@phdthesis{Glenz2005,
  author    = {Glenz, Karin},
  title     = {Entwicklung eines Lipoprotein-Impfstoffes aus Pflanzen : Produktion des rekombinanten 'outer surface protein A' (OspA) von Borrelia burgdorferi in Tabakchloroplasten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15884},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Transgene Pflanzen nehmen einen wachsenden Stellenwert bei der Produktion therapeutischer Proteine, besonders von Impfstoffen, ein. Einige dieser Proteine ben{\"o}tigen f{\"u}r ihre Funktionalit{\"a}t verschiedenste post-translationale Modifikation und es ist nicht bekannt, ob Pflanzen zu diesen Stoffwechselleistungen bef{\"a}higt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte anhand eines bakteriellen Antigens gepr{\"u}ft werden, ob in Chloroplasten von Nicotiana tabacum an einem rekombinanten Protein eine besondere Form der post-translationalen Modifikation, die Lipidierung, durchgef{\"u}hrt wird und ob somit ein alternatives Produktionssystem f{\"u}r einen Lipoprotein-Impfstoff entwickelt werden kann. Basis f{\"u}r diese Untersuchungen war das bakterielle Lipoprotein OspA (outer surface protein A) aus Borrelia burgdorferi. Dieses Protein wird zur Pr{\"a}vention von Lyme-Borreliose eingesetzt und fr{\"u}here Untersuchungen zeigten, dass OspA sowohl in B. burgdorferi als auch nach heterologer Expression in E. coli einer post-translationalen Lipidierung am N-Terminus unterliegt. Dabei wird das Protein unter Mitwirkung dreier Enzyme (Lgt, Lsp und Lnt) am N-Terminus mit einer Pam3Cys-Struktur versehen und die N-terminale Signalsequenz abgespalten. In dieser Arbeit konnten nach der Etablierung eines Expressionssystems mehrere unabh{\"a}ngige transplastome OspA-Tabakpflanzen generiert werden. Der Anteil an rekombinantem, plastid{\"a}rem OspA (rpOspA) am l{\"o}slichen Gesamtprotein wurde mit ca. 1\% bestimmt. Dabei lag rpOspA sowohl in einer lipidierten, membrangebundenen als auch in einer nicht-modifizierten, l{\"o}slichen Form vor. Strukturelle Untersuchungen an rpOspA ergaben, dass in Chloroplasten eine Bakterien-{\"a}hnliche Lipidierung an dem Protein durchgef{\"u}hrt wurde. Dabei wurde am N-Terminus ein Diacylglycerin {\"u}ber eine Thioetherbindung an das einzige in der Sequenz vorkommende Cystein gebunden. Anders als in Bakterien wurde die Signalsequenz in Chloroplasten jedoch nicht abgespalten und infolgedessen keine dritte Fetts{\"a}ure an das Cystein gebunden. Die plastid{\"a}re Modifikation an rekombinantem OspA resultierte daher in einer Pam2Cys-Struktur mit Signalsequenz. Untersuchungen zur Immunogenit{\"a}t des rpOspA in M{\"a}usen zeigten eindeutig, dass das rekombinante Protein aus Tabak die Bildung spezifischer Antik{\"o}rper induziert und damit in seiner Wirkung vergleichbar dem bakteriellen Protein ist. Um die Lipidierungsrate des akkumulierten OspA in Chloroplasten zu erh{\"o}hen, wurden weitere transplastome Tabakpflanzen generiert. Diese wiesen neben dem ospA-Gen auch die Gene (lgt, lsp und lnt) der drei modifizierenden Enzyme aus E. coli auf. Durch die simultane Bildung von OspA und den drei modifizierenden Enzyme konnte eine quantitative Lipidierung von rpOspA mit einer Pam2Cys-Struktur erlangt werden. Als Grundlage f{\"u}r vergleichende Untersuchungen zwischen plastid{\"a}rer und cytoplasmatischer Lipidmodifikation in Tabak wurden ebenfalls Transformationen des Zellkerns mit ospA durchgef{\"u}hrt, wobei jedoch keine heterologe ospA-Expression erreicht werden konnte. Erst durch die Anwendung eines transienten, viralen Expressionssystems war es m{\"o}glich, ospA im Zellkern zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in Chloroplasten H{\"o}herer Pflanzen eine Bakterien-{\"a}hnliche Modifikation an rekombinantem OspA durchgef{\"u}hrt wird und das resultierende Protein eine spezifische Immunantwort in M{\"a}usen induzieren kann. Das Potential von transgenen Pflanzen als alternatives Produktionssystem f{\"u}r Lipoprotein-Impfstoffe wird diskutiert.},
  subject      = {Lyme-Krankheit},
  language  = {de}
}