@phdthesis{Taupp2005,
  author    = {Taupp, Marcus},
  title     = {Biotransformation von N-Alkyl- und N,N-Dialkylarylaminen durch Bacillus megaterium},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17320},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurden Studien zur bakteriellen Biotransformation von N Alkyl- sowie N,N Dialkylarylaminen mit dem Ziel der arylischen Hydroxy-lierung und N-Dealkylierung durchgef{\"u}hrt. Bodenproben wurden einem Screening-Verfahren unterworfen, um selektiv nach Mikroorganismen zu suchen, die zu den genannten Biotransformationen f{\"a}hig waren. In einem Screeningverfahren wurden unter Verwendung von N-Ethyl-N methyl-anilin als Standardsubstrat aus Boden-proben Mikroorganismen isoliert und auf ihre F{\"a}higkeit zur Biotransformation {\"u}berpr{\"u}ft. Einer der isolierten St{\"a}mme setzte das zugef{\"u}hrte Substrat effizient und reproduzierbar zu drei Hauptprodukten um. Deren Strukturaufkl{\"a}rung erfolgte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) sowie anhand ein-dimensionaler NMR-Experimente (1H-NMR und 13C-NMR). Identifiziert wurden zwei hydroxylierte Produkte, N Ethyl-N-methyl-2-aminophenol und N-Ethyl-N-methyl-4-aminophenol, ferner wurde N-Ethylanilin, das N Demethylierungsprodukt gebildet. Die Identit{\"a}ten wurden durch synthetisierte Referenzsubstanzen best{\"a}tigt. Die ph{\"a}notypische und genotypische Charakterisierung dieses Bodenisolates als Bacillus megaterium erfolgte mittels mikroskopischer und f{\"a}rbetechnischer Methoden sowie der 16S rDNA-Sequenzierung. Zur eindeutigen Zuordnung wurde eine DNA/DNA-Hybridisierung gegen{\"u}ber dem Bacillus megaterium Type-strain (DSM 32, ATCC 14581t) durchgef{\"u}hrt. In einem erweiterten Substratscreening wurden die strukturellen Voraussetzungen zur Biotransformation von N-Alkyl- und N,N Dialkylarylaminen durch Bacillus megaterium ermittelt. Ausf{\"u}hrlich sind Sub-stituenteneffekte in Bezug auf Hydroxylierung und N-Dealkylierung untersucht worden. Sperrige und r{\"a}umlich große Substrate wie N,N,N´,N´-Tetramethyl-p,p´ benzidin als auch N,N,N´,N´-Tetramethyl-p-benzidin wurden nicht hydro-xyliert; allerdings fand bei beiden Substrate eine N-Demethylierung statt, wobei das Erstere st{\"a}rker N demethyliert wurde. Der Effekt des Austausches von Stickstoff gegen Phosphor in einigen Substraten wurde ebenfalls untersucht. So kamen Dimethylphenylphosphin und Diethylphenylphosphin mit Bacillus megaterium zur Anwendung. Phosphor-haltige Substrate wurden von B. megaterium nicht umgesetzt. Durch Versuche mit verschiedenen Induktoren und Repressoren wurde die Cytochrom-P-450-Aktvit{\"a}t des isolierten Bacillus megaterium bei der Bio-transformation von N,N-Diethylanilin untersucht. Hierbei wurde gezeigt, dass durch bestimmte Barbiturate die arylische Hydroxylierung als auch die N Deethylierung gesteigert wurden. Repression der Hydroxylierungs- und N Dealkylierungsaktivit{\"a}t zeigte sich durch Metyrapon, n-Octylamin, Pyridin und Imidazol. Die von Bacillus megaterium durchgef{\"u}hrte N-Demethylierung von N,N Dimethylanilin sowie N-Ethyl-N-methylanilin wurde im Hinblick auf Formaldehydbildung untersucht. Dies erfolgte im Inkubationsmedium direkt in-situ, mittels Cysteamin-Zugabe in das Medium, mit Umsetzung zu Thiazolidin. Anhand von Inkubationsversuchen mit den stabil-isotopenmarkierten Substraten N,N-Di-(trideuteromethyl)-anilin und N-Ethyl-N (trideuteromethyl)-anilin sowie N,N-Di-[methyl-13C]-anilin und N-Ethyl-N [methyl-13C]-anilin wurde anhand der Massenspektren der gebildeten Thiazolidine eindeutig festgestellt, dass die Methylgruppe als Formaldehyd abgespalten wird. Das Potential von Bacillus megaterium zur N-Dealkylierung wurde zur mikrobiellen N Demethylierung von nat{\"u}rlichem N-Methyl-methyl-anthranilat genutzt. Dadurch wurde der nat{\"u}rliche Aromastoff Methylanthranilat gewonnen. Zur Optimierung der bakteriellen Biotransformation von N-Methyl-methyl-anthranilat zu Methylanthranilat wurden in Bezug auf Wachstumsmedium, Inkubationstemperatur, pH-Wert des Inkubationsmediums sowie Substrat-konzentration verschiedene Variationen durchgef{\"u}hrt. Die antimikrobiellen Eigenschaften von N-Methyl-methylanthranilat und Methylanthranilat gegen{\"u}ber Bacillus megaterium wurden durch Hemmhofbildung sowie der Bestimmung der Inhibierungskonzentration im Fl{\"u}ssigmedium nachgewiesen. Sowohl Substrat als auch Produkt erwiesen sich in den unterschiedlichen Tests als antibakteriell. Im Anschluß an Versuche zur Immobilisierung, die zu geringeren Ausbeuten f{\"u}hrten, erfolgten schließlich Umsetzungen im Bioreaktor. Hierbei ließen sich die bei den Sch{\"u}ttelkulturen erhaltenen Ergebnisse direkt proportional auf den Fermenter {\"u}bertragen.},
  subject      = {Bacillus megaterium},
  language  = {de}
}