@phdthesis{Haker2021, author = {Haker, Felix}, title = {Entwicklung eines in vitro Ansatzes zur Testung von Biofilm-Nachweismethoden und Antibiotikawirksamkeit}, doi = {10.25972/OPUS-25070}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-250703}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {Diese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung von aus Patientenisolaten gewonnenen S. aureus Kulturen und deren Biofilmbildung auf implantat{\"a}hnlichen Titan-Oberfl{\"a}chen. Ziel war es, den zeitlichen Ablauf bakterieller periprothetischer Infektionen {\"u}ber einen Zeitraum von 21 Tagen zu beschreiben und besser zu verstehen. Dazu sollte {\"u}berpr{\"u}ft werden, ob ein fluoreszenzspektrometrisch ausgewertetes LIVE/DEAD Assay eine zus{\"a}tzliche Aussage zum Status der im Biofilm befindlichen Zellen liefern kann. Zudem wurde die Biofilmentwicklung anhand etablierter fluoreszenzspektrometrischer Methoden (Concanavalin-A-Markierung extrazellul{\"a}rer Polymerer Substanzen, DNA-Markierung mit Hoechst 33342) untersucht. Es konnte ein reproduzierbarer Verlauf der Entwicklung des Biofilms, sowie der DNA-Menge aufgezeigt werden. Das LIVE/DEAD Assay lieferte keine signifikanten Ergebnisse in Bezug auf das Verh{\"a}ltnis lebender zu toter S. aureus Zellen im Biofilm. Weiter wurde die Angreifbarkeit des fr{\"u}hen, am Titan adh{\"a}renten Biofilms (Alter 1-5 Tage) durch das in der Orthop{\"a}die g{\"a}ngig eingesetzte Antibiotikum Gentamicin untersucht. Die Wirksamkeit konnte zu jedem getesteten Zeitpunkt der ersten f{\"u}nf Tage durch Anzucht von Kolonien best{\"a}tigt werden. Auch wurde die Wirksamkeit {\"u}ber das LIVE/DEAD Assay {\"u}berpr{\"u}ft, jedoch konnten hier keine aussagekr{\"a}ftigen Daten gewonnen werden, die diese Methode zur {\"U}berpr{\"u}fung der Antibiotikawirksamkeit empfehlen k{\"o}nnten.}, subject = {Biofilm}, language = {de} } @phdthesis{Wermser2019, author = {Wermser, Charlotte}, title = {Morphology, regulation and interstrain interactions in a new macrocolony biofilm model of the human pathogen \(Staphylococcus\) \(aureus\)}, doi = {10.25972/OPUS-16593}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-165931}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {The role of multicellularity as the predominant microbial lifestyle has been affirmed by studies on the genetic regulation of biofilms and the conditions driving their formation. Biofilms are of prime importance for the pathology of chronic infections of the opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus. The recent development of a macrocolony biofilm model in S. aureus opened new opportunities to study evolution and physiological specialization in biofilm communities in this organism. In the macrocolony biofilm model, bacteria form complex aggregates with a sophisticated spatial organization on the micro- and macroscale. The central positive and negative regulators of this organization in S. aureus are the alternative sigma factor σB and the quorum sensing system Agr, respectively. Nevertheless, nothing is known on additional factors controlling the macrocolony morphogenesis. In this work, the genome of S. aureus was screened for novel factors that are required for the development of the macrocolony architecture. A central role for basic metabolic pathways was demonstrated in this context as the macrocolony architecture was strongly altered by the disruption of nucleotide and carbohydrate synthesis. Environmental signals further modulate macrocolony morphogenesis as illustrated by the role of an oxygen-sensitive gene regulator, which is required for the formation of complex surface structures. A further application of the macrocolony biofilm model was demonstrated in the study of interstrain interactions. The integrity of macrocolony communities was macroscopically visibly disturbed by competitive interactions between clinical isolates of S. aureus. The results of this work contribute to the characterization of the macrocolony biofilm model and improve our understanding of developmental processes relevant in staphylococcal infections. The identification of anti-biofilm effects exercised through competitive interactions could lead to the design of novel antimicrobial strategies targeting multicellular bacterial communities.}, subject = {Staphylococcus aureus}, language = {en} } @phdthesis{Lerch2018, author = {Lerch, Maike Franziska}, title = {Characterisation of a novel non-coding RNA and its involvement in polysaccharide intercellular adhesin (PIA)-mediated biofilm formation of \(Staphylococcus\) \(epidermidis\)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-155777}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Coagulase-negative staphylococci, particularly Staphylococcus epidermidis, have been recognised as an important cause of health care-associated infections due to catheterisation, and livestock-associated infections. The colonisation of indwelling medical devices is achieved by the formation of biofilms, which are large cell-clusters surrounded by an extracellular matrix. This extracellular matrix consists mainly of PIA (polysaccharide intercellular adhesin), which is encoded by the icaADBC-operon. The importance of icaADBC in clinical strains provoking severe infections initiated numerous investigations of this operon and its regulation within the last two decades. The discovery of a long transcript being located next to icaADBC, downstream of the regulator gene icaR, led to the hypothesis of a possible involvement of this transcript in the regulation of biofilm formation (Eckart, 2006). Goal of this work was to characterise this transcript, named ncRNA IcaZ, in molecular detail and to uncover its functional role in S. epidermidis. The ~400 nt long IcaZ is specific for ica-positive S. epidermidis and is transcribed in early- and mid-exponential growth phase as primary transcript. The promotor sequence and the first nucleotides of icaZ overlap with the 3' UTR of the preceding icaR gene, whereas the terminator sequence is shared by tRNAThr-4, being located convergently to icaZ. Deletion of icaZ resulted in a macroscopic biofilm-negative phenotype with highly diminished PIA-biofilm. Biofilm composition was analysed in vitro by classical crystal violet assays and in vivo by confocal laser scanning microscopy under flow conditions to display biofilm formation in real-time. The mutant showed clear defects in initial adherence and decreased cell-cell adherence, and was therefore not able to form a proper biofilm under flow in contrast to the wildtype. Restoration of PIA upon providing icaZ complementation from plasmids revealed inconsistent results in the various mutant backgrounds. To uncover the functional role of IcaZ, transcriptomic and proteomic analysis was carried out, providing some hints on candidate targets, but the varying biofilm phenotypes of wildtype and icaZ mutants made it difficult to identify direct IcaZ mRNA targets. Pulse expression of icaZ was then used as direct fishing method and computational target predictions were executed with candidate mRNAs from aforesaid approaches. The combined data of these analyses suggested an involvement of icaR in IcaZ-mediated biofilm control. Therefore, RNA binding assays were established for IcaZ and icaR mRNA. A positive gel shift was maintained with icaR 3' UTR and with 5'/3' icaR mRNA fusion product, whereas no gel shift was obtained with icaA mRNA. From these assays, it was assumed that IcaZ regulates icaR mRNA expression in S. epidermidis. S. aureus instead lacks ncRNA IcaZ and its icaR mRNA was shown to undergo autoregulation under so far unknown circumstances by intra- or intermolecular binding of 5' UTR and 3' UTR (Ruiz de los Mozos et al., 2013). Here, the Shine-Dalgarno sequence is blocked through 5'/3' UTR base pairing and RNase III, an endoribonuclease, degrades icaR mRNA, leading to translational blockade. In this work, icaR mRNA autoregulation was therefore analysed experimentally in S. epidermidis and results showed that this specific autoregulation does not take place in this organism. An involvement of RNase III in the degradation process could not be verified here. GFP-reporter plasmids were generated to visualise the interaction, but have to be improved for further investigations. In conclusion, IcaZ was found to interact with icaR mRNA, thereby conceivably interfering with translation initiation of repressor IcaR, and thus to promote PIA synthesis and biofilm formation. In addition, the environmental factor ethanol was found to induce icaZ expression, while only weak or no effects were obtained with NaCl and glucose. Ethanol, actually is an ingredient of disinfectants in hospital settings and known as efficient effector for biofilm induction. As biofilm formation on medical devices is a critical factor hampering treatment of S. epidermidis infections in clinical care, the results of this thesis do not only contribute to better understanding of the complex network of biofilm regulation in staphylococci, but may also have practical relevance in the future.}, subject = {Biofilm}, language = {en} } @phdthesis{Balasubramanian2018, author = {Balasubramanian, Srikkanth}, title = {Novel anti-infectives against pathogenic bacteria}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-163882}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Marine sponge-associated actinomycetes are reservoirs of diverse natural products with novel biological activities. Their antibiotic potential has been well explored against a range of Gram positive and negative bacteria. However, not much is known about their anti-infective or anti-virulence potential against human pathogens. This Ph.D. project aimed to investigate the anti-infective (anti-Shiga toxin and anti-biofilm) potential of sponge-derived actinobacteria through identification and isolation of their bioactive metabolites produced and characterizing their mechanism of action by transcriptomics. This thesis is divided into three studies with the overall objective of exploring the anti-infective efficacy of actinomycetes-derived extracts and compound(s) that could possibly be used as future therapeutics. The first study deals with investigation on the anti-Shiga toxin effects of sponge-associated actinomycetes. Diarrheal infections pose a huge burden in several developing and developed countries. Diarrheal outbreaks caused by Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) could lead to life-threatening complications like gastroenteritis and haemolytic uremic syndrome (HUS) if left untreated. Shiga toxin (Stx) produced by EHEC is a major virulence factor that negatively affects the human cells, leading them to death via apoptosis. Antibiotics are not prescribed against EHEC infections since they may enhance the risk of development of HUS by inducing the production and release of Stx from disintegrating bacteria and thereby, worsening the complications. Therefore, an effective drug that blocks the Stx production without affecting the growth needs to be urgently developed. In this study, the inhibitory effects of 194 extracts and several compounds originating from a collection of marine sponge-derived actinomycetes were evaluated against the Stx production in EHEC strain EDL933 with the aid of Ridascreen® Verotoxin ELISA assay kit. It was found that treatment with the extracts did not lead to significant reduction in Stx production. However, strepthonium A isolated from the culture of Streptomyces sp. SBT345 (previously cultivated from the Mediterranean sponge Agelas oroides) reduced the Stx production (at 80 μM concentration) in EHEC strain EDL933 without affecting the bacterial growth. The structure of strepthonium A was resolved by spectroscopic analyses including 1D and 2D-NMR, as well as ESI-HRMS and ESI-HRMS2 experiments. This demonstrated the possible application of strepthonium A in restraining EHEC infections. VI In the second study, the effect of marine sponge-associated actinomycetes on biofilm formation of staphylococci was assessed. Medical devices such as contact lenses, metallic implants, catheters, pacemakers etc. are ideal ecological niches for formation of bacterial biofilms, which thereby lead to device-related infections. Bacteria in biofilms are multiple fold more tolerant to the host immune responses and conventional antibiotics, and hence are hard-to-treat. Here, the anti-biofilm potential of an organic extract derived from liquid fermentation of Streptomyces sp. SBT343 (previously cultivated from the Mediterranean sponge Petrosia ficiformis) was reported. Results obtained in vitro demonstrated its anti-biofilm (against staphylococci) and non-toxic nature (against mouse macrophage (J774.1), fibroblast (NIH/3T3) and human corneal epithelial cell lines). Interestingly, SBT343 extract could inhibit staphylococcal biofilm formation on polystyrene, glass and contact lens surfaces without affecting the bacterial growth. High Resolution Fourier Transform Mass Spectrometry (HR-MS) analysis indicated the complexity and the chemical diversity of components present in the extract. Preliminary physio-chemical characterization unmasked the heat stable and non-proteinaceous nature of the active component(s) in the extract. Finally, fractionation experiments revealed that the biological activity was due to synergistic effects of multiple components present in the extract. In the third study, anti-biofilm screening of 50 organic extracts generated from solid and liquid fermentation of 25 different previously characterized sponge-derived actinomycetes was carried out. This led to identification of the anti-biofilm organic extract derived from the solid culture of Streptomyces sp. SBT348 (previously cultivated from the Mediterranean sponge Petrosia ficiformis). Bioassay-guided fractionation was employed to identify the active fraction Fr 7 in the SBT348 crude extract. Further purification with semi-preparative HPLC led to isolation of the bioactive SKC1, SKC2, SKC3, SKC4 and SKC5 sub-fractions. The most active sub-fraction SKC3 was found to be a pure compound having BIC90 and MIC values of 3.95 μg/ml and 31.25 μg/ml against S. epidermidis RP62A. SKC3 had no apparent toxicity in vitro on cell lines and in vivo on the greater wax moth Galleria melonella larvae. SKC3 was stable to heat and enzymatic treatments indicating its non-proteinaceous nature. HR-MS analysis revealed the mass of SKC3 to be 1258.3 Da. Structure elucidation of SKC3 with the aid of 1D and 2D-NMR data is currently under investigation. Further, to obtain insights into the mode of action of SKC3 on S. epidermidis RP62A, RNA sequencing was done. Transcriptome data revealed that SKC3 was recognized by RP62A at 20 min and SKC3 negatively interfered with the central metabolism of staphylococci at 3 h. Taken VII together, these findings suggest that SKC3 could be a lead structure for development of new anti-staphylococcal drugs. Overall, the results obtained from this work underscore the anti-infective attributes of actinomycetes consortia associated with marine sponges, and their applications in natural product drug discovery programs.}, subject = {Marine sponges}, language = {en} } @phdthesis{GarciaBetancur2018, author = {Garcia Betancur, Juan Carlos}, title = {Divergence of cell-fates in multicellular aggregates of \(Staphylococcus\) \(aureus\) defines acute and chronic infection cell types}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-148059}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Staphylococcus aureus is a versatile human pathogen that normally develops acute or chronic infections. The broad range of diseases caused by this bacterium facilitates the escape from the host's immune response as well as from target-specific antimicrobial therapies. Nevertheless, the underlying cellular and molecular mechanisms that enable S. aureus to cause these disparate types of infections are largely unknown. In this work, we depicted a novel genetic program involved in the development of cell-fate decision, which promotes the differentiation of the staphylococcal cells into two genetically identical but differently heritable cell lines capable of defining the course of an infection, by simultaneously progressing to (i) a biofilm-associated chronic infection or (ii) a disperse acute bacteremia. Here, S. aureus growing in architecturally complex multicellular communities harbored different cell types that followed an exclusive developmental plan, resulting in a clonal heterogeneous population. We found that these cell types are physiologically specialized and that, this specialization impacts the collective behavior within the multicellular aggregates. Whereas one cell line that we named BRcells, promotes biofilm formation that engenders chronic infections, the second cell line, which we termed DRcells is planktonic and synthetizes virulence factors, such as toxins that can drive acute bacteremia. We identified that the positive feedback loop present in Agr quorum sensing system of S. aureus acts a bimodal switch able to antagonistically control the divergence of these two physiologically distinct, heritable cell lines. Also, we found that this bimodal switch was triggered in response to environmental signals particularly extracellular Mg2+, affecting the size of the subpopulations in specific colonization environments. Specifically, Mg2+-enriched environments enhanced the binding of this cation to the staphylococcal teichoic acids, increasing the rigidity of the cell wall and triggering a genetic program involving the alternative sigma factor σB that downregulated the Agr bimodal switch, favoring the enrichment of the BRcells type. Therefore, colonization environments with different Mg2+ content favored different outcomes in the bimodal system, defining distinct ratio in the BRcells/DRcells subpopulations and the S. aureus outcome in our in vitro model of development of multicellular aggregates and, the infection outcome in an in vivo mice infection model. In this prime human pathogen cell-fate decision-making generates a conserved pattern of heritable, physiological heterogeneity that actively contributes to determine the course of an infection through the emergence and spatio-temporal dynamics of distinct and specialized cell types. In conclusion, this work demonstrates that cell differentiation in pathogenic bacteria is a fundamental phenomenon and its understanding, is central to understand nosocomial infections and to designing new anti-infective strategies}, subject = {Staphylococcus aureus}, language = {en} } @phdthesis{Richwien2013, author = {Richwien, Daniela Maria}, title = {Retrospektive Analyse zur Bewertung der Vena femoralis als Bypassmaterial beim tiefen Protheseninfekt}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-93318}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Einleitung: Die Protheseninfektion ist in der Gef{\"a}ßchirurgie eine seltene, aber gef{\"u}rchtete Komplikation, da sie bis dato immer noch mit einer hohen Mortalit{\"a}t und Morbidit{\"a}t einhergeht. Protheseninfektionen werden in verschiedenen Klassifikationen dargestellt. Die Pathophysiologie des Infektes verl{\"a}uft {\"u}ber die Aktivierung des Immunsystems und die F{\"a}higkeit der Erreger, sich vor den Angriffen des Immunsystems zu sch{\"u}tzen. Dabei ist der h{\"a}ufigste Kontaminationsweg die lokale Kontamination im OP-Gebiet. Der h{\"a}ufigste Erreger stellt der Biofilm bildende Staphylococcus aureus dar. Nach pr{\"a}operativer Diagnostik erfolgt die vollst{\"a}ndige Explantation der infizierten Gef{\"a}ßprothese mit lokalem radikalem Debridement des Entz{\"u}ndungsgewebes und Wiederherstellung der Perfusion. F{\"u}r diesen Gef{\"a}ßersatz stehen verschiedene Materialien zur Verf{\"u}gung. Material und Methoden: Ziel dieser Arbeit ist es, retrospektiv die Therapie der tiefen Protheseninfektion mittels autologer In-Situ-Rekonstruktion durch die V. femoralis superficialis im Zeitraum von September 2003 bis Juni 2010 an der Universit{\"a}tsklinik in W{\"u}rzburg zu analysieren. Es wurden insgesamt 24 Patienten behandelt. Es erfolgte eine detaillierte Aufarbeitung der Krankengeschichte, der mikrobiologischen Befunde, sowie der Operationsberichte und Folgeeingriffe. Des Weiteren wurde eine Kontrolluntersuchung im Rahmen der gef{\"a}ßchirurgischen Sprechstunde durchgef{\"u}hrt. Ergebnisse: 20 M{\"a}nner und vier Frauen wurden aufgrund einer Protheseninfektion (6x Fr{\"u}hinfekt, 14x Sp{\"a}tinfekt, 2x persistierender Infekt) operiert, nachdem ihnen eine aortoiliacale, aortofemorale oder iliacofemorale Kunststoffprothese zur Behandlung einer pAVK, eines Aneurysmas, oder aufgrund beider Entit{\"a}ten implantiert worden war. Am h{\"a}ufigsten zeigte sich als klinisches Erstsymptom eine inguinale Wundheilungsst{\"o}rung. Lymphfisteln und Infektblutungen belegten Platz zwei und drei. Jedes Mal wurde die V. femoralis superficialis (11x beidseits, 13x einseitig) entnommen, in acht F{\"a}llen kombiniert mit der V. saphena magna. 23x erfolgte die Rekonstruktion der Perfusion in-situ, lediglich einmal als extraanatomischer Obturator-Bypass. Bei 19 Patienten (79,2\%) konnte ein Pathogen nachgewiesen werden, bei f{\"u}nf Patienten (20,8\%) nicht. In 54,2\% der F{\"a}lle lag eine Monoinfektion vor, bei 12,5\% eine Mischinfektionen. Der h{\"a}ufigste Erreger mit 25\% Anteil war Staphylococcus aureus, zweimal gelang der Nachweis eines MRSA. Insgesamt kam es bei sieben Patienten zum Nachweis eines gram-positiven Pathogens, bei sechs Patienten eines gram-negativen Pathogens, was der allgemeinen Entwicklung entspricht. Bei elf Patienten (45,8\%) kam es zu einer postoperativen inguinalen Wundheilungsst{\"o}rung. Deshalb erfolgten auch die meisten Folgeeingriffe mit chirurgischer Wundtoilette, Vakuum-Okklusiv-Verband, Sekund{\"a}rnaht oder Meshgraft-Deckung als definitiven Wundverschluss. F{\"u}nf Patienten (20,8\%) erlitten eine periphere Isch{\"a}mie bzw. einen Bypass-Verschluss. Davon wurden zwei Patienten auf H{\"o}he des Oberschenkels amputiert. Ein Viertel der Patienten verstarb noch w{\"a}hrend des station{\"a}ren Aufenthaltes. Das Gesamt{\"u}berleben am untersuchten Patientengut betrug bei Durchf{\"u}hrung dieser Doktorarbeit die Zahl zehn. Sieben Patienten stellten sich zur Kontrolluntersuchung vor, dreien war dies nur schriftlich m{\"o}glich. Zweimal erfolgte poststation{\"a}r eine Isch{\"a}mie-bedingte Majoramputation. Alle Patienten waren infektfrei. Ein Patient erhielt eine PTA bei Stenose der A. femoralis superficialis rechts nach autologem aortobifemoralem Ersatz. Nach Venenentnahme besteht jedoch bei f{\"u}nf von sieben Patienten ein mildes bis mittelschweres Phleb{\"o}dem (1-2cm Umfangszunahme am Kn{\"o}chel) nach Porter. Zwei Patienten erhalten bis dato eine Lymphdrainage. Zusammenfassung: Die Protheseninfektion ist eine technische Herausforderung, insbesondere wenn die Aorta mitbetroffen ist. Die V. femoralis superficialis erscheint aktuell die erste Wahl bei Notwendigkeit eines großlumigen Gef{\"a}ßersatzes zu sein. Sie garantiert bis dato eine Infektfreiheit und eine nahezu hundertprozentige Offenheitsrate. Jedoch ist eine pr{\"a}operative Patientenselektion aufgrund der generell hohen Mortalit{\"a}t und Morbidit{\"a}t durchzuf{\"u}hren und es sind alle Alternativen zu pr{\"u}fen, um im Individualfall die bestm{\"o}gliche L{\"o}sung f{\"u}r Patient und behandelnden Arzt zu finden. Denn zur Behandlung einer Protheseninfektion gibt es zurzeit noch keinen Goldstandard. Ob es bei dieser komplexen Art der Erkrankung jedoch jemals EINEN Goldstandard geben wird, ist zu bezweifeln. Weitere Diskussionen und Entwicklungen werden und m{\"u}ssen folgen.}, subject = {Gef{\"a}ßprothese}, language = {de} } @phdthesis{Audretsch2013, author = {Audretsch, Christof}, title = {Analysing Quorum Sensing and Biofilm formation in Staphylococcus aureus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-92189}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Staphylococcus aureus (SA) causes nosocomial infections including life threatening sepsis by multi-resistant strains (MRSA). It has the ability to form biofilms to protect it from the host immune system and from anti staphylococcal drugs. Biofilm and planctonic life style is regulated by a complex Quorum-Sensing (QS) system with agr as a central regulator. To study biofilm formation and QS mechanisms in SA a Boolean network was build (94 nodes, 184 edges) including two different component systems such as agr, sae and arl. Important proteins such as Sar, Rot and SigB were included as further nodes in the model. System analysis showed there are only two stable states biofilm forming versus planctonic with clearly different subnetworks turned on. Validation according to gene expression data confirmed this. Network consistency was tested first according to previous knowledge and literature. Furthermore, the predicted node activity of different in silico knock-out strains agreed well with corresponding micro array experiments and data sets. Additional validation included the expression of further nodes (Northern blots) and biofilm production compared in different knock-out strains in biofilm adherence assays. The model faithfully reproduces the behaviour of QS signalling mutants. The integrated model allows also prediction of various other network mutations and is supported by experimental data from different strains. Furthermore, the well connected hub proteins elucidate how integration of different inputs is achieved by the QS network. For in silico as well as in vitro experiments it was found that the sae-locus is also a central modulator of biofilm production. Sae knock-out strains showed stronger biofilms. Wild type phenotype was rescued by sae complementation. To elucidate the way in which sae takes influence on biofilm formation the network was used and Venn-diagrams were made, revealing nodes regulated by sae and changed in biofilms. In these Venn-diagrams nucleases and extracellular proteins were found to be promising nodes. The network revealed DNAse to be of great importance. Therefore qualitatively the DNAse amount, produced by different SA mutants was measured, it was tried to dissolve biofilms with according amounts of DNAse and the concentration of nucleic acids, proteins and polysaccharides were measured in biofilms of different SA mutants. With its thorough validation the network model provides a powerful tool to study QS and biofilm formation in SA, including successful predictions for different knock-out mutant behaviour, QS signalling and biofilm formation. This includes implications for the behaviour of MRSA strains and mutants. Key regulatory mutation combinations (agr-, sae-, sae-/agr-, sigB+, sigB+/sae-) were directly tested in the model but also in experiments. High connectivity was a good guide to identify master regulators, whose detailed behaviour was studied both in vitro and in the model. Together, both lines of evidence support in particular a refined regulatory role for sae and agr with involvement in biofilm repression and/or SA dissemination. With examination of the composition of different mutant biofilms as well as with the examination of the reaction cascade that connects sae to the biofilm forming ability of SA and also by postulating that nucleases might play an important role in that, first steps were taken in proving and explaining regulatory links leading from sae to biofilms. Furthermore differences in biofilms of different mutant SA strains were found leading us in perspective towards a new understanding of biofilms including knowledge how to better regulate, fight and use its different properties.}, subject = {Staphylococcus aureus}, language = {en} } @phdthesis{vanAlen2010, author = {van Alen, Tessa}, title = {Vergleichende Proteomanalyse von Biofilmen und planktonischen Zellen bei dem humanen Infektionserreger Neisseria meningitidis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52463}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Tr{\"a}gertum im Nasenrachenraum ist entscheidend f{\"u}r die {\"U}bertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Fr{\"u}here Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilm{\"a}hnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell f{\"u}r das Tr{\"a}gertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, w{\"a}hrend bisher keine Proteomanalysen durchgef{\"u}hrt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschl{\"a}uchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse {\"u}ber 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse {\"u}ber 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit {\"u}berwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verst{\"a}rkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn m{\"o}glich, mit spezifischen Antik{\"o}rpern abgesichert. Die Expression von ungef{\"a}hr 2 \% aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Ver{\"a}nderungen beobachtet, die mit einem N{\"a}hrstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden k{\"o}nnen. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erh{\"o}ht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell f{\"u}r Biofilmwachstum, nicht aber f{\"u}r planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator f{\"u}r metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte {\"u}ber die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adh{\"a}sine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden.}, subject = {Biofilm}, language = {de} } @phdthesis{Bauchart2010, author = {Bauchart, Philippe Michel Paul}, title = {Evaluation of the Zoonotic Risk of Escherichia coli Strains involved in Extraintestinal Infections of Humans and Animals. Characterization of New Virulences Factors in ExPEC}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48848}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC.}, subject = {Escherichia coli}, language = {en} } @phdthesis{Mordhorst2009, author = {Mordhorst, Ines Louise}, title = {Phylogenetische und funktionelle Analysen zur Kapsel O-Acetyltransferase NeuO von Escherichia coli K1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47880}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-St{\"a}mme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier avi{\"a}re Coliseptik{\"a}mien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus \&\#945;-2,8-verkn{\"u}pften Sialins{\"a}uremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem f{\"u}r die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung f{\"u}r das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteri{\"a}mie) und aus an Coliseptik{\"a}mie erkrankten V{\"o}geln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie f{\"u}nf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand h{\"a}ufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 St{\"a}mme (44\%) angeh{\"o}rten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-St{\"a}mme waren neuO-positiv (56\%). Das Gen wurde in 78 (98\%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24\%) der 103 nicht-STC95-St{\"a}mme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. {\"U}ber Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und avi{\"a}re E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser St{\"a}mme unterst{\"u}tzt. In den in dieser Arbeit durchgef{\"u}hrten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die F{\"a}higkeit der Bakterien an humane mikrovaskul{\"a}re Gehirnendothelzellen zu adh{\"a}rieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im H{\"u}hnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des H{\"u}hner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erh{\"o}hte. M{\"o}glicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen.}, subject = {Escherichia coli}, language = {de} } @phdthesis{Reidl2009, author = {Reidl, Sebastian}, title = {Funktionale Charakterisierung an der Biofilmbildung beteiligter Faktoren pathogener und kommensaler Escherichia coli}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35684}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Multizellul{\"a}re Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. H{\"a}ufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizellul{\"a}re Lebensweise von humanpathogenen Erregern zur{\"u}ckf{\"u}hren. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-St{\"a}mme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazellul{\"a}re polymere Substanzen, Adh{\"a}sine oder Oberfl{\"a}chen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft tr{\"a}gt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder {\"a}hnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit n{\"a}her untersucht worden. Hierf{\"u}r wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adh{\"a}sin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 \&\#916;fim\&\#916;flu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypst{\"a}mmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zus{\"a}tzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah ('Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase') durchgef{\"u}hrt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladh{\"a}sionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I ('Adhesin Involved in Diffuse Adherence') enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte f{\"u}r Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adh{\"a}sin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalit{\"a}t des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante f{\"u}hrte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinit{\"a}ten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazit{\"a}t des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Dom{\"a}nen anderer Autotransporter auf. F{\"u}r viele dieser Proteine konnte bereits eine adh{\"a}sive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine m{\"o}gliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollst{\"a}ndig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde f{\"u}r Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellul{\"a}ren Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erh{\"o}hter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint f{\"u}r die Funktionalit{\"a}t von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen erm{\"o}glicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur f{\"u}r die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abh{\"a}ngigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen.}, subject = {Escherichia coli}, language = {de} } @phdthesis{Hutter2008, author = {Hutter, Gerhard J.}, title = {Kulturunabh{\"a}ngige 16S rRNA Analyse des subgingivalen bakteriellen Biofilms bei der aggressiven Parodontitis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28944}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Kulturunabh{\"a}ngige 16S rRNA Analyse des subgingivalen bakteriellen Biofilms bei der aggressiven Parodontitis und Vergleich mit bekannten Bakterien bzw. Phylotypen, die im Zusammenhang mit der parodontalen Flora nachgewiesen wurde. Putative Pathogene wurden bestimmt.}, subject = {Bakterien}, language = {de} } @phdthesis{Lappann2007, author = {Lappann, Martin}, title = {Morphologische und funktionelle Untersuchungen zur Biofilmbildung bei dem humanen Pathogen Neisseria meningitidis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23546}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {1. Zusammenfassung Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger invasiver Infektionen bei Kindern und Heranwachsenden. Der in vielen L{\"a}ndern niedrigen Inzidenz stehen hohe Raten asymptomatischer Kolonisation des menschlichen Nasopharynx mit Meningokokken gegen{\"u}ber. W{\"a}hrend die Pathogenese durch Meningokokken ausf{\"u}hrlich untersucht ist, wurde dem Tr{\"a}gertum von Meningokokken bisher wenig Aufmerksamkeit geschenkt, nicht zuletzt auch wegen des Fehlens eines geeigneten Tiermodells. K{\"u}rzlich publizierte Daten lassen die asymptomatische Persistenz von Meningokokken in einem Biofilm-{\"a}hnlichen Stadium auf und innerhalb des Tonsillengewebes vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung eines Biofilmmodells f{\"u}r Meningokokken als ein Modell f{\"u}r asymptomatisches Tr{\"a}gertum. Es wurde zudem die Biofilmbildung von Meningokokken unterschiedlichster klonaler Linien mit dem Ziel untersucht, auf molekularer Ebene die Biofilmbildung bei Meningokokken zu verstehen. In statischen Biofilmtests konnte gezeigt werden, dass Biofilmbildung eine ubiquit{\"a}re Eigenschaft von Meningokokken ist, solange diese keine Kapsel exprimieren. Hierbei war es unerheblich, ob Tr{\"a}gerisolate oder Isolate aus invasiven Meningokokkenerkrankungen untersucht wurden. Durch die Konstruktion fluoreszierender Meningokokkenst{\"a}mme und die Etablierung eines Minimalmediums konnte f{\"u}r Meningokokken ein standardisiertes Biofilmmodell unter Flussbedingungen erstellt werden. Das Flussmodell f{\"u}r Meningokokkenbiofilme erwies sich als {\"a}ußerst robust und reproduzierbar. Es wurde deutlich, dass Meningokokken Biofilme unterschiedlicher Struktur ausbildeten, die teilweise {\"u}ber 120 Stunden in vitalem Zustand gehalten werden konnten. Die Mehrzahl der St{\"a}mme bildete heterogene Biofilme mit distinkten Mikrokolonien aus, w{\"a}hrend andere St{\"a}mme homogene Biofilme ohne Mikrokolonien ausbildeten. Diese strukturellen Unterschiede hatten keinen Effekt auf die Antibiotika-Empfindlichkeit der Biofilme. Es konnte gezeigt werden, dass Meningokokkenbiofilme durch Ciprofloxacin und Rifampicin, nicht aber durch Penicillin im Wachstumsmedium abget{\"o}tet werden konnten. Diese Ergebnisse passen zu in vivo-Befunden, die zeigen, dass Ciprofloxacin und Rifampicin im Gegensatz zu Penicillin sehr zuverl{\"a}ssig das Tr{\"a}gertum von Meningokokken eradizieren k{\"o}nnen. Durch die Untersuchung der Biofilmbildung von PilX- und PilE-Mutanten konnte die Bedeutung der Twitching Motility f{\"u}r die Mikrokoloniebildung im Meningokokkenbiofilm aufgezeigt werden. Ausgepr{\"a}gte Motilit{\"a}t f{\"u}hrte zu Mikrokoloniebildung, w{\"a}hrend weitgehend unbewegliche St{\"a}mme flache unstrukturierte Biofilme bildeten. In der vorliegenden Arbeit konnte der Verlust der Mikrokoloniebildung bei der PilX-Mutante durch Reduktion der Piliierung, die zu verminderter Motilit{\"a}t f{\"u}hrte, erkl{\"a}rt werden. Autoaggregation der Zellen spielte f{\"u}r die Mikrokoloniebildung keine Rolle, was im Widerspruch zur k{\"u}rzlich publizierten Rolle von PilX steht. Initiale Schritte der Biofilmbildung bei Meningokokken k{\"o}nnten von extrazellul{\"a}rer DNA (exDNA) abh{\"a}ngen, da die Zugabe von DNase zur Vorkultur die Biofilmbildung verhinderte, jedoch bestehende reife Biofilme nicht aufl{\"o}ste. Die Funktion, der Mechanismus der Freisetzung, sowie die Menge und Verteilung dieser exDNA in Meningokokkenbiofilmen wird Gegenstand zuk{\"u}nftiger Untersuchungen sein.}, language = {de} } @phdthesis{Homburg2007, author = {Homburg, Stefan}, title = {Untersuchungen zur Molekularbiologie von Escherichia coli-Wildst{\"a}mmen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22884}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-St{\"a}mmen zu treffen, f{\"a}llt h{\"a}ufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen St{\"a}mmen gefunden werden k{\"o}nnen. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren" auf. Dazu geh{\"o}ren verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten l{\"a}sst daher R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen {\"o}kologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizellul{\"a}re Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Ph{\"a}notyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsf{\"a}higkeit gegen{\"u}ber anderen kommensalen E. coli erh{\"o}ht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabh{\"a}ngig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen m{\"o}glichen {\"u}bergeordneten Regulator dieses Ph{\"a}notyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht daf{\"u}r bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. W{\"a}hrend die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberfl{\"a}chenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colans{\"a}ure, LPS) einen ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten F{\"a}llen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abh{\"a}ngig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine f{\"u}r die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die St{\"a}mme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel f{\"u}hrte zur Aufhebung des zytopathischen Ph{\"a}notyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abget{\"o}tete Bakterien oder Kultur{\"u}berst{\"a}nde zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Dom{\"a}nen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher St{\"a}rke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erh{\"o}hte Transkription oder Promotoraktivit{\"a}t einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabh{\"a}ngigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabh{\"a}ngigkeit konnte durch die Induktion bzw. {\"U}berexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schl{\"u}sselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem m{\"o}glichen Regulator clbR nicht {\"u}berwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivit{\"a}t einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zur{\"u}ckgef{\"u}hrt, welches {\"u}ber CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die nat{\"u}rliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis f{\"u}r einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und k{\"o}nnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen.}, subject = {Escherichia coli}, language = {de} } @phdthesis{Elias2007, author = {Elias, Roman}, title = {Mikrobiologische Untersuchungen zum Vergleich verschiedener Materialien f{\"u}r Mittelohrimplantate}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22560}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {An Mittelohrimplantate werden hohe Anspr{\"u}che im Bezug auf die Bio- und Formstabilit{\"a}t, intraoperative Handhabung und Schallleitungseigenschaften gestellt. Die Besonderheit bei Mittelohrimplantaten stellt jedoch die potentielle bakterielle Besiedlung des Implantationsgebiets dar. Das Mittelohr hat durch die Tuba auditiva eine Verbindung mit den oberen Atemwegen. Dadurch kann es zum Beispiel durch eine aufsteigende Infektion der Atemwege zu einer bakteriellen Besiedlung der Mittelohrimplantate kommen. Ziel dieser Arbeit war es die Besiedlung von Polystyrol, Gold, Silber, Stahl und Titan durch die Bakterienst{\"a}mme Escherichia coli, Staphylokokkus epidermidis, Streptokokkus pneumoniae zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden jeweils vier Pl{\"a}ttchen eines Testmaterials mit einer Bakterienmonokultur besiedelt. Es wurden zwei Methoden ausgew{\"a}hlt um die Besiedlung der Versuchskeime auf den Testmaterialien zu bestimmen. Zum einem wurden die an den Pl{\"a}ttchen adh{\"a}rierenden Keime abgel{\"o}st und nach einer Verd{\"u}nnungsreihe auf N{\"a}hrb{\"o}den ausgebracht. Nach der Bebr{\"u}tung wurden die entstandenen Kolonien (CFU) ausgez{\"a}hlt. Bei der zweiten Methode wurden die adh{\"a}rierenden Keime auf den Pr{\"u}fk{\"o}rpern belassen und mit einem fluoreszierenden DNA-Farbstoff angef{\"a}rbt. Mit einem Photometer wurde die Besiedlung der Bakterien auf den Materialien statistisch bestimmt. Polystyrol und Silber dienten als Referenzmaterialien. Bei der Auswertung mittels Photometer musste aufgrund der Eigenfluoreszenz auf die Verwendung von Polystyrol verzichtet werden. Die Ergebnisse beider Methoden ergaben f{\"u}r alle Keime das h{\"o}chste Adh{\"a}sionsverhalten auf Titan. Stahl wurde von den Versuchskeimen ebenfalls gut besiedelt. Auf der Goldoberfl{\"a}che wurde die geringste Adh{\"a}sion der Keime festgestellt. Eine deutliche bakterizide oder bakteriostatische Wirkung von Stahl und Titan konnte bei keinem der verwendeten Bakterienst{\"a}mme festgestellt werden. Gold hingegen konnte deutlich das Bakterienwachstum hemmen.}, language = {de} } @phdthesis{Batzilla2007, author = {Batzilla, Christoph Friedemann}, title = {Untersuchungen zur Biofilmbildung und zum Quroum-sensing in Staphylococcus epidermidis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22278}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Das Gram-positive, Koagulase-negative Bakterium Staphylococcus epidermidis war viele Jahrzehnte als harmloser Kommensale der menschlichen Haut und der Schleimh{\"a}ute bekannt. Jedoch hat sich S. epidermidis in den letzten zwanzig Jahren zu einem Haupterreger von Nosokomialinfektionen entwickelt. Dabei unterscheidet sich S. epidermidis im Vergleich zu anderen Erregern durch ein sehr begrenztes Spektrum an Pathogenit{\"a}tsfaktoren, aber auch durch seine F{\"a}higkeit, Biofilme auf k{\"u}nstlichen Oberfl{\"a}chen wie Kathetern und Implantaten formen zu k{\"o}nnen. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit zwei Hauptaspekten, die in der Pathogenit{\"a}t von S. epidermidis eine wichtige Rolle spielen: (i) dem Quorum-sensing System Agr (accessory gene regulator) und (ii) dem zeitlichen Prozess des Aufbaus, sowie der Regulation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Das Quorum-sensing System Agr ist Teil eines komplexen regulatorischen Netzwerks. In der vorliegenden Arbeit wird durch Proteom- und Transkriptomanalysen gezeigt, dass das Agr-System in S._epidermidis den Hauptregulator f{\"u}r die Sekretion von extrazellul{\"a}ren Proteinen darstellt und dar{\"u}ber hinaus einen großen Einfluss auf die Regulation des Zentralmetabolismus und der Biosynthese von Aminos{\"a}uren hat. Mittels Mikroarray-Analyse konnte eine wichtige Verkn{\"u}pfung des Agr-Systems mit dem pleiotrophen Repressor CodY identifiziert werden, der viele station{\"a}re-Phase Gene im S._epidermidis Wildtyp reprimiert, jedoch nicht in der getesteten agr Mutante. Dieses f{\"u}hrt zu einem stark ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyp der S. epidermidis agr Mutante, in Hinblick auf Wachstumskapazit{\"a}t, der Biofilmbildung, der Invasivit{\"a}t und dem Langzeit{\"u}berleben. Interessanterweise ergaben wissenschaftliche Studien, dass ca. 17 \% der klinischen Isolate nat{\"u}rlich vorkommende agr Mutanten sind. Dieses k{\"o}nnte ein Hinweis darauf sein, dass S. epidermidis agr Mutanten aufgrund ihres stark ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyps und ihrer ver{\"a}nderten biochemischen Bed{\"u}rfnisse und Kapazit{\"a}t in der Lage sind, andere {\"o}kologische Nischen im menschlichen Wirt zu besiedeln. Der zweite Teil dieser Arbeit hat die Biofilmbildung von S. epidermidis zum Thema. Durch die Etablierung eines standardisierten Modells der Biofilmbildung, war es m{\"o}glich, {\"u}ber die Einf{\"u}hrung einer Biofilm-Adh{\"a}sion-Ratio die Biofilmbildung als zeitlichen dynamischen Prozess darzustellen und verschiedenste Bedingungen und St{\"a}mme miteinander zu vergleichen. Dabei zeigte sich, dass die Biofilmbildung in S._epidermidis ein klar zeitlich strukturierter Prozess ist, der von Umweltfaktoren und der N{\"a}hrstoffsituation abh{\"a}ngig ist, und dass verschiedene St{\"a}mme sehr unterschiedlich auf Ver{\"a}nderungen in ihrer Umwelt reagieren. Die zeitliche Analyse der Biofilmbildung mittels konfokaler Lasermikroskopie ergab, dass viele der Bakterien im Biofilm sterben. Dieses macht den Biofilm wesentlich anf{\"a}lliger f{\"u}r Str{\"o}mungsscherkr{\"a}fte, die dann ganze Bakterienverb{\"a}nde abl{\"o}sen und zu neuen Infektionsherden schwemmen k{\"o}nnten. Somit erm{\"o}glicht der Tod einer einzelnen Zelle unter Umst{\"a}nden ein besseres klonales {\"U}berleben. Die Mikroarray-Analysen der Genexpression im Biofilm zeigten, dass dieser einen physiologisch klar definierten Prozess durchl{\"a}uft, der zu einer sehr stark verminderten metabolischen Aktivit{\"a}t und einer erh{\"o}hten Antibiotika-Resistenz f{\"u}hrt. Dar{\"u}ber hinaus zeigen Bakterien im Biofilm einen weniger aggressiven Charakter, wie die Expression von Proteasen oder anderer Pathogenit{\"a}tsfaktoren, welches S. epidermidis dabei hilft, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Diese neuen Ergebnisse zur Regulation der Genexpression im Biofilm und zur Rolle des Quorum-sensing Systems Agr in S. epidermidis tragen wesentlich zum Verst{\"a}ndnis der Pathogenit{\"a}t und der Physiologie dieses wichtigen nosokomialen Erregers bei. Sie bilden eine wichtige theroretische Grundlage f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Studien, mit dem Ziel in Zukunft neue Therapie- und Pr{\"a}ventionsans{\"a}tze gegen S. epidermidis-Infektionen zu entwickeln.}, subject = {Staphylococcus epidermidis}, language = {de} } @phdthesis{Eckart2006, author = {Eckart, Martin}, title = {Analyse einer chromosomalen Deletion und Entdeckung einer neuartigen nicht-translatierten RNA in Staphylococcus epidermidis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21448}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Staphylococcus epidermidis ist ein wichtiger Bestandteil der gesunden Hautflora des Menschen, gleichzeitig aber auch der h{\"a}ufigste Erreger nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Die Forschungsarbeiten haben sich in den vergangenen Jahren besonders auf Faktoren und Mechanismen konzentriert, welche zur Etablierung der Spezies als Pathogen beigetragen haben. Eine typische Eigenschaft klinischer Isolate ist die F{\"a}higkeit, auf k{\"u}nstlichen Oberfl{\"a}chen Biofilme zu bilden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der IS-vermittelten Genomflexibilit{\"a}t und der Vergleich der Genomstruktur nosokomialer und kommensaler Isolate von S. epidermidis. Dazu wurde eine 260 kb große spontane Deletion im Chromosom des Biofilm-bildenden Stammes S. epidermidis 307 sequenziert und annotiert, von der bekannt war, dass sie durch eine homologe Rekombination zweier IS256-Kopien ausgel{\"o}st wurde. Auf dem deletierten Fragment fanden sich neben dem ica-Operon zahlreiche potentielle Virulenz-assoziierte Gene. Das {\"u}berraschende Ergebnis dieser Analyse war jedoch die Identifizierung eines neuartigen SCC-Elementes, das den rechten Rand der Deletion begrenzt. Dies ist die erste Beschreibung eines SSC-Elementes mit einer CcrC-Rekombinase, dem das Methicillin-Resistenzgen mecA fehlt. In der N{\"a}he des Rekombinasegens fand sich S.-haemolyticus-spezifische DNA. Weitere Untersuchungen zeigten, dass das SCC-Element durch die IS256/Tn4001 -vermittelte Deletion in der Mutante verk{\"u}rzt wurde. Genomvergleiche ica-positiver und ica-negativer St{\"a}mme von S. epidermidis mittels Microarrays, sowie in-silico-Analysen zweier vollst{\"a}ndiger S.-epidermidis-Genome ergaben, dass sich kommensale und pathogene St{\"a}mme in nur wenigen Faktoren unterscheiden. Diese befinden sich jedoch fast alle in einer Region um den oriC, in dessen N{\"a}he auch die Insertionsstelle f{\"u}r die SCCmec-Inseln lokalisiert ist. Das deletierte DNA-Fragment von S. epidermidis 307 konnte ebenfalls dieser Region zugeordnet werden, die offenbar eine Zone hoher genomischer Flexibilit{\"a}t darstellt, in der fremde DNA integriert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das ica-Operon diesen variablen Genomabschnitt begrenzt. Die exakte Grenze zwischen ica-positiven und ica-negativen St{\"a}mmen bildet eine Thr-tRNA, die in einer 1,4 kb großen intergenischen Region stromabw{\"a}rts des icaR-Regulatorgens lokalisiert ist. In unmittelbarer Nachbarschaft konnte ein Transkript nachgewiesen werden, welches nur in ica-positiven S. epidermidis vorkommt. Gest{\"u}tzt auf bioinformatische Analysen wurden zun{\"a}chst die Polarit{\"a}t und L{\"a}nge des Transkriptes, sowie der korrespondierende Promotor experimentell bestimmt. Demnach handelt es sich um eine 487 nt lange RNA, die entgegengesetzt zur Thr-tRNA orientiert ist und mit dieser teilweise {\"u}berlappt. Da die Nukelotid-Sequenz weder eine Ribosomen- Bindungsstelle noch einen gr{\"o}ßeren Leserahmen aufweist, ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich um eine nicht-translatierte RNA handelt. Qualitative RT-PCR-Experimente zeigten, dass die IGRica-RNA kostitutiv exprimiert wird. Spontane IS256 -Insertionsmutanten in der Promotorregion der IGRica-RNA wiesen ph{\"a}notypisch eine deutlich verminderte Biofilmbildung auf. Daher ist zu vermuten, dass die IGRica-RNA in die Regulation dieses wichtigen Virulenzfaktors involviert ist. In der vorliegenden Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass S. epidermidis das in vielen Spezies konservierte Hfq-Protein exprimiert, welches ein Bindungspartner und Chaperon f{\"u}r zahlreiche regulatorische RNAs darstellt. gel-shift-Experimente mit rekombinantem Hfq-Protein aus S. epidermidis ergaben jedoch keine nachweisbare Wechselwirkung der IGRica-RNA mit diesem Faktor in vitro. Insgesamt hat die Studie gezeigt, dass S. epidermidis eine Spezies mit einer außerordentlich hohen Genomflexibilit{\"a}t ist, die sich haupts{\"a}chlich in einer bestimmten Genomregion abspielt und f{\"u}r die IS-Elemente von besonderer Bedeutung sind. Die Identifizierung von DNA aus anderen Staphylokokken-Arten in dieser Region zeigt, dass S. epidermidis zu horizontalem Gentransfer {\"u}ber Speziesgrenzen hinweg in der Lage ist. Dies, sowie die Daten zur neuen SCC-Kassette, unterstreichen die Bedeutung von S. epidermidis als Reservoir f{\"u}r die Entwicklung neuartiger Resistenz- und Virulenzdeterminanten, die gerade im Krankenhausmilieu auf Spezies mit h{\"o}herem Virulenzpotential {\"u}bertragen werden k{\"o}nnen und so einen wichtigen Faktor f{\"u}r die anhaltende Problematik nosokomialer Infektionen mit S. aureus darstellen. Die Entdeckung einer RNA mit m{\"o}glicherweise regulatorischer Funktion ist der erste Faktor dieser Art, der - abgesehen von einigen phylogenetisch hoch konservierten RNAs - bisher in S. epidermidis nachgewiesen wurde. Die funktionale Analyse der IGRica-RNA und die Suche nach weiteren regulatorischen RNAs in Staphylokokken er{\"o}ffnen ein Forschungsfeld, das zum besseren Verst{\"a}ndnis der Lebensweise dieser bedeutenden Erreger beitragen kann.}, subject = {Staphylococcus epidermis}, language = {de} } @phdthesis{Hennig2006, author = {Hennig, Susanne}, title = {Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und funktionale Charakterisierung der IS256 Transposase}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20984}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus aureus sowie der Koagulase-negative Staphylococcus epidermidis, haben sich in den letzten Jahren als dominante Erreger nosokomialer Infektionen etabliert. Diese erstaunliche Anpassung an eine neue {\"o}kologische Nische beruht bei S. epidermidis vor allem auf drei Faktoren: (i) der F{\"a}higkeit, Biofilme auf abiotischen Oberfl{\"a}chen auszubilden, (ii) dem Erwerb multipler Antibiotikaresistenzen und (iii) einer hohen genotypischen Variabilit{\"a}t. Ein markantes Beispiel f{\"u}r genotypische Variabilit{\"a}t ist die Phasenvariation der Biofilmbildung durch Insertion und pr{\"a}zise Exzision der Insertionssequenz IS256 aus dem ica-Operon. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der „OFF-ON" Mechanismus der Phasenvariation, die pr{\"a}zise Exzision von IS256, untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass IS256 inklusive der 8 bp target site Duplikation in einem Transposase-unabh{\"a}ngigen Prozess vollst{\"a}ndig aus dem Chromosom entfernt wird, ohne chromosomale Umordnungen oder neue Insertionen. Pr{\"a}zise Exzision war hingegen abh{\"a}ngig von der Integrit{\"a}t der target site Duplikationen. Auch nach Insertion von IS256-Derivaten auf einem Plasmidsystem (spc::IS256) konnte pr{\"a}zise Exzision Transposase-unabh{\"a}ngig erfolgen. Die Wahrscheinlichkeit der Exzision f{\"u}r die vollst{\"a}ndige IS256-Sequenz betrug in diesem System ca. 1x10-11 pro Generation und Zelle. Ab einer Verk{\"u}rzung der Mikrohomologien zwischen den 8 bp target site Duplikationen auf 6 bp war pr{\"a}zise Exzision nicht mehr nachweisbar. Bei Verk{\"u}rzung der IS256-Sequenz auf ca. 160 bp (target site Duplikation und inverted repeats blieben intakt) wurde die Wahrscheinlichkeit der pr{\"a}zisen Exzision ca. dreifach erh{\"o}ht. Diese Beobachtungen unterst{\"u}tzen die Hypothese, dass diese Form der illegitimen Rekombination durch replicational slippage verursacht wird. Gleichzeitig weisen die Daten darauf hin, dass bei der Phasenvariation durch IS256 Insertions- und Exzisionsh{\"a}ufigkeit im Ungleichgewicht stehen. W{\"a}hrend der Durchf{\"u}hrung der Experimente zur pr{\"a}zisen Exzision aus icaC wurden nach mehrt{\"a}giger Passage h{\"a}ufig Varianten isoliert, die trotz noch vorhandener icaC::IS256 Insertion starke Biofilmbildner waren. Derartige biofilmpositive, PIA-negative Phasenvarianten wiesen im Atomic force Mikroskop einen anderen Ph{\"a}notyp als der Wildtyp auf. Anstelle von f{\"a}diger extrazellul{\"a}rer Substanz wie beim Wildtyp wurde verst{\"a}rkt eine polymorphe, aus globul{\"a}ren Untereinheiten bestehende Matrix produziert. Im Gegensatz zum Wildtyp, der in einem vorrangig polysaccharidbasierten Biofilm wuchs, wurde dieser alternative Biofilm durch Proteinkomponenten vermittelt. Die Regulation des proteinogenen Biofilms unterschied sich vom PIA-Biofilm. Zugabe von 4 \% NaCl inhibierte den proteinogenen Biofilm vollst{\"a}ndig, w{\"a}hrend es im Wildtyp die Biofilmbildung induzierte. Zusatz von 3 \% Ethanol im Medium bewirkte eine wesentlich st{\"a}rkere Induktion der Biofilmbildung als beim Wildtyp. Die Transkriptmenge des accumulation associated protein, aap, war in der Phasenvariante im Vergleich zum Wildtyp erh{\"o}ht. Dies spiegelte sich auch auf Proteinebene in einer erh{\"o}hten Expression von Aap wider. Die Daten zeigen, dass S. epidermidis {\"u}ber einen alternativen Mechanismus der Biofilmbildung verf{\"u}gt, der zu einer Modulation der IS256-bedingten Phasenvariation der Biofilmbildung f{\"u}hren kann. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die spezifische DNA-Bindung der IS256 Transposase in vitro n{\"a}her charakterisiert. Dazu wurde die IS256 Transposase heterolog {\"u}berexprimiert und mittels eines N-terminalen Calmodulin binding tag CBP)gereinigt. Im Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) band die CBP-Transposase spezifisch an IRL bzw. IRR DNA-Fragmente, zeigte jedoch eine leicht erh{\"o}hte Affinit{\"a}t zum IRR. Durch Atomic force Mikroskopie ließ sich die Bindung der CBP-Transposase an die inverted repeats innerhalb eines circle junction DNA-Fragments sowie unspezifische DNA-Endbindung nachweisen. Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz des linken und rechten inverted repeats und anschließende EMSA-Experimente demonstrierten, dass die Transposase den inneren Bereich der inverted repeats erkennt und bindet. EMSA-Experimente mit verk{\"u}rzten Transposasederivaten wiesen darauf hin, dass sich das DNA-Bindungsmotiv in der N-terminalen Dom{\"a}ne der Transposase befindet. Die identifizierte Proteinregion (Aa100-130) umfasste zwei a-Helices, getrennt durch einen kurzen turn, mit typischen Charakteristika eines Helix-turn-helix Motivs. Durch Punktmutationen wurden sechs konservierte Aminos{\"a}uren in diesem Bereich ausgetauscht und der Effekt im EMSA {\"u}berpr{\"u}ft. Austausch von L103 und L127 gegen den Helixbrecher Prolin hatte keinen Effekt auf das Bindungsverhalten. Die Mutationen Y111A, G114W, T117A und R118A hingegen f{\"u}hrten zu einer stark abgeschw{\"a}chten Bindung bzw. zum Verlust des Bindungsverm{\"o}gens. Damit wurde erstmals die DNA-Bindungsdom{\"a}ne eines Elements der IS256-Familie n{\"a}her beschrieben.}, subject = {Staphylococcus epidermis}, language = {de} } @phdthesis{Kraenzler2006, author = {Kr{\"a}nzler, Hans-Marcus}, title = {Untersuchungen zur Regulation der Biofilmbildung bei Staphylokokken}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18784}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Staphylokokken sind in erster Linie Saprophyten, welche die Haut und Schleimh{\"a}ute des Menschen besiedeln und dort eine wichtige Rolle f{\"u}r das Gleichgewicht der gesunden Mikroflora spielen. Gleichzeitig haben sie sich aber auch zu den h{\"a}ufigsten Verursachern nosokomialer Infektionen entwickelt. Vor allem S. aureus und S. epidermidis verursachen Erkrankungen, die von leichten Haut- und Wundinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonien, Sepsis oder Endokarditis reichen. Infektionen durch S. epidermidis treten dabei meist in Verbindung mit Fremdk{\"o}rpern wie Kathetersystemen, k{\"u}nstlichen Gelenken und Herzklappen auf. In diesem Zusammenhang scheint vor allem die F{\"a}higkeit, einen Biofilm auf diesen Fremdk{\"o}rpern bilden zu k{\"o}nnen eine große Rolle f{\"u}r die Pathogenese zu spielen. Die Therapie von Staphylokokken-Infektionen wird zunehmend durch die ausgepr{\"a}gte Antibiotikaresistenz dieser Erreger erschwert, die sich mittlerweile auch auf Reserveantibiotika wie Daptomycin, Synercid® (Quinupristin/Dalfopristin) oder Linezolid erstreckt. In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass subinhibitorische Konzentrationen des Streptogramin-Antibiotikums Synercid® die Biofilmbildung in S. epidermidis induzieren. Dar{\"u}ber hinaus mehren sich die Hinweise auch bei anderen Bakterien, dass geringe Antibiotika-Konzentrationen, wie sie in nat{\"u}rlichen Habitaten wie zum Beispiel im Boden vorkommen, wichtige Signale bei der Kommunikation von Bakterien untereinander darstellen und m{\"o}glicherweise eine Funktion bei der Modulation des Metabolismus im Kampf um N{\"a}hrstoffe aus{\"u}ben. In dieser Promotionsarbeit sollte daher exemplarisch, mit Hilfe der erst seit kurzem zur Verf{\"u}gung stehenden DNA-Mikroarray-Technik, der Effekt von subinhibitorischen Synercid®-Konzentrationen auf die globale Genexpression von S. epidermidis und S. aureus analysiert werden. Dabei stand vor allem die Wirkung auf die Biofilmbildung und die Identifikation neuer, an der Biofilmbildung beteiligter Komponenten im Mittelpunkt. Die Ergebnisse zeigen, dass subinhibitorische Synercid®-Konzentrationen bei S. aureus, im Gegensatz zu S. epidermidis, zu einer reduzierten Biofilmbildung f{\"u}hren. Bei beiden Arten ist jedoch die unterschiedliche Biofilmbildung durch eine ausgepr{\"a}gte Ver{\"a}nderung der allgemeinen Genexpression begleitet. Vor allem war eine starke Induktion von Genen zu beobachten, die f{\"u}r Proteine des Translationsapparates kodieren. Außerdem waren Gene des Nukleotid-Stoffwechsels, der Aminos{\"a}ure-Synthese und des Kohlenstoff-Metabolismus unterschiedlich reguliert. Des Weiteren konnte mit Hilfe von HPLC-Analysen sowohl bei S. epidermidis als auch bei S. aureus eine reduzierte Konzentration des Signalmolek{\"u}ls Guanosin-3-5-bisphosphat (ppGpp) festgestellt werden. ppGpp spielt vor allem bei der Kontrolle und Anpassung des Stoffwechsels an Wachstumsbedingungen, wie zum Beispiel das N{\"a}hrstoffangebot, eine wichtige Rolle. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Inaktivierung der ribosomalen Proteine durch Synercid® die reduzierte ppGpp-Konzentration bedingt, was zum einen zur verst{\"a}rkten Bildung ribosomaler Proteine f{\"u}hrt und zum anderen den Zellstoffwechsel in einer Weise beeinflusst, der eine vermehrte extrazellul{\"a}re Polysaccharid-Synthese und damit Biofilmbildung erm{\"o}glicht. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass die unterschiedliche Beeinflussung der Biofilmbildung bei S. epidermidis und S. aureus sehr wahrscheinlich durch verschiedene Regulationswege des ica-Operons und/oder unterschiedliche katabolische F{\"a}higkeiten bedingt werden. Die Ergebnisse belegen weiterhin, dass die Wirkung von Antibiotika weit {\"u}ber deren bekannte inhibitorische Effekte hinausgeht und vor allem den Stoffwechsel der Bakterien dramatisch beeinflußt. Die Konsequenzen dieser Befunde sowohl f{\"u}r das Verst{\"a}ndinis von mikrobiologischen Konsortien in {\"O}kosystemen als auch f{\"u}r die Anwendung von Antibiotika in der Medizin sind noch nicht abzusehen, bieten jedoch eine interessante Grundlage f{\"u}r weitere experimentelle Arbeiten.}, subject = {Staphylococcus}, language = {de} } @phdthesis{Schmid2005, author = {Schmid, Franz-Gregor}, title = {Einfluss von elektrischen Feldern auf die Effektivit{\"a}t der mechanischen Entfernung von Streptococcus sanguinis Biofilmen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17399}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Bakterielle Biofilme auf den Zahnoberfl{\"a}chen sind h{\"a}ufig nur sehr schwer mechanisch zu entfernen. Ziel der Arbeit war es, in einem in vitro Modell zu untersuchen, inwieweit die Effizienz mechanischer Plaqueentfernung durch die zeitgleiche Aufschaltung eines Gleichstroms niedriger Spannung verbessert werden kann. Standardisierte Reintitanpl{\"a}ttchen wurden mit Streptococcus sanguinis DSM 20068 beimpft und anschließend 48 h aerob bis zur bakteriellen Konfluenz bebr{\"u}tet. Anschließend wurden die bewachsenen Pl{\"a}ttchen mit einem Scaler, der als Anode in einem geschlossenen Gleichstromkreis wirkte, nach einem definierten r{\"a}umlichen und zeitlichen Schema bekratzt und nachfolgend mittels physiolog. Kochsalzl{\"o}sung abgesp{\"u}lt. Mit Hilfe der Fluoreszenzphotometrie wurde im Anschluss die noch auf den Pl{\"a}ttchen verbliebene Biomasse quantitativ erfasst. Die Datenanalyse enth{\"u}llte, dass das Anlegen eines elektrischen Feldes die Reinigungs¬effektivit{\"a}t des Scalers signifikant verbesserte. Bei 6 V angelegter Spannung und 500 mA Stromst{\"a}rke war eine um 17\% st{\"a}rkere Reduktion des Biofilms im Vergleich zur Kontrolle ohne angelegtem elektrischen Feld zu beobachten. Eine Variation der Spannung im Bereich von 3 V-6 V zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die Abl{\"o}seeffektivit{\"a}t. Ebenso konnte kein signifikanter Einfluss der Stromflussrichtung festgestellt werden. Die Aufschaltung eines elektrischen Feldes erh{\"o}hte in dieser Studie signifikant die Reinigungswirkung mechanischer Biofilmentfernung in vitro. Die zu Grunde liegenden Mechanismen sind jedoch noch unklar und bed{\"u}rfen weiterer Untersuchungen.}, language = {de} } @phdthesis{Freytag2005, author = {Freytag, Andreas}, title = {Adh{\"a}renz humanpathogener Staphylokokken auf orthop{\"a}dischen Implantatmaterialien}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14178}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Die Anzahl an implantierten Gelenkendoprothesen hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen. Mit ihr auch die Anzahl an Protheseninfektionen. Die Haupterreger sind Staphylokokken (>80\%). Diese sind in vivo unempfindlich gegen{\"u}ber Antibiotika und somit ist die einzige sinnvolle Therapie der Ausbau der infizierten Prothese, welcher lange und kostenspielige Krankenhausaufenthalte f{\"u}r den Patienten mit sich bringt. Der Grund f{\"u}r diese Resistenz der Bakterien liegt darin, dass sie zur Biofilmbildung f{\"a}hig sind und sehr gut an Fremdk{\"o}rper-Oberfl{\"a}chen adh{\"a}rieren k{\"o}nnen. Welche Methode nun geeignet ist, die Adh{\"a}renz von Staphylokokken am besten unter klinisch relevanten Bedingungen zu untersuchen, ist zu pr{\"u}fen. Das in der Arbeit entwickelte Modell erm{\"o}glicht eine semiquantitative Bestimmung der Adh{\"a}renz. F{\"u}r die Versuche wurden Metallpr{\"u}fk{\"o}rper aus Titan und Kobalt-Chrom-Legierung verwendet. Zuvor wurden diese Metalle mit bestimmen Reinigungs- und Sterilisationsvorg{\"a}ngen ges{\"a}ubert. Ein Teil der verwendeten Pr{\"u}fk{\"o}rper ist vor Beimpfung mit den Keimen durch Serumproteine bzw. Gewebsfl{\"u}ssigkeiten beschichtet worden, um das Anheftungsverhalten unter verschiedenen Bedingungen beurteilen zu k{\"o}nnen. Hierf{\"u}r wurden Albumin, Kollagen Typ I und Typ II, Fibronektin und Fibrinogen verwendet. Sieben Titan-Pr{\"u}fk{\"o}rper sind in Schlieren (Schweiz) durch ein spezielles Verfahren mit PLL-g-PEG, einem Makromolek{\"u}l welches die Adh{\"a}sion von Proteinen herabsetzt, beschichtet worden. Eine Auswirkung durch Infektionen sollte hierbei {\"u}berpr{\"u}ft werden. Die Auswertung wurde unter REM-Betrachtung durchgef{\"u}hrt. Hierbei ist eine semiquantitative Abstufung der Adh{\"a}renzkraft von 1-5 getroffen worden. In den Ergebnissen zeigten die beiden verwendeten Metalle Titan und Kobalt-Chrom-Legierung keine wesentlichen Unterschiede in der gezeigten Adh{\"a}renz von Staphylokokken. Durch die Serumprotein- und Gewebsfl{\"u}ssigkeitsbeschichtung ließen sich Unterschiede unter verschiedenen Bedingungen feststellen. Fibronektin und Fibrinogen bewirken eine starke Zunahme an adh{\"a}renten Bakterienzellen. Kollagen Typ I und II zeigen eine leichte Adh{\"a}renzverst{\"a}rkung und bewirken Biofilmbildung. Albuminbeschichtung reduziert die Anzahl adh{\"a}renter Staphylokokken. Die PLL-g-PEG Beschichtung l{\"o}st starke Adh{\"a}renz und Biofilmbildung aus. Die hier angewandte Methode, kontaminierte Metallpr{\"u}fk{\"o}rper unter dem Rasterelektronenmikroskop zu betrachten, eignet sich um das Adh{\"a}renzverhalten von Bakterien zu beurteilen. Dabei lassen sich die Versuchsbedingungen auf vielfache Weise ver{\"a}ndern. Verschiedene Metalle und andere Materialien k{\"o}nnen miteinander verglichen werden. Des Weiteren ist es m{\"o}glich, unterschiedliche Proteinbeschichtungen vorzunehmen, um deren Einfluss auf die Adh{\"a}renz zu zeigen. Zus{\"a}tzlich ist eine Durchf{\"u}hrung der Versuche unter Bewegung m{\"o}glich, was eine Ann{\"a}herung an die Verh{\"a}ltnisse im menschlichen K{\"o}rper bedeutet. Neben Staphylokokken k{\"o}nnten auch andere Bakterienspezies untersucht werden. In dieser Studie wird erstmals gezeigt, dass Kollagen eine Biofilmbildung bei Staphylokokken induziert. Dies bedarf weiterer Untersuchung, welcher Mechanismus hierf{\"u}r verantwortlich ist. Die PLL-g-PEG Beschichtung hat auf Infektionen keine erfolgsversprechende Wirkung. Im Gegenteil, es kommt zu einer starken Besiedlung des Fremdmaterials. Albumin dagegen zeichnet sich durch eine Herabsetzung der Adh{\"a}renzst{\"a}rke aus. Daraus k{\"o}nnte man therapeutischen Nutzen ziehen und Implantate vor Einbau mit Albumin beschichten.}, language = {de} } @phdthesis{Loessner2002, author = {L{\"o}ßner, Isabel}, title = {Die Rolle des bakteriellen Insertionselements IS256 bei der Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermdis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3258}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Staphylococcus epidermidis z{\"a}hlt zu den h{\"a}ufigsten Erregern nosokomialer Infektionen im Zusammenhang mit implantierten Fremdk{\"o}rpern. Diese Bakterien zeigen eine außergew{\"o}hnliche ph{\"a}notypische und genotypische Variabilit{\"a}t, von der auch die Expression wichtiger virulenz- und resistenzassoziierter Gene betroffen ist. M{\"o}glicherweise verf{\"u}gen Staphylokokken damit {\"u}ber Anpassungsstrategien, die sie f{\"u}r das {\"U}berleben unter wechselnden Umweltbedingungen ben{\"o}tigen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von bakteriellen Insertionssequenzen (IS) bei der Genomplastizit{\"a}t von Staphylococcus epidermidis untersucht. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei das Insertionselement IS256 und sein Einfluß auf die Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis. Die F{\"a}higkeit von S. epidermidis, an Oberfl{\"a}chen zu haften und Biofilme zu bilden ist von der Pr{\"a}senz und Expression des ica-Operons abh{\"a}ngig, das Enzyme f{\"u}r die Synthese eines Exopolysaccharids (PIA) kodiert. Die PIA-Produktion ist {\"a}ußerst variabel und hat damit Einfluß auf das Virulenz- und Kolonisierungsverhalten dieser Bakterien. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die ver{\"a}nderliche PIA-Produktion bei S. epidermidis im wesentlichen auf drei Mechanismen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist, an denen das IS-Element IS256 urs{\"a}chlich beteiligt ist. Zun{\"a}chst konnte durch den Vergleich der IS256-spezifischen Hybridisierungsmuster eines biofilmbildenden S. epidermidis-Wildtypstammes und dessen PIA-negativer Spontanvarianten gezeigt werden, daß die multiplen IS256-Kopien im Genom dieses Stammes außerordentlich aktiv sind. Die n{\"a}here Analyse der Varianten ergab bei einem Teil der PIA-negativen Abk{\"o}mmlinge umfangreiche IS256-vermittelte genomische Umordnungen als Ursache f{\"u}r den Verlust der Biofilmbildung. Eine weitere Gruppe von Biofilm-negativen Varianten wies IS256-Insertionen im ica-Gencluster auf. Die Verteilung der Insertionsstellen im ica-Operon ließ darauf schließen, daß es sich bei dem icaC-Gen um einen Hot-spot f{\"u}r die Integration von IS256 handelt. Solche ica::IS256-Insertionen konnten bereits in zahlreichen S. epidermidis St{\"a}mmen nachgewiesen werden. Da diese Insertionen reversibel sind, bilden sie eine wesentliche Ursache f{\"u}r die Phasenvariation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Bei einer dritten Gruppe von Varianten konnten Deletionen verschieden großer DNA-Abschnitte im S. epidermidis-Chromosom beobachtet werden, die zu einem Verlust der ica-Gene und damit der F{\"a}higkeit, Biofilme auszubilden, f{\"u}hrte. Um die Frage zu kl{\"a}ren, welche Gene in der Umgebung des ica-Operons liegen und durch die Deletion von bis zu 250 kb-großen DNA-Fragmenten verloren gehen, wurde eine Cosmid-Genbank des S. epidermidis -Wildtypstammes erstellt. Die durch Nukleotidsequenzierung erhaltenen Informationen wurden mit der in der Genom-Datenbank zur Verf{\"u}gung stehenden Sequenz des 1. A ZUSAMMENFASSUNG 2 Referenzstammes S. epidermidis RP62A verglichen und in einer Genkarte zusammengefaßt. Neben einzelnen Unterschieden zwischen den beiden S. epidermidis-St{\"a}mmen fiel vor allem auf, daß mehrere der von der Deletion betroffenen Leseraster f{\"u}r Proteine mit {\"A}hnlichkeiten zu oberfl{\"a}chenassoziierten Proteinen kodieren, die an der Adh{\"a}renz der Bakterien beteiligt sein k{\"o}nnten. Daneben finden sich aber auch Leserahmen mit {\"A}hnlichkeiten zu Transportsystemen und zahlreiche mobile genetische Elemente. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das ica-Operon von S. epidermidis m{\"o}glicherweise Teil einer Pathogenit{\"a}tsinsel ist. Die Analyse der Deletionsrandbereiche einer Mutante ergab, daß der Verlust von mehr als 200 kb DNA durch homologe Rekombination zwischen zwei IS256-Elementen vermittelt wurde, die im Wildtypstamm in gleicher Orientierung zueinander vorlagen. Da IS256 offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Genomplastizit{\"a}t von S. epidermidis spielt, konzentrierte sich der zweite Teil der Arbeit auf die Aufkl{\"a}rung des Transpositionsmechanismus dieses IS-Elements. Dabei konnte gezeigt werden, daß IS256 eine alternative Transpositionsreaktion nutzt, die durch die Bildung zirkul{\"a}rer, extrachromosomaler DNA-Molek{\"u}le gekennzeichnet ist. Diese DNA-Zirkel bestehen aus einer vollst{\"a}ndigen IS256-Kopie, bei der die beiden Enden des Elementes durch eine variable Anzahl von Nukleotiden fremder DNA als Br{\"u}cke miteinander verbunden sind. Es konnte gezeigt werden, daß diese kurzen DNA-Abschnitte aus der Nachbarschaft der fr{\"u}heren IS256-Insertionsstelle stammen, wobei sowohl stromaufw{\"a}rts als auch stromabw{\"a}rts liegende Nukleotidsequenzen nachgewiesen wurden. Neben diesen vollst{\"a}ndigen IS256-Zirkeln wurden aber auch Molek{\"u}le gefunden, bei denen entweder das rechte oder das linke Ende von IS256 fehlten. Die Daten legen nahe, daß beide IS256-Enden an der Zirkelbildung teilnehmen k{\"o}nnen und im Unterschied zu anderen zirkelbildenden Insertionssequenzen, die Strangtransferreaktion w{\"a}hrend der Zirkularisierung mit geringer Spezifit{\"a}t verl{\"a}uft. Ringf{\"o}rmige IS256-Molek{\"u}le konnten sowohl in S. epidermidis als auch in rekombinanten S. aureus und E. coli-St{\"a}mmen nachgewiesen werden, was auf eine untergeordnete Rolle speziesspezifischer Faktoren bei diesem Prozeß schließen l{\"a}ßt. Dagegen konnte durch die Einf{\"u}hrung einer Mutation in das putative Transposasegen des Elementes gezeigt werden, daß dieses Genprodukt f{\"u}r die IS256-Zirkularisierung essentiell ist. Es ist zu vermuten, daß die Bildung zirkul{\"a}rer IS256-Molek{\"u}le die Voraussetzung f{\"u}r die pr{\"a}zise Exzision des Elementes w{\"a}hrend der Phasenvariation der Biofilmproduktion bildet. Außerdem ist die Generierung stabiler Mutationen durch das Zur{\"u}cklassen von Teilen der duplizierten Zielsequenz oder durch die Vermittlung kleinerer Deletionen w{\"a}hrend der Zirkelbildung vorstellbar. Dar{\"u}ber hinaus bilden die multiplen Kopien des Elementes im Genom Kreuzungspunkte f{\"u}r homologe Rekombinationsereignisse. IS256 stellt damit sehr wahrscheinlich einen wesentlichen Faktor f{\"u}r die Flexibilit{\"a}t des Genoms von S. epidermidis dar. Die detaillierte Aufkl{\"a}rung der molekularen Mechanismen, die die Transposition von IS256 beeinflussen, k{\"o}nnten daher wertvolle Einblicke in die genetischen Anpassungsstrategien dieses bedeutenden nosokomialen Pathogens geben.}, subject = {Staphylococcus epidermis}, language = {de} } @phdthesis{Rachid2000, author = {Rachid, Shwan}, title = {Molecular investigation of the influence of environmental factors and subinhibitory antibiotic concentrations on the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1882}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Biofilm production is an important step in the pathogenesis of S. epidermidis polymer-associated infections and depends on the expression of the icaADBC operon leading to the synthesis of a polysaccharide intercellular adhesin (PIA). The PIA represents a sugar polymer consisting of ß-1,6 linked N-acetyl glucosaminoglycans and mediates the intercellular adherence of the bacteria to each other and the accumulation of a multilayered biofilm. Epidemiological and experimental studies strongly suggest that PIA-production and subsequently biofilm formation contributes significantly to the virulence of specific S. epidermidis strains. This work aimed on the investigation of external factors regulating the ica expression in S. epidermidis. For this purpose, a reporter gene fusion between the ica promoter and the beta-galactosidase gene lacZ from E. coli was constructed and integrated into the chromosome of an ica positive S. epidermidis clinical isolate. The reporter gene fusion was used to investigate the influence of external factors and of sub-MICs of different antibiotics on the ica expression. It was shown that the S. epidermidis biofilm formation is growth phase dependent with a maximum expression in the late logarithmic and early stationary growth phase. The optimal expression was recorded at 42 °C at a neutral pH ranging from 7.0 to 7.5. The glucose content of the medium was found to be essential for biofilm formation, since concentrations of 1.5 to 2 per cent glucose induced the ica expression. In addition, external stress factors as high osmolarity (mediated by 3 to 5 per cent sodium chloride), and sub-lethal concentrations of detergents, ethanol, hydrogene peroxide, and urea significantly enhanced the biofilm production. Subinhibitory concentrations of tetracyline, the semisynthetic streptogramin quinupristin/dalfopristin and the streptogramin growth promoter virginiamycin were found to enhance the ica expression 8 to 11-fold, respectively, whereas penicillin, oxacillin, gentamicin, clindamycin, vancomycin, teicoplanin, ofloxacin, and chloramphenicol had no effects. A weak induction was recorded for sub-MICs of erythromycin. Both quinupristin/ dalfopristin and tetracyline exhibited a strong postexposure effect on the S. epidermidis ica expression, respectively, even when the substances were immediately removed from the growth medium. The results were confirmed by Northern blot analysis of the ica transcription and quantitative analysis of biofilm formation in a colorimetric assay. Expression of the icaprom::lacZ reporter gene plasmid in Bacillus subtilis and S. epidermidis revealed that the ica induction by sub-MICs of streptogramins and tetracycline might depend on unidentified regulatory elements which are specific for the staphylococcal cell. In contrast, the activation by external stress signals seems to be mediated by factors which are present both in Staphylococci and in Bacillus subtilis. Construction and analysis of an agr-mutant in a biofilm-forming S. epidermidis strain excluded the possibility that the Agr-quorum-sensing system significantly contributes to the ica expression in the stationary growth phase. However, clear evidence was provided that in S. aureus the ica transcription depends on the expression of the alternative transcription factor sigmaB, which represents a global regulator of the stress response in S. aureus as well as in B. subtilis. For this purpose, a sigB knockout mutant had been constructed in a biofilm-forming S. aureus. This mutant showed a markedly decrease of the ica transcription and biofilm-production, whereas a complement strain carrying the sigB gene on an expression vector completely restored the biofilm-forming phenotype of the S. aureus wild type. Southern blot analysis indicated that the the sigB gene is also present in S. epidermidis and Northern analyses of the sigB and the ica transcription revealed that both genes are activated under identical conditions (i. e. in the stationary growth phase and by external stress factors) suggesting a similar regulatory pathway as in S. aureus. However, since neither in S. aureus nor in S. epidermidis the ica promoter has obvious similiarities to known SigB-dependent promotoer sequences it is tempting to speculate that the ica activation is not directely mediated by SigB, but might be indirectely controlled by other SigB-dependent regulatory elements which remain to be elucidated.}, subject = {Staphylococcus epidermidis}, language = {en} } @phdthesis{Cho2001, author = {Cho, Seung-Hak}, title = {Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181296}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis geh{\"o}ren zu den h{\"a}ufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig dar{\"u}ber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die F{\"a}higkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und h{\"a}ngt von der genetischen Ausstattung der St{\"a}mme mit dem f{\"u}r die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon h{\"a}ufiger in klinischen als in kommensalen St{\"a}mmen vorkommt. Der {\"u}berwiegende Teil dieser ica-positiven St{\"a}mme bildete ph{\"a}notypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-St{\"a}mme, unabh{\"a}ngig von ihrer Herkunft, das vollst{\"a}ndige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser St{\"a}mme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-St{\"a}mme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-St{\"a}mmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant h{\"a}ufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-St{\"a}mmen nachweisbar, w{\"a}hrend es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophyt{\"a}ren Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-St{\"a}mme wiesen {\"u}berdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Ph{\"a}notyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante f{\"u}hrte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollst{\"a}ndige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollst{\"a}ndig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen {\"u}berein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo w{\"a}hrend einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Ph{\"a}notyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten St{\"a}mmen zu gr{\"o}ßeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilit{\"a}t unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus aus{\"u}bt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der ver{\"a}nderten SigB-Expression in Zusammenhang steht.}, subject = {Staphylococcus aureus}, language = {de} }