodents lead to severe startle disease characterized by rigidity, massive stiffness and excessive startle responses upon unexpected tactile or acoustic stimuli. The recently characterized startle disease mouse mutant shaky carries a missense mutation (Q177K) in the β8-β9 loop within the large extracellular N-terminal domain of the GlyR α1 subunit. This results in a disrupted hydrogen bond network around K177 and faster GlyR decay times. Symptoms in mice start at postnatal day 14 and increase until premature death of homozygous shaky mice around 4-6 weeks after birth. Here we investigate the in vivo functional effects of the Q177K mutation using behavioral analysis coupled to protein biochemistry and functional assays. Western blot analysis revealed GlyR α1 subunit expression in wild-type and shaky animals around postnatal day 7, a week before symptoms in mutant mice become obvious. Before 2 weeks of age, homozygous shaky mice appeared healthy and showed no changes in body weight. However, analysis of gait and hind-limb clasping revealed that motor coordination was already impaired. Motor coordination and the activity pattern at P28 improved significantly upon diazepam treatment, a pharmacotherapy used in human startle disease. To investigate whether functional deficits in glycinergic neurotransmission are present prior to phenotypic onset, we performed whole-cell recordings from hypoglossal motoneurons (HMs) in brain stem slices from wild-type and shaky mice at different postnatal stages. Shaky homozygotes showed a decline in mIPSC amplitude and frequency at P9-P13, progressing to significant reductions in mIPSC amplitude and decay time at P18-24 compared to wild-type littermates. Extrasynaptic GlyRs recorded by bath-application of glycine also revealed reduced current amplitudes in shaky mice compared to wild-type neurons, suggesting that presynaptic GlyR function is also impaired. Thus, a distinct, but behaviorally ineffective impairment of glycinergic synapses precedes the symptoms onset in shaky mice. These findings extend our current knowledge on startle disease in the shaky mouse model in that they demonstrate how the progression of GlyR dysfunction causes, with a delay of about 1 week, the appearance of disease symptoms.},
  language  = {en}
}