@phdthesis{Ittner2024, author = {Ittner, Cora}, title = {Ver{\"a}nderte Barriereeigenschaften der Blut-Hirn-Schranke durch Katecholamine und Entz{\"u}ndungsmediatoren bei Sauerstoff-Glucose-Entzug \(in\) \(vitro\)}, doi = {10.25972/OPUS-34649}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-346497}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2024}, abstract = {Das zeitgleiche Auftreten eines isch{\"a}mischen Schlaganfalls sowie eines Takotsubo-Syndroms (TTS) scheint eine relevante, bisher nicht ausreichend verstandene klinische Konstellation zu sein. Die Pathologien k{\"o}nnen als {\"u}ber die Hirn-Herz-Achse gekoppelt verstanden werden, in die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) als funktionale Komponente integriert ist. Das klinisch-neurologische Outcome dieses Patient:innen-Kollektivs scheint signifikant schlechter zu sein als nach solit{\"a}rem isch{\"a}mischen Insult. Es wurde hypothetisiert, dass die BHS in besonderem Maße kompromittiert sein k{\"o}nnte. Das vorwiegend weibliche, postmenopausale Patient:innenkollektiv pr{\"a}sentierte laborchemisch elevierte Katecholaminspiegel sowie Entz{\"u}ndungsparameter. Diese Konditionen wurden unter Sauerstoff-Glucose-Entzug (OGD) in vitro simuliert und resultierende Alterationen eines etablierten BHS-Modells aus murinen cEND-Zellen der cerebralen Mikrozirkulation untersucht. Die Evaluation der BHS-Integrit{\"a}t erfolgte anhand von spezifischen Junktionsproteinen sowie Integrinuntereinheiten. Alle Versuche wurden parallel unter {\"O}strogen-Applikation (E2) durchgef{\"u}hrt, um die m{\"o}gliche BHS-Protektion durch das weibliche Sexualhormon zu untersuchen. Die getrennte Applikation von Katecholaminen (KAT) sowie Entz{\"u}ndungsmediatoren (INF) f{\"u}hrte gegen{\"u}ber der simultanen Applikation zu einem geringeren BHS-Schaden. Dieser erschien zeitgebunden, wobei sich das Ausmaß gewissermaßen proportional zur Einwirkdauer verhielt. Auswirkungen von OGD sowie einer Reoxygenierung, im Sinne einer simulierten Reperfusion, potenzierten sich mit den Effekten von KAT/INF. {\"U}berwiegend kompromittierten OGD und KAT/INF die BHS-Integrit{\"a}t, wobei nach Reoxygenierung eine „Erholung" oder ein „Reperfusionsschaden" vorlag. Eine Protektion durch E2 war morphologisch nachweisbar, speziell gegen{\"u}ber OGD, KAT/INF sowie einem „Reperfusionsschaden". Auf Ebene der Gen- sowie Proteinexpression konnte dies nicht gezeigt werden. Die Hom{\"o}ostase des ZNS w{\"u}rde in vivo beeintr{\"a}chtigt, Katecholamine sowie Entz{\"u}ndungsmediatoren k{\"o}nnten ungehindert das bereits durch die Isch{\"a}mie gesch{\"a}digte neuronale Gewebe erreichen. Insgesamt tr{\"a}gt diese Arbeit zu einem Verst{\"a}ndnis der molekularen BHS-Ver{\"a}nderungen im Kontext des zeitgleichen Auftretens von TTS und einem isch{\"a}mischem Insult bei. Es wurde eine experimentelle Grundlage geschaffen, um zuk{\"u}nftig pathogenetische Hintergr{\"u}nde weiter erforschen zu k{\"o}nnen. Darauf aufbauend k{\"o}nnten, nach weiterer in vitro- sowie in vivo-Forschung, klinische Therapiekonzepte optimiert werden.}, subject = {Blut-Hirn-Schranke}, language = {de} } @phdthesis{Sun2023, author = {Sun, Aili}, title = {Effect of Tjap1 knock-down on blood-brain barrier properties under normal and hypoxic conditions}, doi = {10.25972/OPUS-34645}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-346450}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide. The blood-brain barrier (BBB) plays an important role in maintaining brain homeostasis by tightly regulating the exchange of substances between circulating blood and brain parenchyma. BBB disruption is a common pathologic feature of stroke and traumatic brain injury. Understanding the cellular and molecular events that affect the BBB after ischaemic brain injury is important to improve patient prognosis. We have previously shown that microRNA-212/132 is elevated in hypoxic brain microvascular endothelial cells and acts through suppressing the expression of direct microRNA-212/132 target genes with function at the BBB: claudin-1, junctional adhesion molecule 3 (Jam3) and tight-junction associated protein 1 (Tjap1). While the role of claudin-1 and Jam3 at the BBB is well known, the role of Tjap1 is still unclear. The aim of this work was therefore to characterize the role of Tjap1 in brain endothelial cells using a knock-down (KD) approach in established murine in vitro BBB models cEND and cerebEND. Tjap1 KD was established by stable transfection of a plasmid expressing shRNA against Tjap1. The successful downregulation of Tjap1 mRNA and protein was demonstrated by qPCR and Western blot. Tjap1 KD resulted in impaired barrier properties of endothelial cells as shown by lower TEER values and higher paracellular permeability. Interestingly, the Tjap1 KD cells showed lower cell viability and proliferation but migrated faster in a wound healing assay. In the tube formation assay, Tjap1 KD cell lines showed a lower angiogenic potential due to a significantly lower tube length and number as well as a lower amount of branching points in formed capillaries. Tjap1 KD cells showed changes in gene and protein expression. The TJ proteins claudin-5, Jam3 and ZO-1 were significantly increased in Tjap1 KD cell lines, while occludin was strongly decreased. In addition, efflux pump P-glycoprotein was downregulated in Tjap1 KD cells. Oxygen-glucose deprivation (OGD) is a method to mimic stroke in vitro. Brain endothelial cell lines treated with OGD showed lower barrier properties compared to cells cultured under normal condition. These effects were more severe in Tjap1 KD cells, indicating active Tjap1 involvement in the OGD response in brain microvascular endothelial cells. We thus have shown that Tjap1 contributes to a tight barrier of the BBB, regulates cell viability and proliferation of endothelial cells, suppresses their migration and promotes new vessel formation. This means that Tjap1 function is important for mature BBB structure in health and disease.}, subject = {Schlaganfall}, language = {en} } @phdthesis{GoebneeKlaus2023, author = {G{\"o}b [n{\´e}e Klaus], Vanessa Aline Domenica}, title = {Pathomechanisms underlying ischemic stroke}, doi = {10.25972/OPUS-28672}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-286727}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption. In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models. Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target. Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment.}, subject = {Schlaganfall}, language = {en} } @phdthesis{Reifschlaeger2023, author = {Reifschl{\"a}ger, Leonie Sophie}, title = {Analyse exosomaler microRNAs im Serum von Patientinnen mit Brustkrebsmetastasen}, doi = {10.25972/OPUS-31398}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-313987}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Das Mammakarzinom ist weltweit die h{\"a}ufigste krebsbedingte Todesursache bei Frauen. Fortschritte in der Therapie erm{\"o}glichen zwar eine Verl{\"a}ngerung der Lebens- dauer, jedoch kommt es dadurch vermehrt zur Bildung von Metastasen im zentralen Nervensystem (ZNS). Die Diagnostik und Behandlung von ZNS-Metastasen sind be- grenzt und die Lebensqualit{\"a}t sowie Lebensdauer der Betroffenen nimmt bei zerebraler Metastasierung rapide ab. Ziel aktueller Forschungsprojekte ist daher, Biomarker zu identifizieren, die Hinweise auf eine Brustkrebserkrankung oder Metastasierung liefern. So soll eine kosteng{\"u}nstige, risikoarme und minimalinvasive Methode etabliert werden, die zuverl{\"a}ssige Daten {\"u}ber die Prognose und dementsprechende Therapien erbringt. Diese Arbeit hatte daher die Absicht, mithilfe von qPCR Expressionsprofile von miRNAs aus Serumproben von Brustkrebspatientinnen zu erstellen und deren Funktion als prog- nostische Biomarker f{\"u}r eine Metastasierung ins ZNS zu erweisen. Anhand von Metas- tasierung und Rezeptorstatus wurden die Proben in Untergruppen eingeteilt und statis- tisch mit einer gesunden Kontrollgruppe verglichen. Insgesamt zeigte sich bei 26 miRNAs eine signifikante Dysregulation der Expression bei mindestens einer der Untergruppen. Insbesondere bei ZNS-Metastasen war das Expres- sionsmuster bei miRNA-122-5p, miRNA-296-5p, miRNA-490-3p und miRNA-576-3p sig- nifikant erh{\"o}ht, w{\"a}hrend die Expression von miRNA-130a-3p, miRNA-148b-3p und miRNA-326 signifikant reduziert war. Basierend auf den {\"U}bereinstimmungen unserer Er- gebnisse mit den Daten bisheriger Forschungsprojekten wiesen vier miRNAs eine po- tenzielle Funktion als Biomarker f{\"u}r Metastasen auf: miRNA-122-5p, miRNA-490-3p und miRNA-130a-3p, miRNA-326. Bei ZNS-Metastasen zeigten besonders miRNA-122-5p und miRNA-490-3p statistisch relevante Ver{\"a}nderungen. Um den Einfluss von miRNAs auf den gesamten K{\"o}rper darzustellen, wurde mithilfe ver- schiedener Datenbanken nach entsprechenden Zielgenen und Signalwegen f{\"u}r die 26 identifizierten miRNAs recherchiert. Neben dem Einfluss auf Stoffwechselwege und Er- krankungen, zeigte sich bei acht Targets ein Zusammenhang mit der Entstehung von Krebs. Erg{\"a}nzend zur Identifikation von miRNA-Expressionsprofilen wurden Zellkulturversuche mit zerebralen Endothel- (cerebEND) und Brustkrebszellen (4T1) durchgef{\"u}hrt. Verwendet wurden zwei cerebEND- und eine 4T1-Zellreihe von M{\"a}usen, von denen eine ce- rebEND-Kultur zuvor in der Arbeitsgruppe Burek mit einem miRNA-210-Vektor trans- fiziert wurde. Studien belegen den Einfluss von miRNA-210 auf den mitochondrialen Stoffwechsel, Angiogenese, Reaktionen auf DNA-Sch{\"a}den, Apoptose und Zell{\"u}berleben sowie auf die Proteine BRCA1, PARP1 und E-Cadherin und schreiben ihr damit eine Funktion in der Krebsentstehung und Metastasierung zu. Zur Bestimmung der Proliferation und Aktivit{\"a}t der transfizierten cerebEND-210-Zellen im Verh{\"a}ltnis zur unbehandelten Kontrolle, wurden BrdU-Proliferationsassays und MTT- Assays mit verschiedenen Zellzahlen durchgef{\"u}hrt. Bei der Untersuchung der Prolifera- tion zeigte sich in beiden Versuchen eine erh{\"o}hte Aktivit{\"a}t der cerebEND-210-Zellen, da miRNA-210 vermutlich auch hier das Zell{\"u}berleben gesichert hat. Zudem wurde die An- heftung der Brustkrebszellen an den zerebralen Endothelzellen im Adh{\"a}sionsversuchs {\"u}berpr{\"u}ft. Hierbei wurde eine Abnahme der Adh{\"a}sion der cerebEND-210-Zellen beo- bachtet. Vermutet wird eine Ver{\"a}nderung des Ph{\"a}notyps der Rezeptorbindungen der cerebEND-210-Zellen. Die Ergebnisse der Zellkulturversuche dienen als Grundlage f{\"u}r weitere Experimente.}, subject = {miRNS}, language = {de} } @phdthesis{Giniunaite2023, author = {Giniunaite, Aiste Marija}, title = {Effekte von Tumor Treating Fields (TTFields) auf die Blut-Hirn-Schranke in einem murinen (cerebEND) und humanen (HBMVEC) Zellkulturmodell}, doi = {10.25972/OPUS-31064}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-310648}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {TTFields sind eine zugelassene Therapie f{\"u}r die Behandlung von Glioblastom IDH-Wildtyp. Es handelt sich dabei um elektrische Wechselfelder niedriger Intensit{\"a}t und mittlerer Frequenz, die therapeutisch aus zwei Richtungen durch ein tragbares, nicht-invasives Ger{\"a}t appliziert werden. Sie verhindern die Spindelfaserbildung w{\"a}hrend der Mitose. Die Wirkung vieler effektiver Chemotherapeutika ist im ZNS durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) eingeschr{\"a}nkt. Die BHS wird nach TTFields Applikation bei 100 kHz in einem murinen cerebEND-Zell-Modell vor{\"u}bergehend ge{\"o}ffnet. Dieser Effekt wurde in dieser Arbeit zun{\"a}chst mit Hilfe von Immunfluoreszenzmikroskopie und dann durch einen fraktionierten Western-Blot best{\"a}tigt, dass der mutmaßliche Wirkungsmechanismus von TTFields in der Delokalisierung des tight junction Proteins Claudin-5 von der Membran in das Zytoplasma liegt. TEER-Messungen zeigten, dass sich die Integrit{\"a}t der BHS durch 100 kHz TTFields nach 72 h verringerte und 48 h - 72 h nach Ende der Behandlung wieder normalisierte, auch wenn statt eines Behandlungsendes auf 200 kHz TTFields umgeschaltet wurde. Der zweite Teil der Untersuchung bestand darin, ein BHS-Modell aus humanen HBMVEC Zellen zu etablieren, um die Auswirkungen von TTFields im humanen System verifizieren zu k{\"o}nnen. Zun{\"a}chst konnten keine Effekte von TTFields unterschiedlicher Frequenz auf eine HBMVEC-Monokultur festgestellt werden. In einer Kokultur mit Perizyten gab es eine erh{\"o}hte Expression von Claudin-5, Occludin und PECAM-1. Allerdings zeigten die TEER-Messungen und ein Permeabilit{\"a}tsassay keine Unterschiede zwischen den Mono- und Kokultur-Modellen der BHS auf. Durch eine transiente {\"O}ffnung der BHS k{\"o}nnte eine h{\"o}here Dosis von Therapeutika, die normalerweise die BHS nicht {\"u}berwinden k{\"o}nnen, im ZNS erreicht werden. Damit k{\"o}nnten TTFields eine innovative Methode zur Behandlung von Hirntumoren und anderen Erkrankungen des ZNS darstellen. Die hier pr{\"a}sentierten Daten geben erste Hinweise in diese Richtung, m{\"u}ssen aber noch optimiert und verifiziert werden.}, subject = {Tumortherapiefelder}, language = {de} } @phdthesis{Dilling2022, author = {Dilling, Christina}, title = {Auswirkungen des Protocadherin-gamma-C3-Knockouts auf die Barriereeigenschaften der Blut-Hirn-Schranke}, doi = {10.25972/OPUS-26013}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-260137}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {Protocadherine spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Nervensystems und sind an Prozessen der Zellmigration und -differenzierung, sowie der Hemmung von Zellwachstum beteiligt. Um die Funktion und Regulation von Protocadherin gamma C3 (PcdhγC3) an mikrovaskul{\"a}ren Endothelzellen des Großhirns (cEND) und des Kleinhirns (cerebEND) zu untersuchen, wurden die PcdhγC3-Knock-out (KO) Zelllinien mit der CRISPR/Cas9 Methode etabliert. Der KO f{\"u}hrt zu verminderten Barriereeigenschaften der Blut-Hirn-Schranke (BHS), was sich in einer erh{\"o}hten Permeabilit{\"a}t f{\"u}r Fluoreszein und einem verringerten transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER) widerspiegelt. Es konnte eine Ver{\"a}nderung der Wachstumsrate und dem Adh{\"a}sionsverhalten der KO-Zellen nachgewiesen werden. Auch die Expression der Tight-Junction-Proteine, sowie einiger Komponenten des Wnt und mTOR Signalwegs wurden durch den KO von PcdhgC3 beeinflusst.}, subject = {Blut-Hirn-Schranke}, language = {de} } @phdthesis{Nehen2021, author = {Nehen, Mathias Julius}, title = {Modulation der Schrankenfunktion prim{\"a}rer humaner zerebraler Endothelzellen durch Fumars{\"a}ureester unter inflammatorischen und nicht-inflammatorischen Bedingungen}, doi = {10.25972/OPUS-24092}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-240925}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {Die Multiple Sklerose ist eine bisher nicht heilbare, chronisch-inflammatorische demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems. Trotz intensiver Forschungsbem{\"u}hungen ist der exakte Pathomechanismus nicht vollkommen verstanden. Klar ist jedoch, dass der Blut-Hirn-Schranke eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese zukommt. Seit Februar 2014 ist mit Dimethylfumarat ein neues orales Medikament f{\"u}r die schubf{\"o}rmige Multiple Sklerose zugelassen. Die Wirkungen von Fumars{\"a}ureestern auf humane zerebrale Endothelzellen als Grundsteine der Blut-Hirn-Schranke sind allerdings nur unzureichend untersucht. Mehrere Forschungsgruppen demonstrierten an humanem Nabelschnurvenenendothel einen hemmenden Effekt von Fumars{\"a}ureestern auf die Adh{\"a}sion von Leukozyten und beschrieben eine Inhibition der Aktivierung des proinflammatorischen Transkriptionsfaktors NFB in den Endothelzellen. Aufgrund der charakteristischen Eigenschaften zerebralen Endothels ist eine {\"U}bertragung dieser Beobachtungen auf die Blut-Hirn-Schranke allerdings nicht ohne weiteres m{\"o}glich. Daher galt es potentielle Effekte von Fumars{\"a}ureestern auf prim{\"a}re humane zerebrale Endothelzellen als in vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke zu {\"u}berpr{\"u}fen. Dabei wurden die Zellen nicht nur unter ruhenden Bedingungen, sondern auch unter inflammatorischer Stimulation mit TNF-α, IL-1 und IFN untersucht, einem Milieu, wie es in inflammatorischen MS L{\"a}sionen zu finden ist. In Leukozyten-Adh{\"a}sionsassays konnte durch Inkubation mit Monomethylfumarat und Dimethylfumarat keine funktionale Beeinflussung der Adh{\"a}sion von T-Lymphozyten an den verwendeten zerebralen Endothelzellen verzeichnet werden. Kongruent dazu fand sich in durchflusszytometrischen Analysen keine Hemmung der inflammatorisch vermittelten Expression des Adh{\"a}sionsmolek{\"u}ls ICAM-1, welches eine tragende Rolle bei der Leukozytenmigration spielt. Inflammatorische intrazellul{\"a}re Signalwege, wie die NFB-Kerntranslokation oder die Phosphorylierung von p38 wurden in HECE im Gegensatz zu HUVEC durch Fumars{\"a}ureester ebenso wenig beeinflusst. Diese in sich konsistenten Ergebnisse f{\"u}hren zu der Schlussfolgerung, dass im Gegensatz zu anderen Gef{\"a}ßbetten weder Dimethylfumarat noch Monomethylfumarat direkt am zerebralen Endothel anti-inflammatorisch wirken.}, subject = {Multiple Sklerose}, language = {de} } @phdthesis{Burmester2021, author = {Burmester, Sandra}, title = {Etablierung eines Zellkulturmodells der Interaktion von Gehirnendothel- und Nierenzellen im akuten Nierenversagen}, doi = {10.25972/OPUS-23862}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-238625}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {Das Ziel dieser Studie war es, die Pathomechanismen der Enzepahlopathie, welche w{\"a}hrend einer akuten Nierensch{\"a}digung beobachtet werden kann, zu untersuchen. Wir konzipierten ein Zellkulturmodell, welches aus der cerebralen Endothelzelllinie cEND und der Nierentubuluszelllinie HK-2 bestant. Die Nierenzellen wurden einem Sauerstoff-Glukose-Entzug zugef{\"u}hrt, um eine akute Nierensch{\"a}digung zu simulieren. Nach weiterer Behandlung mit zwei urm{\"a}mischen Toxinen (Indoxylsulfate und Indolessigs{\"a}ure) und gemeinsamer Inkubation beider Zelllinien f{\"u}r insgesamt 48 Stunden wurden die cEND-Zellen geerntet und die Expression von Tight junction-Proteinen und Glukosetransportern untersucht.}, subject = {akutes Nierenversagen}, language = {de} } @phdthesis{Gabbert2021, author = {Gabbert, Lydia}, title = {Protocadherine an der Blut-Hirn-Schranke}, doi = {10.25972/OPUS-23480}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-234807}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {Protocadherine (Pcdh) sind im zentralen Nervensystem (ZNS) stark exprimiert und {\"u}ben vielf{\"a}ltige Funktionen bei der neuronalen Entwicklung aus. Der Knockout eines Vertreters der Pcdhs, PcdhgC3, f{\"u}hrt zu Ver{\"a}nderungen in tight junction Proteinleveln in mikrovaskul{\"a}ren Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke (BBB). In dieser Arbeit untersuche ich die Rolle des PcdhgC3 Knockouts (KO) in Transportern der Blut-Hirn-Schranke sowie dessen Auswirkungen auf die Signaltransduktion mittels Serumreduktion, Zellmigrationsversuchen, Signalweg-Inhibierung und Sauerstoff-Glucose-Entzug. Der PcdhgC3 Knockout resultiert in ver{\"a}nderten Proteinleveln der BBB Transporter und k{\"o}nnte ein vielversprechendes Therapieziel zuk{\"u}nftiger Pharmakotherapie sein. Ebenso f{\"u}hrt die Serumreduktion in den KO-Zellen zu h{\"o}heren Leveln von Signalkinasen (Erk). Die Knockout-Zelllinie zeigt signifikant schnellere Migrationsraten und scheint durch Signalweg-Inhibitoren (mTOR, MAPK, wnt-Inhibitoren) st{\"a}rker im Wachstum reduziert zu sein. So k{\"o}nnte PcdhgC3 eine Rolle bei der Regulierung von Signalwegen spielen und zu einer ver{\"a}nderten Integrit{\"a}t der Blut-Hirn-Schranke beitragen.}, subject = {Cadherine}, language = {de} } @phdthesis{Scheffer2020, author = {Scheffer, David}, title = {Einfluss einer Dexamethason/Bortezomib-Kombinationstherapie auf den Glukokortikoidrezeptor und die Tight Junction-Molek{\"u}le Claudin-5 und Occludin in Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke in experimentellen Modellen des Sch{\"a}del-Hirn-Traumas}, doi = {10.25972/OPUS-21871}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-218712}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Das Sch{\"a}del-Hirn-Trauma (SHT) ist ein großes medizinisches Problem. Das Hirn{\"o}dem mit konsekutiv erh{\"o}hten intrakraniellen Dr{\"u}cken ist eine h{\"a}ufige und schwerwiegende Komplikation des schweren SHT. Es ist der signifikanteste Pr{\"a}diktor f{\"u}r ein schlechtes Outcome. Obwohl Glukokortikoide (GK) die Ausbildung eines Hirn{\"o}dems bei neuroinflammatorischen Erkrankungen und manchen Hirntumoren reduzieren k{\"o}nnen, ist diese Substanzklasse im SHT ineffektiv oder sogar sch{\"a}dlich. Nach controlled cortical impact (CCI) in M{\"a}usen, einem etablierten SHT-Modell in-vivo, zeigte sich ein Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Des Weiteren wurde der BHS-stabilisierende Effekt der GK nach CCI durch proteasomalen Abbau des Glukokortikoidrezeptors (GR) behindert. Eine Inhibierung des Proteasoms durch den Proteasomeninhibitor Bortezomib zusammen mit einer GK-Therapie mit Dexamethason reduzierte den Abbau des GR und sorgte f{\"u}r eine Restitution der BHS-Integrit{\"a}t. Ungl{\"u}cklicherweise ließen sich diese Ergebnisse in-vitro nicht auf in Sauerstoff-/Glukosemangel-Modell in der humanen Hirnendothelzelllinie hCMEC/D3 {\"u}bertragen. Daher konnte f{\"u}r die Kombinationstherapie aus dem Proteasomeninhibitor Bortezomib und Dexamethason kein positiver Effekt gezeigt werden. }, subject = {Sch{\"a}del-Hirn-Trauma}, language = {de} } @phdthesis{Koch2020, author = {Koch, Angelina}, title = {Expression von Transportern, Rezeptoren und Zell-Zell-Kontakt Proteinen an der Blut-Hirn-Schranke: Vergleich zwischen immortalisierten und prim{\"a}ren Hirnendothelzellen}, doi = {10.25972/OPUS-20450}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-204505}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine wichtige Barriere zwischen dem Blutsystem und dem Gehirngewebe dar. An der Bildung dieser Barriere sind haupts{\"a}chlich die Endothelzellen der Blutkapillaren beteilig. Dabei verschließen die Tight Junction Proteine und die Adherens Junction Proteine den interzellul{\"a}ren Spalt zwischen zwei benachbarten Endothelzellen. Dieser Verschluss sorgt daf{\"u}r, dass keine Noxen aus dem Blut in das Zentralnervensystem gelangen k{\"o}nnen. Damit jedoch der Transport wichtiger N{\"a}hrstoffe in das ZNS und der Abtransport von Abfallprodukten aus dem ZNS gew{\"a}hrleistet sind, sind spezielle Rezeptoren und Transporter notwendig. Diese sorgen auch daf{\"u}r, dass in die Endothelzellen eingedrungene sch{\"a}dliche Substanzen wieder zur{\"u}ck in das Blutsystem bef{\"o}rdert werden. Daf{\"u}r sind Effluxpumpen, Proteine der Solute Carrier Familie und zellul{\"a}re Rezeptoren verantwortlich. Die immortalized mouse cerebral/cerebellar capillary endothelial cells (cEND/cerebEND) Modellsysteme sind in-vitro Modellsysteme der BHS und wurden in der AG: F{\"o}rster in der An{\"a}sthesiologie im Universit{\"a}tsklinikum W{\"u}rzburg bereits erfolgreich isoliert und schon dazu benutzt verschiedene physiologische und pathophysiologische Prozesse in der BHS zu beschreiben und zu erkl{\"a}ren. Die Zellen werden in diesem BHS-Modell mit Hilfe des Polynoma large T Antigens immortalisiert. Das Ziel der Doktorarbeit war der Vergleich der mRNA Expressions- und Proteinlevel verschiedener Tight Junction-Proteine, Adherens Junctions, Effluxpumpen, Proteine der SLC-Familie und zellul{\"a}rer Rezeptoren der BHS zwischen cEND/cerebEND und prim{\"a}ren Zellen, die aus dem Großhirn isoliert wurden, sowohl in 10\% FCS als auch in 1\% FCS N{\"a}hrmedium. Es sollte ermittelt werden, ob durch die Immortalisierung der Hirnendothelzellen eine Ver{\"a}nderung in der Expression der Proteine herbeigef{\"u}hrt wird und ob es Unterschiede in der Expression bez{\"u}glich der Mediumkonzentration gibt. Untersucht wurden die mRNA Expressionslevel mit Hilfe der RT-PCR und die Proteinlevel mittels Western Blot. Es hat sich heraus gestellt, dass cEND und cerebEND in vielen F{\"a}llen {\"a}hnliche Mengen an ABC-Transportern, Proteinen der SLC-Familie, zellul{\"a}rern Rezeptoren und Tight Junction Proteinen wie prim{\"a}re Zellen, sowohl in 10\% FCS als auch in 1\% FCS Medium exprimieren. Dabei sind die mRNA- und Proteinexpressionslevel von Tight Junctions und der zellul{\"a}ren Rezeptoren, Insulin- und Transferrinrezeptor, im Vergleich zu prim{\"a}ren Zellen am {\"a}hnlichsten. In diesen F{\"a}llen wird die Expression der untersuchten Proteine durch die Immortalisierung der Hirnendothelzellen nicht signifikant ver{\"a}ndert. Somit l{\"a}sst sich die Barrierefunktion der Hirnendothelzellen besonders gut mit den in-vitro Modellsystemen untersuchen. Die Modellsysteme cEND und cerebEND zeigen allerdings auch einige Schwachstellen. Bcrp, Mct1, Lrp1 und P-gp lassen sich nur bedingt mit diesen Modellsystemen untersuchen, da ihre mRNA- und Proteinexpression sehr stark hoch, im Fall von Bcrp, oder runter reguliert wird, im Fall von Mct1 und Lrp1 in cEND/cerebEND und P-gp in cerebEND. Im Hinblick auf Ver{\"a}nderungen in der Expression durch Mediumreduktion wird deutlich, dass sie zu h{\"o}heren Expressionsraten in cEND, mehr noch in cerebEND, f{\"u}hrt. Dies zeigt sich auf mRNA-Ebene noch deutlicher als auf Proteinebene. Diese Tatsache scheint sich allerdings nicht im Vergleich mit prim{\"a}ren Zellen sichtbar zu machen. Es zeigt sich kein Unterschied im Vergleich zu prim{\"a}ren Zellen zwischen 10\% FCS und 1\% FCS N{\"a}hrmedium. Damit stellen cEND und cerebEND in vielen verschiedenen, jedoch nicht in allen Fragestellungen geeignete Modellsysteme dar.}, subject = {Blut-Hirn-Schranke}, language = {de} } @phdthesis{Gaiser2020, author = {Gaiser, Fabian}, title = {Der Einfluss von NMDA-Rezeptor-Modulatoren auf die Blut-Hirn Schranke unter isch{\"a}mischen Bedingungen}, doi = {10.25972/OPUS-20236}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-202365}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Motilit{\"a}tsverhalten von Blut-Hirn Schranken-Endothelzellen unter isch{\"a}mischen Bedingungen an Hand der cerebEND-Zelllinie untersucht. Da es bisher noch kein Modell f{\"u}r diese Fragestellung gab, wurde zun{\"a}chst ein solches mit Hilfe des kommerziellen Motilit{\"a}tsassay der Firma ibidi® etabliert. Danach konnte der Einfluss von isch{\"a}mischen Bedingungen, von Astrozyten konditioniertem Medium (C6-Zelllinie) und letztendlich der therapeutische Ansatz durch Modulation des NMDA-Rezeptors untersucht werden. Dabei zeigte sich durch das C6-konditionierte Medium eine deutliche Zunahme der Motilit{\"a}t. Diese verst{\"a}rkte Motilit{\"a}t konnte durch den NMDA-Rezeptor-Antagonisten MK801 verhindert werden. Trotz Analyse einiger an der Proliferation und Migration beteiligter Botenstoffe wie VEGF und MMPs konnte keine Regulation dieser durch MK801 nachgewiesen werden.}, subject = {NMDA-Rezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Wilhelm2018, author = {Wilhelm, Christian}, title = {Die Rolle von Chronophin bei Schlaganfall-induziertem Funktionsverlust der Blut-Hirn-Schranke}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-163877}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Der isch{\"a}mische Schlaganfall ist mit einer j{\"a}hrlichen Inzidenz von 200/100 000 Einwohnern die h{\"a}ufigste Gef{\"a}ßerkrankung in Deutschland. Atherothrombose, arterielle Hypertonie und Embolien unterschiedlichen Ursprungs sind die wesentlichen Ursachen des isch{\"a}mischen Schlaganfalls. Die neurologischen Defizite nach einem Schlaganfall resultieren aus einem gest{\"o}rten zerebralen Blutfluss und somit einer insuffizienten Sauerstoffversorgung. Zus{\"a}tzlich ist die {\"O}dembildung, welche von einer gesteigerten Permeabilit{\"a}t der Blut-Hirn-Schranke verursacht wird, am neuronalen Zelltod beteiligt. Chronophin ist eine Aktinzytoskelett-regulierende Serin-Phosphatase. In einem isch{\"a}mischen Schlaganfall-Modell konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass der globale Verlust von Chronophin zu einer vermehrten {\"O}dembildung und einem aggravierten neurologischen Zustand der M{\"a}use im Vergleich zu wildtypischen Kontrollen f{\"u}hrte. Hirnlysate von wildtypischen M{\"a}usen zeigten verringerte Chronophin-Level in der vom Schlaganfall betroffenen Hemisph{\"a}re. Jedoch konnten initiale immunhistochemische und zellbiologische Untersuchungen weder Chronophin-abh{\"a}ngige Ver{\"a}nderungen der Blut-Hirn-Schranke feststellen noch einen zerebralen Zelltyp identifizieren, der f{\"u}r den sch{\"u}tzenden Effekt von Chronophin verantwortlich ist. Diese Ergebnisse weisen auf einen komplexen, vielzelligen Mechanismus hin, dem die sch{\"u}tzende Rolle von Chronophin im isch{\"a}mischen Schlaganfall unterliegt. Die Entschl{\"u}sselung dieses Mechanismus ist Aufgabe k{\"u}nftiger Untersuchungen.}, subject = {Schlaganfall}, language = {de} } @phdthesis{Koenig2017, author = {K{\"o}nig, Anna}, title = {Die Wirkung von microRNA-132 und microRNA-212 auf Zielgene an der Blut-Hirn-Schranke bei Glucose- und Sauerstoffentzug}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-153446}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2017}, abstract = {Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bildet eine Barriere, die das ZNS vor dem Einfluss der Substanzen aus der Peripherie sch{\"u}tzt. Die Aufrechterhaltung dieser wichtigen Struktur ist f{\"u}r die Hom{\"o}ostase und Vermeidung von Sch{\"a}den im ZNS von besonderer Bedeutung. Eine h{\"a}ufige Ursache f{\"u}r die Sch{\"a}digung der BHS ist der isch{\"a}mische Schlaganfall. In der Hypoxie werden zahlreiche Proteine degradiert oder von den Zellkontakten delokalisiert, die f{\"u}r die Integrit{\"a}t der Zell-Zell-Kontakte eine wichtige Rolle spielen. Als Folge resultiert eine Destabilisierung der BHS mit vermehrtem Durchstrom von ZNS-sch{\"a}digenden Substanzen. Seit der Entdeckung von miRNAs (Lee et al., 1993) konnte deren Rolle vor allem in der Entstehung von Tumoren und Entz{\"u}ndungen nachgewiesen werden. In der Arbeitsgruppe F{\"o}rster wurde eine vermehrte Expression von miRNA-132 und miRNA-212 nach OGD festgestellt. Als Zielgene von miRNA-132/212 konnten Cldn1, Tjap1, MMP9 und Jam3 detektiert werden. Die Validierungsversuche wurden an einem etablierten In-vitro-Modell der BHS bestehend aus murinen cerebralen Hirnendothelzellen (cEND-2) durchgef{\"u}hrt. Zu Beginn wurden die Bedingungen zur Kultivierung der Zellen unter Hypoxie und ohne Glucose (eng. oxygen glucose deprivation, OGD) mit und ohne Astrozyten-konditioniertem Medium etabliert. Expression von diversen Genen, die bekannt sind eine Rolle in der OGD zu spielen, wurden mittels qPCR ermittelt. Dabei kam es zu signifikanten Ver{\"a}nderungen der Genexpression von wichtigen Genen in der BHS, die besonders in Kombination mit Astrozyten-konditioniertem Medium noch verst{\"a}rkt werden konnten. So wurde die Kultivierung der Zellen f{\"u}r die weiteren OGD-Versuche in Astrozyten-konditioniertem Medium gew{\"a}hlt. Des Weiteren wurde die Regulation von miRNA-132/212 auf die Zielgene an der BHS untersucht. Die hemmende Wirkung der miRNAs auf die Genexpression der Zielgene konnte durch Transfektion von pre-miR-132/212 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt werden. In der OGD konnte durch Hemmung der vermehrt exprimierten miRNA-132/212 ein Anstieg der Zielgene beobachtet werden. Damit konnten sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Proteinebenen Cldn1, Tjap1, Jam3 und MMP9 als Zielgene best{\"a}tigt werden. Zus{\"a}tzlich wurden als funktionelle Tests eine TEER-Messung f{\"u}r den Widerstand und eine Permeabilit{\"a}tsmessung durchgef{\"u}hrt. Beide Tests best{\"a}tigten die Destabilisierung der BHS nach Transfektion von miRNA-132/212. Als therapeutische Implikation k{\"o}nnte durch Inhibition von miRNA-132/212 bei einer Minderperfusion des Gehirns die Barriere stabilisiert werden, was eine neue M{\"o}glichkeit in der Therapie des akuten Schlaganfalls bietet.}, subject = {Transfektion}, language = {de} } @phdthesis{AppeltMenzel2016, author = {Appelt-Menzel, Antje}, title = {Etablierung und Qualifizierung eines humanen Blut-Hirn-Schranken-Modells unter Verwendung von induziert pluripotenten und multipotenten Stammzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-134646}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellul{\"a}ren Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskul{\"a}re Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005). Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Haupts{\"a}chlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Hom{\"o}ostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch f{\"u}r die Versorgung der Neuronen mit N{\"a}hrstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zur{\"u}ck ins Blut verantwortlich. F{\"u}r die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegen{\"u}ber Substanzen und die hohe metabolische Aktivit{\"a}t der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu {\"u}berwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschr{\"a}nkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen. Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie pr{\"a}klinischen Forschung f{\"u}r Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellul{\"a}ren in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verf{\"u}gen meist {\"u}ber eine geringe Barriereintegrit{\"a}t, erfasst {\"u}ber transendotheliale elektrische Widerst{\"a}nde (TEER) unter 150 · cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte von mehr als 1500 · cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die Verf{\"u}gbarkeit humaner prim{\"a}rer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen k{\"o}nnen z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt ver{\"a}ndert sind, was die Eigenschaften der BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann. Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren Bedingungen bereitzustellen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A) zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde, erm{\"o}glicht eine gr{\"o}ßere r{\"a}umliche und zeitliche Flexibilit{\"a}t beim Arbeiten mit den stammzellbasierten Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs f{\"u}r den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt. Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestm{\"o}glich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren, wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf prim{\"a}ren Zellen, hiPSCs und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen. Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der neurovaskul{\"a}ren Einheit auf die Barriereintegrit{\"a}t und Genexpression des BHS-Endothels, konnten die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erh{\"o}hten TEER-Werte von bis zu 2500 · cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter Transporter und TJ-Molek{\"u}le gegen{\"u}ber den Monokulturen, wurden diese Modelle f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Studien ausgew{\"a}hlt. Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-{\"a}hnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin, Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Neben der Begrenzung der parazellul{\"a}ren Permeabilit{\"a}t, welche {\"u}ber die geringe Permeation von FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die BHS ebenfalls eine Barriere f{\"u}r den transzellul{\"a}ren Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung der Modelle hinsichtlich der Qualifikation f{\"u}r die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgef{\"u}hrt. Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten: Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac werden mit einer mittleren Geschwindigkeit {\"u}ber die BHS transportiert und Loratadin sowie Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen wurde diese Reihenfolge best{\"a}tigt, lediglich f{\"u}r Koffein wurde ein signifikant niedrigerer Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt. Der Einsatz der hiPSC-Technologie erm{\"o}glicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und f{\"u}r gezielte Anwendungen bereitzustellen. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens f{\"u}r diese Zwecke konstruierten R{\"u}hrreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen erm{\"o}glicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten denkbar. Die in dieser Arbeit pr{\"a}sentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro- Quadrupelmodels der humanen BHS, welches {\"u}ber in vivo-{\"a}hnliche Eigenschaften verf{\"u}gt. Die Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilit{\"a}t von Referenzsubstanzen einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolek{\"u}len sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erf{\"u}llt. Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie f{\"u}r die Entwicklung von Medikamenten eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle k{\"o}nnen hier in der pr{\"a}klinischen Forschung genutzt werden, um Toxizit{\"a}ts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuf{\"u}hren und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu erm{\"o}glichen oder Mechanismen zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu {\"u}berwinden.}, subject = {Blut-Hirn-Schranke}, language = {de} } @phdthesis{Heydenreich2013, author = {Heydenreich, Nadine}, title = {Studies on the contact-kinin system and macrophage activation in experimental focal cerebral ischemia}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-94534}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Traditionally, ischemic stroke has been regarded as the mere consequence of cessation of cerebral blood flow, e.g. due to the thromboembolic occlusion of a major brain supplying vessel. However, the simple restoration of blood flow via thrombolysis and/or mechanical recanalization alone often does not guarantee a good functional outcome. It appears that secondary detrimental processes are triggered by hypoxia and reoxygenation, which are referred to as ischemia/reperfusion (I/R) injury. During recent years it became evident that, beside thrombosis inflammation and edema formation are key players in the pathophysiology of cerebral ischemia. The contact-kinin system represents an interface between thrombotic, inflammatory and edematous circuits. It connects the intrinsic coagulation pathway with the plasma kallikrein-kinin system (KKS) via coagulation factor FXII. The serine protease inhibitor C1-inhibitor (C1-INH) has a wide spectrum of inhibitory activities and counteracts activation of the contact-kinin system at multiple levels. The first part of the thesis aimed to multimodally interfere with infarct development by C1-INH and to analyze modes of actions of human plasma derived C1-INH Berinert® P in a murine model of focal cerebral ischemia. It was shown that C57BL/6 mice following early application of 15.0 units (U) C1-INH, but not 7.5 U developed reduced brain infarctions by ~60\% and less neurological deficits in the model of transient occlusion of the middle cerebral artery (tMCAO). This protective effect was preserved at more advanced stages of infarction (day 7), without increasing the risk of intracerebral bleeding or affecting normal hemostasis. Less neurological deficits could also be observed with delayed C1-INH treatment, whereas no improvement was achieved in the model of permanent MCAO (pMCAO). Blood-brain-barrier (BBB) damage, inflammation and thrombosis were significantly improved following 15.0 U C1-INH application early after onset of ischemia. Based on its strong antiedematous, antiinflammatory and antithrombotic properties C1-INH constitutes a multifaceted therapeutic compound that protects from ischemic neurodegeneration in 'clinically meaningful' settings. The second part of the thesis addresses the still elusive functional role of macrophages in the early phase of stroke, especially the role of the macrophage-specific adhesion molecule sialoadhesin (Sn). For the first time, sialoadhesin null (Sn-/-) mice, homozygous deficient for Sn on macrophages were subjected to tMCAO to assess the clinical outcome. Neurological and motor function was significantly improved in Sn-/- mice on day 1 after ischemic stroke compared with wildtype (Sn+/+) animals. These clinical improvements were clearly detectable even on day 3 following tMCAO. Infarctions on day 1 were roughly the same size as in Sn+/+ mice and did not grow until day 3. No intracerebral bleeding could be detected at any time point of data acquisition. Twenty four hours after ischemia a strong induction of Sn was detectable in Sn+/+ mice, which was previously observed only on perivascular macrophages in the normal brain. Deletion of Sn on macrophages resulted in less disturbance of the BBB and a reduced number of CD11b+ (specific marker for macrophages/microglia) cells, which, however, was not associated with altered expression levels of inflammatory cytokines. To further analyze the function of macrophages following stroke this thesis took advantage of LysM-Cre+/-/IKK2-/- mice bearing a nuclear factor (NF)-ϰB activation defect in the myeloid lineage, including macrophages. Consequently, macrophages were not able to synthesize inflammatory cytokines under the control of NF-ϰB. Surprisingly, infarct sizes and neurological deficits upon tMCAO were roughly the same in conditional knockout mice and respective wildtype littermates. These findings provide evidence that macrophages do not contribute to tissue damage and neurological deficits, at least, not by release of inflammatory cytokines in the early phase of cerebral ischemia. In contrast, Sn which is initially expressed on perivascular macrophages and upregulated on macrophages/microglia within the parenchyma following stroke, influenced functional outcome.}, subject = {Blut-Hirn-Schranke}, language = {en} } @phdthesis{Hagedorn2011, author = {Hagedorn, Ina}, title = {Novel mechanisms underlying arterial thrombus formation: in vivo studies in (genetically modified) mice}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85752}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Thrombus formation at sites of vascular lesions is a dynamic process that requires a defined series of molecular events including the action of platelet adhesion/activation receptors, intracellular signal transduction, cytoskeletal rearrangements and activation of plasma coagulation factors. This process is essential to limit post-traumatic blood loss but may also contribute to acute thrombotic diseases such as myocardial infarction and stroke. With the help of genetically modified mice and the use of specific protein inhibitors and receptordepleting antibodies, the work presented in this thesis identified novel mechanisms underlying thrombus formation in hemostasis and thrombosis. In the first part of the study, it was shown that von Willebrand Factor (vWF) binding to glycoprotein (GP)Iba is critical for the formation of stable pathological thrombi at high shear rates, suggesting GPIba as an attractive pharmacological target for antithrombotic therapy. The subsequent analysis of recently generated phospholipase (PL)D1-deficient mice identified this enzyme, whose role in platelet function had been largely unknown, as a potential target protein downstream of GPIba. This was based on the finding that PLD1- deficient mice displayed severely defective GPIba-dependent thrombus stabilization under high shear conditions in vitro and in vivo without affecting normal hemostasis. The second part of the thesis characterizes the functional relevance of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-bearing collagen receptor GPVI and the recently identified hemITAM-coupled C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) for in vivo thrombus formation. Genetic- and antibody-induced GPVI deficiency was found to similarly protect mice from arterial vessel occlusion in three different thrombosis models. These results confirmed GPVI as a promising antithrombotic target and revealed that antibody-treatment had no obvious off-target effects on platelet function. Similarly, immunodepletion of CLEC-2 by treating mice with the specific antibody INU1 resulted in markedly impaired thrombus growth and stabilization under flow in vitro and in vivo. Furthermore, it could be demonstrated that double-immunodepletion of GPVI and CLEC-2 resulted in severely decreased arterial thrombus formation accompanied by dramatically prolonged bleeding times. These data revealed an unexpected redundant function of the two receptors for in vivo thrombus formation and might have important implications for the potential development of anti-GPVI and anti-CLEC-2 antithrombotic agents. The third part of the thesis provides the first functional analysis of megakaryocyte- and platelet-specific RhoA knockout mice. RhoA-deficient mice displayed a defined signaling defect in platelet activation, leading to a profound protection from arterial thrombosis andand ischemic brain infarction, but at the same time also strongly increased bleeding times. These findings identified the GTPase as an important player for thrombus formation in hemostasis and thrombosis. Based on the previous proposal that the coagulation factor (F)XII might represent an ideal target for safe antithrombotic therapy without causing bleeding side effects, the last part of this thesis assesses the antithrombotic potential of the newly generated FXIIa inhibitor rHAInfestin- 4. It was found that rHA-Infestin-4 injection into mice resulted in virtually abolished arterial thrombus formation but no change in bleeding times. Moreover, rHA-Infestin-4 was similarly efficient in a murine model of ischemic stroke, suggesting that the inhibitor might be a promising agent for effective and safe therapy of cardio- and cerebrovascular diseases.}, subject = {Thrombus}, language = {en} } @phdthesis{Wais2012, author = {Wais, Sebastian}, title = {Die Rolle der Glukosetransporter an der Blut-Hirn-Schranke nach einem Sch{\"a}del-Hirn-Trauma und deren eventueller Einfluss auf die Entwicklung eines sekund{\"a}ren Hirn{\"o}dems}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78998}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) waren in Deutschland 2006 akute isch{\"a}mische Ereignisse des Zentralen Nervensystems (ZNS) die f{\"u}nfth{\"a}ufigste Todesursache. Zu diesen isch{\"a}mischen Ereignissen z{\"a}hlen Schlaganfall, Kardiopulmonale Reanimation, traumatische Hirnverletzungen, sowie perioperative isch{\"a}mische Komplikationen. Aufgrund der schwerwiegenden Folgen, die ein Verlust von Nervenzellen f{\"u}r den Patienten bedeutet, muss die weitere medizinische Akutversorgung den sekund{\"a}ren neuronalen Schaden verhindern oder ihn reduzieren. Vor dieser Arbeit konnten Glukosetransporter-1 (GLUT-1) und Natrium-Glukose-Kotransporter-1 (SGLT1) an der Blut-Hirn-Schranke (BHS) identifiziert werden. Ziel dieser Arbeit war es, das Expressionsverhalten der Glukosetransporter nach einem Sch{\"a}del-Hirn-Trauma (SHT) in vivo und in vitro zu untersuchen, um so den Einfluss und die funktionellen Folgen durch die ver{\"a}nderte Expression der zerebralen Glukosetransporter in der BHS infolge eines SHT zu identifizieren und deren eventuellen Einfluss auf die Entwicklung eines sekund{\"a}ren Hirn{\"o}dems zu erkennen. Hierf{\"u}r wurde als in vivo-Modell das Controlled Cortical Impact Injury (CCII) gew{\"a}hlt, da bei diesem Tierversuchsmodell die Aspekte der traumatischen Kontusion und die damit verbundenen intraparenchymalen Blutungen durch ein epidurales oder subdurales H{\"a}matom im Vordergrund stehen. Es wurden Gehirnschnitte zu fest definierten Zeitpunkten angefertigt (kein CCII (Kontrolle), 15 Minuten {\"U}berleben nach CCII (Prim{\"a}rschaden), 24 Stunden {\"U}berleben nach CCII und 72 Stunden {\"U}berleben nach CCII). Die Darstellung des prim{\"a}ren Schadens im M{\"a}usehirn erfolgte durch die Immunfluoreszenzmikroskopie. Um einen Gewebeschaden, wie es bei einem Hirntrauma der Fall ist, in vitro zu simulieren, wurde das Modell des Sauerstoff-Glukose-Entzuges (OGD) gew{\"a}hlt, da es bei diesem Modell neben einer Nekrose auch zur Apoptose der Nervenzellen kommt, welche ebenfalls bei einem SHT stattfindet. Als geeignetes Zellkulturmodell wurde die cerebralen Endothelzelllinie (cEND) gew{\"a}hlt. Bei dieser Zelllinie handelte es sich um eine Hirnendothelzelllinie aus der Maus. In den in vivo-Versuchen konnte bei GLUT-1 bereits 15 Minuten nach CCII eine gesteigerte Expression festgestellt werden. Dennoch verminderte GLUT-1 im weiteren Verlauf seine Expression auf ein Minimum, welches unterhalb des Ausgangswertes lag. SGLT1, der auch in der BHS identifiziert wurde, reagierte auf einen Prim{\"a}rschaden erst in den Hirnschnitten, die 24 Stunden nach CCI behandelt wurden. In den Hirnschnitten, die 15 Minuten nach CCII behandelt wurden, ver{\"a}nderte sich die SGLT1-Expression zun{\"a}chst nicht. Erst 24 Stunden nach CCII konnte eine gesteigerte Expression von SGLT1 erkannt werden, die aber bei 72 Stunden nach CCII wieder abgenommen hatte. Ein weiterer Glukosetransporter konnte erstmals in der BHS identifiziert werden. SGLT2 zeigte erst 72 Stunden nach CCII eine gesteigerte Expression, in den Hirnschnitten ohne CCII, 15 Minuten nach CCII und 24 Stunden nach CCII konnte keine Ver{\"a}nderung der SGLT2-Expression festgestellt werden. Diese Expressionsreaktion, besonders der Expressions-H{\"o}hepunkt der einzelnen Glukosetransporter, konnte auch in vitro gezeigt werden. Besonders die Identifizierung von SGLT2 in der BHS und die generelle Steigerung der Expressionsrate von GLUT-1, SGLT1 und SGLT2 k{\"o}nnte neue Ansatzpunkte in der Pathophysiologie des diffusen Hirn{\"o}dems nach einem SHT ergeben. Die genaue Rolle der Natriumgekoppelten Glukosetransporter in der BHS muss noch weiter erforscht werden. Best{\"a}tigen weitere Versuche eine zentrale Rolle der SGLTs bei der Entstehung des sekund{\"a}ren Hirnschadens, speziell SGLT2, als hochpotenter Glukosetransporter, so k{\"o}nnte {\"u}ber neue Therapien nachgedacht werden, durch welche spezifisch die Expression der SGLTs, besonders SGLT2, wie es bei Dapagliflozin, Canagliflozin oder Ipragliflozin der Fall w{\"a}re, unterdr{\"u}cken w{\"u}rden.}, subject = {Hirn{\"o}dem}, language = {de} } @phdthesis{Heinen2011, author = {Heinen, Florian}, title = {Einfluss von Neisseria meningitidis auf Tight-Junctions in humanen mikrovaskul{\"a}ren Hirnendothelzellen (HBMEC)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71631}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Neisseria meningitidis ist mit jahrlich etwa 700.000 Erkrankungsfallen weltweit und einer Mortalitat von circa 7\% einer der h{\"a}ufigsten Ausloser der bakteriellen Hirnhautentz{\"u}ndung. Der entscheidende Schritt zur Auslosung einer Meningitis ist die Uberwindung der Blut-Hirn-Schranke. Diese im menschlichen Korper einmalig dichte Barriere wird maßgeblich durch Tight-Junctions spezialisierter Endothelzellen der Hirnkapillaren aufrecht erhalten. Ob N. Meningitidis diese Barriere auf einem parazellul{\"a}ren oder transzellul{\"a}rem Weg uberwindet, ist nicht vollstandig geklart. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von N. meningitidis auf die Tight-Junction Proteine Occludin und ZO-1 unter Nutzung des HBMEC Zellkulurmodelles untersucht. Neben einer verminderten Genexpression von Occludin zeigte sich dabei eine Abspaltung eines 50 kDa Fragmentes von Occludin. Gleichzeitig konnte eine Umverteilung von Occludin von den Zellgrenzen in das Zytoplasma beobachtet werden. ZO-1 hingegen wurde weder in seiner Exprimierung, noch in seiner intrazellularen Verteilung beeinflusst. Mittels eines in dieser Arbeit etablierten Assays zur Bestimmung der Permeabilitat eines HBMEC-Monolayer als vereinfachtes in-vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke konnte bestatigt werden, dass durch die Beeinflussung von Tight-Junction Proteinen die parazellulare Permeabilitat steigt. In weiteren Analysen konnten diese Prozesse auf eine gesteigerte Aktivitat von Matrixmetalloproteinase 8 zur{\"u}ckgefuhrt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen neuen Mechanismus auf, durch den N. meningitidis im Stande ist, die-Hinr-Schranke auf einem parazellul{\"a}rem Weg zu {\"u}berwinden.}, subject = {Neisseria meningitidis}, language = {de} } @phdthesis{Raslan2011, author = {Raslan, Furat}, title = {Pathomechanismen und Therapie der Kallikrein-Kinin-System vermittelten Hirn{\"o}dembildung nach Neurotrauma}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71407}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {In einem experimentellen Sch{\"a}del-Hirn-Trauma-Modell der fokalen K{\"a}ltel{\"a}sion bei der Maus wurde die Effektivit{\"a}t der B1R-Blockade untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchung dokumentierten auf der Suche nach einer grundlegenden spezifischen Therapie des vasogenen traumatischen Hirn{\"o}dems die B1R-Blockade als einen potentiellen Ansatz zu Reduktion der sekund{\"a}ren Hirn-sch{\"a}den. Zum Einen konnte durch die selektive Blockade von B1R mit dem Pr{\"a}parat R-715 nach einer fokalen K{\"a}ltel{\"a}sion im Mausmodell die Hirnsch{\"a}digung um etwa 75 \% gegen{\"u}ber den Tieren der Kontrollgruppen reduziert werden. Zum Anderen l{\"a}sst sich nach der B1R-Blockade u. a. eine signifikante Abschw{\"a}chung des vasogenen Hirn{\"o}dems um etwa 50 \% im Vergleich zu den Tieren der Kontrollgruppen feststellen. Die Reduktion der sekund{\"a}ren Hirnsch{\"a}digung durch die B1R-Blockade 24 Stunden nach der L{\"a}sionsinduktion macht die selektive B1R-Blockade als kausaler Therapie-ansatz eine interessante Behandlungsoption des posttraumatischen vasogenen Hirn{\"o}dems.}, subject = {Sch{\"a}del-Hirn-Trauma}, language = {de} } @phdthesis{Dreiseitel2011, author = {Dreiseitel, Andrea}, title = {In vitro bioactivities of dietary anthocyanins and proanthocyanidins: implications for bioavailability, neuroprotection and safety}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57550}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Over the past decades, awareness has increased of multiple health-promoting effects of diets rich in anthocyanins and proanthocyanidins and, specifically, of these compounds' potential for conferring neuroprotection. The present study compiles evidence obtained in vitro that expands our understanding of anthocyanin and proanthocyanidin functionalities at multiple levels. Firstly, anthocyanin and anthocyanidin bioavailability was addressed using a combination of ATPase assays, dye extrusion assays and vesicular transport assays. This approach highlights the contribution made by efflux transporters MDR1 and BCRP to the absorption of berry polyphenols and to their distribution to target tissues including the central nervous system. All test compounds interacted with the BCRP transporter in vitro, seven emerged as potential BCRP substrates and 12 as potential inhibitors of BCRP. Two anthocyanidins, malvidin and petunidin, exhibited bimodal activities, serving as BCRP substrates at low micromolar concentrations and, at higher concentrations, as BCRP inhibitors. Effects on MDR1, in contrast, were weak, as only aglycones exerted mild inhibitory activity in the high micromolar range. Distinct affinities of several anthocyanins and the respective aglycones for BCRP suggest that they may be actively transported out of endothelia. Agents that interfere with BCRP activity are therefore likely to facilitate crossing of the intestinal and blood-brain barriers and to augment anthocyanin bioavailability. Secondly, novel modes of action were sought to rationalize berry polyphenols' direct modulation of neuronal transmission as opposed to their non-specific antioxidant activities. The candidate effectors include cellular monoamine oxidases (MAO) A and B, hypoxia inducible factor (HIF), the proteasome, and phospholipase A2 (PLA2). Elevated MAO activity has long been implicated in the etiology of depression, anxiety and neurodegenerative illness. MAO inhibiting compounds may thus hold promise in the prevention of behavioral symptoms and cognitive decline. For both MAO isoforms, inhibitory effects of anthocyanins and anthocyanidins are illustrated by IC50 values in the low micromolar range whereas proanthocyanidins and phenolic metabolites were less effective inhibitors. Kinetic analyses, performed with cyanidin and cyanidin-3-glucoside, indicated a competitive interaction of cyanidin in terms of MAO A, plus a mixed competitive and non-competitive mode of interaction of cyanidin in terms of MAO B as well as of cyanidin-3-glucoside with respect to both enzyme isoforms. Thus MAO inhibition by anthocyanins and their aglycones in vitro lends support to central nervous functionalities of diets rich in berry polyphenols and opens new opportunities in the prevention of neuronal pathologies. Effects on HIF expression were examined to assess candidate compounds' role in enhancing cellular resistance to oxidative stress. By inducing a dose-dependent increase in HIF expression, delphinidin may initiate a variety of cellular survival processes that are inhibited by free iron. This finding argues in favor of iron-chelating properties as a further means of mediating neuroprotection. Other inducers of HIF expression in neuroblastoma cells included gallic acid, cyanidin and bilberry extract, all of which may modulate HIF-dependent transcription of downstream genes.}, subject = {Anthocyane}, language = {en} } @phdthesis{Blecharz2009, author = {Blecharz, Kinga Grażyna}, title = {Molekulare Ziele der Glukokortikoidbehandlung unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen in einem in vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57256}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die Integrit{\"a}t der Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist bei vielen Erkrankungen des humanen zentralen Nervensystems (ZNS) beeintr{\"a}chtigt. Unter verschiedenen neuroinflammatorischen Bedingungen, wie bei zerebralen Isch{\"a}mien, Traumata, Hirntumoren oder der Multiplen Sklerose (MS), kommt es zum Verlust der protektiven Schrankenfunktion. Zu den ersten Anzeichen des BHS-Zusammenbruchs z{\"a}hlt der Verlust der Zell-Zell-Adh{\"a}sion: der Adh{\"a}rens- und Occludenskontakte. Therapeutische Maßnahmen dieser Krankheiten beinhalten Behandlungen mit Glukokortikoiden (GCs), wobei der Mechanismus und die Wirkungsweise dieser Substanzen bis heute nicht vollkommen aufgekl{\"a}rt sind. In der zerebralen Hirnendothelzelllinie cEND [Forster C, Silwedel C, Golenhofen N, Burek M, Kietz S, Mankertz J \& Drenckhahn D. (2005). Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J Physiol 565, 475-486] wurde eine Funktionsverbesserung der Endothelbarriere durch die Expressionerh{\"o}hung von Occludin nach GC-Behandlung bereits analysiert. Daraufhin wurden andere Kandidaten des apikalen Junktionssystems gesucht, die positiv auf GC-Gabe ansprechen. Der erste Teil der Arbeit pr{\"a}sentiert den positiven Einfluss der Dexamethason-Behandlung auf die Expression des Adh{\"a}renskontakt-Proteins VE- (Vascular-Endothelial) Cadherin in cEND-Zellen. Dabei wurde eine Reorganisation des Zytoskeletts, eine verst{\"a}rkte Verankerung des VE-Cadherins an das Zytoskelett, sowie eine einhergehende Morphologie{\"a}nderung der behandelten Zellen beobachtet. Untersuchungen der Transkriptionsaktivierung des VE-Cadherin-Promoters nach Dexamethason-Behandlung, wiesen auf einen indirekten Steroid-Effekt hin, der zu einer Erh{\"o}hung der VE-Cadherin-Proteinsynthese f{\"u}hrte. Somit sind GCs wichtig f{\"u}r die Proteinsynthese und -organisation beider Kontaktproteinarten: der Adh{\"a}rens- und Occludenskontakte in mikrovaskul{\"a}ren Hirnendothelzellen. Die Beeintr{\"a}chtigung der BHS-Integrit{\"a}t mit Ver{\"a}nderungen der Occludenskontaktexpression z{\"a}hlt zu den fr{\"u}hen Ereignissen bei der Entstehung einer Inflammation des ZNS, wie beispielsweise bei der MS. Im zweiten Teil der Dissertation wurde die Herunterregulation von Occludenskontaktproteinen in der cEND-Zelllinie untersucht. Dabei wurden cEND-Zellen mit Seren von Patienten, die sich in zwei verschiedenen Stadien der MS befanden, behandelt: in der akuten Exazerbationsphase oder der Remissionsphase, und auf die Protein- und Genexpression mit und ohne Dexamethasons-Behandlung untersucht. Es konnte ein negativer Effekt auf den Barrierewiderstand und die Occludenskontaktexpression, sowie eine erh{\"o}hte MMP-9-Genexpression nach Krankheitssereninkubation gezeigt werden. Die Dexamethason-Behandlung ergab eine geringe, aber keine vollst{\"a}ndige Rekonstitution der Barrierefunktion. Anhand dieser Studie konnte jedoch erstmals eine Erniedrigung der Protein- und mRNA-Synthese von Claudin-5 und Occludin in Remissionspatientenseren inkubierten cEND-Zellen demonstriert werden. Somit k{\"o}nnten diese Erkenntnisse zur Pr{\"a}diagnose einer bevorstehenden Exazerbationsphase der MS eingesetzt werden. Eine Langzeit-GC-Behandlung f{\"u}hrt zu zahlreichen Nebenwirkungen, u. a. zum Bluthochdruck, welcher aufgrund einer eingeschr{\"a}nkten Produktion des vasodilatativen Faktors Stickstoffmonoxid, NO, im myokardialen Endothel hervorgerufen wird. Ver{\"a}nderungen in der NO-Produktion, wie auch anderer Faktoren der NO-Signalkaskade in der myokardialen Endothelzelllinie MyEND unter Einfluss von Dexamethason standen im Zentrum des dritten Teils dieser Arbeit. W{\"a}hrend keine Ver{\"a}nderungen in der Expression der endothelialen NO-Synthase, eNOS, nach GC-Behandlung gezeigt werden konnten, wurden repressive Einfl{\"u}sse von Dexamethason auf die Enzymaktivit{\"a}t der eNOS in MyEND-Zellen untersucht. GC-Gabe f{\"u}hrte zur einer herabgesetzten Synthese des essenziellen Co-Faktors der eNOS, des Tetrahydrobiopterins, BH4, sowie zu einer Herunterregulation der GTP-Cyclohydrolase-1 (GTPCH-1), des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms der BH4-Produktion. Im Gegensatz zu bisherigen Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, konnte in der vorliegenden Studie belegt werden, dass die Herunterregulation der GTPCH-1 mRNA-Level auf den Liganden-abh{\"a}ngigen proteasomalen Abbau des Glukokortikoid-Rezeptors (GR) zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Das 26S-Proteasom moduliert die GR-abh{\"a}ngige Genexpression durch Kontrolle des Umsatzes und des Recyclings des Rezeptors selbst, wodurch eine regulierte Hormonresponsivit{\"a}t gew{\"a}hrleistet wird. Die Aufhebung des Liganden-abh{\"a}ngigen Abbaus des GR-Proteins durch gezielte Proteasominhibition, sowie durch eine {\"U}berexpression des ubiquitinylierungsdefekten GR-Konstruktes, K426A-GR, in Dexamethason-behandelten MyEND-Zellen resultierte in einer Erh{\"o}hung der GTPCH-1-Expression, sowie einer gesteigerten eNOS-Aktivit{\"a}t. Die hier beschriebenen Ergebnisse erlauben einen innovativen Einblick in die Erkenntnisse zur GC-vemittelten Hypertonie. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass GC-Behandlungen von mikrovaskul{\"a}ren Hirnendothelzellen zu einer Stabilisierung der Endothelbarriere f{\"u}hren. Unter pathologischen Bedingungen, wie der MS, wird der protektive GC-Effekt durch andere Faktoren beeintr{\"a}chtigt}, subject = {Blut-Hirn-Schranke}, language = {de} } @phdthesis{Harke2009, author = {Harke, Nina Natascha}, title = {Untersuchungen zum Genexpressionsmechanismus der Glukokortikoidvermittelten Occludin-Induktion an der Blut-Hirn-Schranke}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56689}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die Blut-Hirn-Schranke wird haupts{\"a}chlich vom Endothel der Hirngef{\"a}ße gebildet und stellt die wichtigste Barriere zwischen Blutkompartiment und Hirnparenchym dar. Hauptverantwortlich f{\"u}r die Barrierefunktion der Gehirnkapillaren sind die Tight Junctions, die den Interzellularspalt des Endothels verschließen und dadurch die parazellul{\"a}re Permeabilit{\"a}t hydrophiler Molek{\"u}le und Ionen regulieren und einen hohen elektrischen Widerstand aufbauen. Das 65 kDa Transmembranprotein Occludin ist ein zentrales Element der Tight Junctions: Eine Induktion von Occludin f{\"u}hrt zur Erh{\"o}hung der Barriereeigenschaften, w{\"a}hrend eine Erniedrigung des Occludin-Gehaltes zu einer verst{\"a}rkten Kapillardurchl{\"a}ssigkeit und potenziell zu einer Sch{\"a}digung des Hirngewebes f{\"u}hrt. Im klinischen Alltag werden bereits seit vierzig Jahren Kortikosteroide bei Erkrankungen mit gesch{\"a}digter Blut-Hirn-Schranke erfolgreich eingesetzt. Auch experimentell konnte im hiesigen Labor durch die Arbeitsgruppe von Prof. F{\"o}rster eine Transaktivierung von Occludin durch Glukokortikoide wie Dexamethason nachgewiesen werden. Die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen der Occludintransaktivierung blieben weitgehend unbekannt, insbesondere die Frage, ob die Geninduktion {\"u}ber direkte Zielgentransaktivierung oder {\"u}ber eine Protein-Protein-Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren erfolgt. Das Vorhandensein putativer Glukokortikoid-responsiver Elemente innerhalb des Occludin-Promoters war ebenso noch nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte dargestellt werden, dass f{\"u}r die erh{\"o}hte Occludin-Expression in Endothelzellen von Hirngef{\"a}ßen durch Glukokortikoide ein funktioneller Glukokortikoid-Rezeptor als Homodimer n{\"o}tig war. In den Experimenten wurden die jeweiligen Transaktivierungsniveaus des Occludin-Promoters durch einen Luciferase-Promoter-Reporter-Assay verglichen. Es wurden zum einen der Wildtyp-Glukokortikoidrezeptor, zum anderen ein mutagenisierter Rezeptor eingesetzt, dem die entscheidende Dimerisierungseigenschaft fehlt. Ohne die Ausbildung eines Rezeptor-Homodimers kann die Bindung an die Promoter-DNA nicht erfolgen. Im Vergleich zeigte sich, dass nur der Wildtyp-Glukokortikoidrezeptor zu einer erh{\"o}hten Genexpression f{\"u}hrte, der mutagenisierte Rezeptor zeigte keine Induktion. Zudem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine Bindungsstelle des Glukokortikoidrezeptors auf dem Occludin-Promoter identifiziert werden. Die Identifizierung des Glukokortikoid-responsiven Elements erfolgte durch Untersuchung der Glukokortikoid-Responsivit{\"a}t verschiedener Abschnitte des Occludin-Promoters. Auf zwei dieser Abschnitte fanden sich Gensequenzen, die der etablierten kanonischen Konsensussequenz und verschiedenen in der Literatur beschriebenen degenerierten Elementen entsprachen. Im Promoter-Reporter-Assay zeigte sich nur im distalen Promoterabschnitt eine erh{\"o}hte Occludin-Expression nach Glukokortikoid-Gabe. Dieses distale Element aus zwei Halbelementen (5'-ACATGTnnnnACAAAT-3') wurde durch Immunopr{\"a}zipitationsassays weiter eingegrenzt. Eine Mutagenisierung der Basenabfolge mit anschließend ausbleibender Transaktivierung und Immunopr{\"a}zipitation best{\"a}tigte die Funktionalit{\"a}t des Glukokortikoid-responsiven Elements. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals die direkte dimerisierungsabh{\"a}ngige Glukokortikoidrezeptor-vermittelte Induktion von Occludin nachgewiesen und ein neues degeneriertes Glukokortikoid-responsives Element identifiziert werden, das f{\"u}r die Transaktivierung des Occludingens essentiell ist.}, subject = {Occludin}, language = {de} } @phdthesis{Dittmar2008, author = {Dittmar, Sandra}, title = {Masernvirus-induzierte Blockade der transendothelialen Migration von Leukozyten und infektionsvermittelte Virusausbreitung durch Endothelzellschichten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35050}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Neben dem bekannten Tropismus des Masernvirus f{\"u}r CD150-positive aktivierte Zellen des Immunsystems, spielt der Endothelzelltropismus f{\"u}r die akute Masernviruserkrankung einschließlich ihren nachfolgenden Komplikationen eine wichtige pathogene Rolle. Die Infektion der Endothelzellen steht in Zusammenhang mit dem Auftreten des MV-Exanthems. Es ist auch m{\"o}glich, dass die „Akute Enzephalitits" und der Viruseintritt ins zentrale Nervensystem wie im Falle der subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) durch Endothelzellinfektion vermittelt wird. Ziel der Arbeit war herauszufinden, wie und ob das MV Endothelzellbarrieren {\"u}berwinden kann mittels Transport infizierter Leukozyten oder durch Infektion von EZs mit basolateraler Virusfreisetzung. Es wurde untersucht, ob die F{\"a}higkeit von prim{\"a}ren humanen T- Zellen durch polarisierte Zellschichten von „human brain microvascular endothelial cells" (HBMECs) zu wandern durch die Infektion beeinflusst wird. Die F{\"a}higkeit von infizierten Lymphozyten durch die Poren der Filter zu wandern war teilweise beeintr{\"a}chtigt, jedoch war das Ergebnis statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu war die F{\"a}higkeit der Zellen durch Endothelzellbarrieren zu wandern drastisch reduziert. Nach Infektion adh{\"a}rierten die Leukozyten st{\"a}rker auf den Endothelzellen. Bei dieser Adh{\"a}sion von PBMCs an Endothelzellen kam es trotz Infektion zur Ausbildung von sogenannten „transmigratory cups" oder docking- Strukturen. Dieser enge Zell-Zell-Kontakt hatte zur Folge, dass die MV-Infektion vom Lymphozyten auf die Endothelzelle {\"u}bertragen wurde. Die MV-H{\"u}llproteine wurden auf der apikalen und basolateralen Seite infizierter Endothelzellen exprimiert wie anhand von Aufnahmen mit dem konfokalen Mikroskop am Beispiel des H-Proteins gezeigt werden konnte. Titrationen ergaben, dass das Virus auf beiden Seiten der Zellen freigesetzt wurde. Desweiteren wurde best{\"a}tigt, dass auch f{\"u}r polarisierte Endothelzellen die auf Tyrosin basierenden Transportsignale verantwortlich sind f{\"u}r die basolaterale Virusfreisetzung. Die Daten unterst{\"u}tzen die Hypothese, dass das Virus mit Hilfe der Infektion und der bipolaren Virusfreisetzung {\"u}ber Endothelzellbarrieren}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Silwedel2008, author = {Silwedel, Christine}, title = {Charakterisierung immortalisierter Maus-Hirnendothelzelllinien als in vitro-Modelle der Blut-Hirn-Schranke}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34946}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Die Blut-Hirn-Schranke reguliert den Transport von Molek{\"u}len aus dem Blut in das Gehirn und aus dem Hirngewebe in das Blut. Die Grundlage dieser f{\"u}r den Erhalt der Hom{\"o}ostase im Gehirn wichtigen Schranke bilden zwischen Endothelzellen der Gehirnkapillaren (BCECs) entwickelte, besonders dichte Zonulae Occludentes (Tight Junctions). Viele Krankheiten, zum Beispiel die Multiple Sklerose, gehen mit einer Dysfunktion der BBB einher, die molekularen Grundlagen verschiedener St{\"o}rungen und damit die Therapiem{\"o}glichkeiten sind bisher jedoch oftmals noch unbekannt. Ein grundlegendes Problem der Forschung an der BBB war bislang das Fehlen eines geeigneten immortalisierten in vitro-Modelles zum Verst{\"a}ndnis der Differenzierung und Regulierung der Schrankenfunktion. Es gelang nun erstmals, aus murinen BCECs ein solches in vitro-Modell der BBB zu entwickeln, welches wichtige Charakteristika der BBB in vivo aufweist. Zu den Eigenschaften der BBB in vivo z{\"a}hlen allgemein ein hoher transendothelialer elektrischer Widerstand (TER) von bis zu 2000 \&\#61527; x cm², die Expression der TJ-Proteine Occludin, Claudin-1, Claudin-3 und Claudin-5 sowie eine geringe Rate transzellul{\"a}rer Transportvorg{\"a}nge. Die Entwicklung einer immortalisierten Zelllinie als in vitro-Modell der BBB beinhaltete das Bereitstellen einer m{\"o}glichst nat{\"u}rlichen Umgebung f{\"u}r die Endothelzellen. Durch Zugabe von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sowie Serumreduktion im Differenzierungsmedium konnte eine dichte Schrankenfunktion induziert werden, welche sich anhand von TER-Messungen nachweisen ließ. Mittels immuncytochemischen und molekularbiologischen Methoden wurde außerdem die Expression verschiedener TJ-Proteine in den immortalisierten BCECs gezeigt. Die Permeabilit{\"a}t der BBB wird durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst. So war zu erkennen, dass Glucocorticoide und Insulin die Barrierenfunktion der BBB induzieren und die Zugabe dieser Faktoren die in vitro-Kultivierung von BCECs erm{\"o}glicht, ohne dass diese dabei f{\"u}r die BBB in vivo wesentliche Charakteristika verlieren. Diese Ergebnisse stimmen {\"u}berein mit anderen Studien, denenzufolge f{\"u}r die Induktion und Aufrechterhaltung komplexer Tight Junctions bei kultivierten Endothelzellen Glucocorticoide f{\"o}rderlich sind. Auch klinisch wird dieser Einfluss von Glucocorticoiden bereits genutzt: so konnten im Falle der Multiplen Sklerose Therapieerfolge durch die Gabe von Corticosteroiden erzielt werden.}, subject = {Blut-Hirn-Schranke}, language = {de} } @phdthesis{Schmid2007, author = {Schmid, Harriet}, title = {Die Wirkung des Phosphodiesterase-IV-Inhibitors Mesopram auf Faktoren der Blut-Hirn-Schranke}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26345}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Multiple Sklerose ist eine chronisch degenerative Erkrankung des ZNS, deren Therapie-m{\"o}glichkeiten noch immer begrenzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro der selektive PDE-IV-Inhibitor Mesopram untersucht, welcher bereits in einer Phase II Studie bei Patienten mit klinisch gesicherter MS zum Einsatz kommt. Anhand von HBMEC's, die als ein Model der menschlichen BHS gelten, konnten TJ's (ZO-1, Claudin-3, Occludin), Adh{\"a}sionsmolek{\"u}le (ICAM, VCAM, MCAM), Zytokine und Chemokine (AR, Il-6, MCP-1, Il-8) und MMP-2 nachgewiesen werden. Diese Faktoren sind bei der Zerst{\"o}rung der BHS in der Pathologie der MS beteiligt. Die Idee dieser Arbeit war es, durch die spezifische PDE-IV-Inhibition mit Mesopram die untersuchten Faktoren der BHS so zu beeinflussen, dass eine weitere Permeabilit{\"a}tserh{\"o}hung verhindert werden k{\"o}nnte. Da es sich bei MS um eine inflammatorische Erkrankung handelt und TNF\&\#945; in MS-L{\"a}sionen gefunden wird, wurde in dieser Arbeit TNF\&\#945; als inflammatorischer Stimulus verwendet. Unter TNF\&\#945;-Stimulation wurden die meisten der genannten Faktoren vermehrt exprimiert. Keine Ver{\"a}nderung unter TNF\&\#945; zeigten Occludin, ZO-1, VCAM und MMP-2. Die HBMEC's wurden {\"u}ber 24 und 48 h mit TNF\&\#945; und Mesopram stimuliert. Es konnte in den unterschiedlichen Auswertungen (ELISA, FACS, Western Blot, Zymographie) keine regulatorische Modulation der verschiedenen Faktoren unter Mesopram-induzierter cAMP-Erh{\"o}hung nachgewiesen werden.}, subject = {Blut-Hirn-Schranke}, language = {de} } @phdthesis{Latsch2005, author = {Latsch, Kirsten}, title = {Interaktion von Neisseria meningitidis mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15131}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Ein zentrales Ereignis in der Pathogenese einer bakteriellen, durch Neisseria menigitidis verursachten Meningitis stellt die Interaktion der Bakterien mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke dar. In der vorliegenden Arbeit konnten in Infektionsversuchen mit immortalisierten HBMEC-Zellen als etabliertem in-vitro Modell des okklusiven menschlichen Hirnendothels und N. meningitidis Isolaten unterschiedlicher klonaler Linien Pathomechanismen f{\"u}r die Interaktion von Meningokokken mit dem Endothel der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke identifiziert werden. Diese unterscheiden sich von jenen Pathomechanismen, die die Interaktion von Meningokokken und Epithelzelllinien bzw. peripheren Endothelzellen bestimmen. Die untersuchten hypervirulenten klonalen Linien ST-32, ST-11 und ST-1 zeigen in-vivo signifikante Unterschiede in ihrem Ausbreitungsverhalten und meist unterschiedliche Krankheitsverl{\"a}ufe. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen vermuten, dass die molekularen Mechanismen der Adh{\"a}renz und Invasion von N. meningitidis Serogruppe A, B und C Isolaten in ihrer Abh{\"a}ngigkeit von Außenmembrankomponenten und externen Faktoren differieren. Die Invasion von Serogruppe B Meningokokken konnte in Infektionsversuchen mit dem Serogruppe B Stamm MC58 als repr{\"a}sentativem Vertreter der hypervirulenten klonalen Linie ST-32 als Folge einer trifaktoriellen Interaktion mit den Zellen der menschlichen Blut-Hirn/Liquor-Schranke identifiziert werden: (I) Die Internalisierung der Serogruppe B Isolate in HBMEC-Zellen ist von der Expression des Außenmembranproteins Opc sowie (II) von der Anwesenheit des Serumglykoproteins Fibronektin abh{\"a}ngig, das als invasionsf{\"o}rdernde Komponente humanen Serums die Bindung von Meningokokken an spezifische Rezeptoren auf HBMEC-Zellen vermittelt. Fibronektin bindet (III) als Br{\"u}ckenmolek{\"u}l an RGD-Bindungsmotive der \&\#61537;5\&\#61538;1-Integrine auf HBMEC-Zellen. Diese stellen spezifische Rezeptoren der Fibronektin-vermittelten Invasion Opc-exprimierender Serogruppe B Meningokokken in zerebrale menschliche Hirnendothelzellen dar. Weder f{\"u}r Serogruppe A noch f{\"u}r Serogruppe C Meningokokken konnte in der vorliegenden Arbeit eine Serum-vermittelte Invasion in HBMEC-Zellen beschrieben werden. Als urs{\"a}chlich k{\"o}nnen die nat{\"u}rlicherweise fehlende Opc-Expression durch Isolate des ST-11 Komplexes sowie eine ausgepr{\"a}gte Variabilit{\"a}t der Opc-Expression durch die analysierten ST-1 Isolate diskutiert werden. Die wesentliche Bedeutung der Zytoskelettfunktion f{\"u}r die Invasion von N. meningitidis in HBMEC-Zellen konnte in Infektionsversuchen mit eukaryontischen Zytoskelettinhibitoren nachgewiesen werden. Mikrofilamente und Mikrotubuli als Elemente des Zytoskeletts wurden als essentielle Komponenten einer effizienten Internalisierung Opc-exprimierender Serogruppe B Meningokokken in HBMEC-Zellen identifiziert.}, language = {de} } @phdthesis{Klein2004, author = {Klein, Oliver}, title = {Regulation der Chemokinexpression in humanen zerebralen Endothelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11567}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Humane zerebrale Endothelzellen sind in vitro in der Lage nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen Chemokine zu produzieren. Diese sind von Bedeutung in der Entwicklung von entz{\"u}ndlichen ZNS-Erkrankungen. So scheinen zerebrale Endothelzellen neben Astrozyten und Mikroglia als Produzenten dieser Schl{\"u}sselmolek{\"u}le zu fungieren.}, language = {de} } @phdthesis{Greiffenberg2000, author = {Greiffenberg, Lars}, title = {Interaktion von Listeria monocytogenes mit Endothelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1340}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Listeria monocytogenes {\"u}berwindet endotheliale Barrieren, um eine Meningitis oder Encephalitis auszul{\"o}sen. Das Hindurchtreten durch diese Barriere k{\"o}nnte {\"u}ber die Invasion von Endothelzellen durch Listerien aus dem Blut und anschließender Freisetzung der Bakterien ins Gehirn erfolgen. In den ersten Infektionsmodellen, in denen gezeigt wurde, daß Listerien in der Lage sind Endothelzellen zu invadieren, wurden humane, makrovaskul{\"a}re Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet. Die f{\"u}r die Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen mikrovaskul{\"a}ren Hirnendothelzellen (BMEC) unterscheiden sich aber deutlich von den makrovaskul{\"a}ren HUVEC. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von L. monocytogenes mit HUVEC und mit humanen BMEC (HBMEC) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß L. monocytogenes HBMEC effizient invadieren kann. Nach der Aufnahme und dem Entkommen der Bakterien aus dem Phagosom bilden sie Aktinschweife aus, mit deren Hilfe sie sich im Zytoplasma frei bewegen k{\"o}nnen. Listerien sind in der Lage, sich in HBMEC {\"u}ber einen Zeitraum von 20 Stunden zu vermehren und {\"u}ber eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle in benachbarte Zellen zu gelangen. Mit einem Listerien-Stamm, der das gr{\"u}n-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnte der Infektionsverlauf in HBMEC {\"u}ber einen Zeitraum von 20 Stunden in Echtzeit verfolgt werden. Hierbei zeigte sich, daß auch stark infizierte HBMEC sich nicht vom Untergrund abl{\"o}sen oder lysieren und somit gegen{\"u}ber intrazellul{\"a}ren Listerien sehr widerstandsf{\"a}hig sind. Wie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HBMEC-Monolayern nach einer Infektion mit L. monocytogenes erkennen ließen, adh{\"a}rieren Listerien an HBMEC, indem sie einen engen Kontakt mit Mikrovilli auf HBMEC eingehen. Mit Listerien infizierte HBMEC bilden wenige Stunden nach der Infektion Membranausst{\"u}lpungen aus, in denen sich Listerien befinden. Diese Ausst{\"u}lpungen sind mit der Zelle nur noch {\"u}ber sehr d{\"u}nne Membranschl{\"a}uche verbunden. Um herauszufinden, welche Listerienproteine an der Aufnahme von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC beteiligt sind, wurden verschiedene Deletionsmutanten auf ihre Invasivit{\"a}t in HUVEC und HBMEC getestet. In Gegenwart von 20 Prozent Humanserum wurden HUVEC in einer von den Oberfl{\"a}chenproteinen InlA, InlB und ActA unabh{\"a}ngigen Weise von L. monocytogenes invadiert. Wurde das Gen, welches f{\"u}r den positiven Regulationsfaktor PrfA kodiert, deletiert, reduzierte dies die Invasionsrate betr{\"a}chtlich. Listerienst{\"a}mme mit einer Deletion im f{\"u}r InlB kodierenden Gen sind unf{\"a}hig, HBMEC zu invadieren. Neben InlG und ActA spielt auch PrfA eine entscheidende Rolle bei der Invasion von L. monocytogenes in HBMEC. Die Adh{\"a}sion von L. monocytogenes an HBMEC ist von InlB unabh{\"a}ngig. Auch die apathogene und nicht-invasive Art L. innocua bindet an HBMEC. Humanserum hemmt die Invasion von L. monocytogenes in HBMEC, nicht aber in HUVEC. W{\"a}hrend sich die Invasionsraten von L. monocytogenes in HUVEC durch Zentrifugation bei der Infektion erh{\"o}hen ließen, hatte die Zentrifugation keine Auswirkung auf die Invasivit{\"a}t von L. monocytogenes in HBMEC. Neben diesen konnten in dieser Arbeit noch weitere Infektionsparameter gefunden werden, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC haben. Im Zell{\"u}berstand von HUVEC konnten bis zu 6 Stunden nach einer Infektion mit L. monocytogenes große Mengen an IL-8 nachgewiesen werden. W{\"a}hrend eine Infektion von HUVEC mit L. monocytogenes die Expression von IL-6-spezifischer mRNA schwach induzierte, war keine vermehrte Expression von MCP-1- und VCAM-1-spezifischer mRNA feststellbar. Indem Caco-2-Zellen und HBMEC auf gegen{\"u}berliegenden Seiten eines Filters bis zur Konfluenz kultiviert wurden, konnte ein in-vitro-Modell des choroid plexus etabliert werden. Wenige Stunden nach der Infektion von HBMEC mit L. monocytogenes befanden sich auch in den Caco-2-Zellen Listerien. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, waren diese Listerien durch die Filterporen in die Epithelzellen gelangt. Der Mechanismus, dem diese Ausbreitung zugrunde liegt, ist noch unbekannt.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} }