@phdthesis{Slopianka2020,
  author    = {Slopianka, Markus},
  title     = {Evaluation von Gallens{\"a}uren als Biomarker f{\"u}r Lebertoxizit{\"a}t in der pr{\"a}klinischen Arzneimittelentwicklung},
  doi       = {10.25972/OPUS-20462},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-204627},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Die Detektion Arzneimittel-induzierter Lebersch{\"a}digung (engl. DILI - Drug induced liver injury) stellt eine Herausforderung in der pr{\"a}klinischen Entwicklung von Arzneistoffen dar. Die zur Verf{\"u}gung stehenden konventionellen klinisch-chemischen Marker, wie Alanin-Aminotransferase (ALAT), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alkalische Phosphatase (APh), zeigen z. B. bei minimaler bis leichter Leberpathologie keine Ver{\"a}nderungen im Serum an und besitzen somit nur eine geringe Sensitivit{\"a}t f{\"u}r den fr{\"u}hzeitigen Nachweis einer Lebertoxizit{\"a}t. Des Weiteren besitzen klinisch-chemische Serummarker gleichzeitig eine geringe Spezifit{\"a}t und sind somit f{\"u}r die Differenzierung unterschiedlicher Lebertoxizit{\"a}ten nur limitiert geeignet. Neben den beschriebenen diagnostischen Herausforderungen k{\"o}nnen u. a. auch histopathologische Befunde in der Leber, ohne eine Ver{\"a}nderung der klinisch-chemischen Serummarker auftreten und umgekehrt. Die Histopathologie ist als Goldstandard zwar spezifisch, als invasive Technik f{\"u}r eine Verlaufskontrolle in toxikologischen und klinischen Studien aber ungeeignet. In den vergangenen Jahren lieferten Studien zum Gallens{\"a}ure-Profiling mittels Fl{\"u}ssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit Modellsubstanzen, die unterschiedliche Formen einer Lebertoxizit{\"a}t in Ratten induzierten Hinweise, dass individuelle Gallens{\"a}uren ein diagnostisches Potential f{\"u}r die Bewertung einer Lebersch{\"a}digung besitzen. Ziel dieser Arbeit ist es, dass Gallens{\"a}ure-Profiling in die vorgeschriebene Diagnostik der Lebertoxizit{\"a}t in der pr{\"a}klinischen Arzneimittelentwicklung zu implementieren und zu bewerten, ob diese Marker einen wertvollen Beitrag zur Charakterisierung einer Lebertoxizit{\"a}t leisten k{\"o}nnen. Hierzu wurde eine quantitative LC-MS/MS-Methode etabliert und validiert, die es erm{\"o}glicht, 20 verschiedene endogene Gallens{\"a}uren in Ratten zu analysieren. Die quantitative Analytik erm{\"o}glichte eine selektive Bestimmung von prim{\"a}ren, konjugierten und sekund{\"a}ren Gallens{\"a}uren. F{\"u}r die Quantifizierung der individuellen Gallens{\"a}uren wurden 2 MRM-{\"U}berg{\"a}nge bestimmt. Zur Bestimmung des Arbeitsbereiches wurden 20 Referenzstandards von Gallens{\"a}uren verwendet. Eine Kalibrierung mit sieben Kalibrierpunkten in aufsteigender Konzentration wurde f{\"u}r die Bestimmung der endogenen Konzentrationen genutzt. Zur Kompensation des Matrixeffektes wurden 10 isotopenmarkierte interne Standards in die Analytik eingef{\"u}gt. Die Reproduzierbarkeit laufender Messungen wurde durch eingef{\"u}gte Qualit{\"a}tskontrollen (QCs) in drei verschiedenen Konzentrationsbereichen {\"u}berwacht. Es wurde ein Gallens{\"a}ure-Profiling mittels LC-MS/MS im Plasma und Lebergewebe von Ratten, die mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt wurden, durchgef{\"u}hrt. Histopathologische Zusammenfassung Untersuchungen konnten aufzeigen, dass sich in den Lebern von m{\"a}nnlichen Ratten, die mit dem Arzneimittel Amitriptylin {\"u}ber 14 Tage behandelt wurden, eine makrovesikul{\"a}re Steatose in der Leber manifestierte. Die klassischen Serummarker, wie ALAT, ASAT und Gamma-Glutamyltransferase (γGT), konnten diese Art des Leberschadens nicht detektieren. Dagegen erh{\"o}hten sich die Konzentrationen Glycin-konjugierter Gallens{\"a}uren mit parallel absinkenden Konzentrationen von Taurin-konjugierten Gallens{\"a}uren im Lebergewebe behandelter Ratten. Gleichzeitig ergaben sich signifikant erh{\"o}hte Konzentrationen der prim{\"a}ren Gallens{\"a}uren CA und CDCA im Plasma behandelter Ratten. Andere Gallens{\"a}ure-Profile konnten nach einer Methapyrilen-induzierten Leberzellnekrose mit hepatobili{\"a}rer Sch{\"a}digung beobachtet werden. Nach einer 14-t{\"a}gigen Behandlungsphase mit 80 mg/kg KG Methapyrilen, erh{\"o}hten sich die Konzentrationen von 11 Gallens{\"a}uren im Lebergewebe behandelter Tiere. Gleichzeitig stiegen die Konzentrationen von allen 20 individuellen Gallens{\"a}uren im Plasma behandelter Ratten an. Zus{\"a}tzlich zur quantitativen Analyse von Gallens{\"a}uren mittels LC-MS/MS wurde die Expression von Genen der Gallens{\"a}ure-Biosynthese, des Gallens{\"a}ure-Transports und die Regulation der Gallens{\"a}ure-Hom{\"o}ostase mittels Multiplex-Analyse untersucht. Die erh{\"o}hte Expression von Genen f{\"u}r Efflux-Transporter der Multidrug Resistance-Related Protein (MRP)-Familie deutet auf einen gesteigerten Abtransport von Gallens{\"a}uren ins Blut hin und korrespondierte mit erh{\"o}hten Gallens{\"a}ure-Konzentrationen im Plasma der behandelten Ratten. Des Weiteren wurden die Erkenntnisse der Gallens{\"a}ure-Profile aus den tierexperimentellen Studien als Grundlage genutzt, um Arzneimittel-induzierte Lebertoxizit{\"a}t auf ein zellbiologisches In-vitro-System zu {\"u}bertragen. Es wurden In-vitro-Experimente mit prim{\"a}ren Rattenhepatozyten zwischen zwei Kollagenmatrices (Sandwich-Kultivierung) durchgef{\"u}hrt. Dieses etablierte System wird u. a. f{\"u}r Untersuchungen an hepatobili{\"a}ren Transportsystemen (z. B. Bile Salt Export Pump, BSEP) genutzt. Das Gallens{\"a}ure-Profiling in den Zellkultur{\"u}berst{\"a}nden belegt, dass die prim{\"a}ren Hepatozyten konjugierte Gallens{\"a}uren bilden, dass sie bei einer Inkubation mit prim{\"a}ren Gallens{\"a}uren diese verstoffwechseln und dadurch, neben den bereits vorhandenen Gallens{\"a}uren, weitere konjugierte Gallens{\"a}uren produzieren. Eine Exposition mit den Hepatotoxinen Troglitazon und Methapyrilen f{\"u}hrte zu Ver{\"a}nderungen in der Gallens{\"a}ure-Hom{\"o}ostase der Hepatozyten. In den In-vivo-Experimenten wurde eine Methapyrilen-induzierte Nekrose mit hepatobili{\"a}rer Sch{\"a}digung in den behandelten Ratten festgestellt. Bei der Behandlung mit Methapyrilen ergaben sich starke Konzentrationsanstiege der Gallens{\"a}uren im Plasma (u. a. von GCA und TCA), die mit den histopathologischen Befunden korrelierten. Anhand dieser Daten und der Zusammenfassung pharmakokinetischen Eigenschaften von Methapyrilen wurde ein Studiendesign f{\"u}r Rattenhepatozyten in Sandwich-Kulturen entwickelt, um eine initiale Absch{\"a}tzung der Konzentrationsver{\"a}nderungen von Gallens{\"a}uren im In-vitro-Testsystem durchzuf{\"u}hren. Ab Tag 8 der Behandlung kam es zu einem erh{\"o}hten Anstieg der GCA- und TCA-Konzentrationen im Zellkulturmedium. Daher besitzt das In-vitro-Testsystem m{\"o}glicherweise das Potential, tierexperimentelle Studien bei der Bewertung einer Hepatotoxizit{\"a}t zu unterst{\"u}tzen oder sogar zu reduzieren. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse aus dieser Arbeit, dass Gallens{\"a}ure-Profiling in m{\"a}nnlichen und weiblichen Ratten eine geeignete Methode zur Detektion und Differenzierung von Lebersch{\"a}den ist. Die Technologie ist flexibel einsetzbar und kann bereits etablierte Testverfahren, wie die Bestimmung von Serummarkern in der Klinischen Chemie und die Histopathologie unterst{\"u}tzen. Damit besitzt das Gallens{\"a}ure-Profiling das Potential, die Bewertung beim Nachweis und bei der Charakterisierung einer Lebertoxizit{\"a}t im Rahmen der Evaluierung von pr{\"a}klinischen Arzneimittelkandidaten zu verbessern.},
  subject      = {Hepatotoxizit{\"a}t},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Adler2012,
  author    = {Adler, Melanie},
  title     = {New approaches to improve prediction of drug-induced liver injury},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69512},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Das h{\"a}ufige Scheitern neuer Arzneistoffkandidaten aufgrund von Lebertoxizit{\"a}t in pr{\"a}klinischen und klinischen Studien stellt ein erhebliches Problem in der Entwicklung von neuen Arzneimitteln dar. Deshalb ist es wichtig, neue Ans{\"a}tze zu entwickeln, mit deren Hilfe unerw{\"u}nschte Wirkungen von Arzneimitteln fr{\"u}her und zuverl{\"a}ssiger erkannt werden k{\"o}nnen. Um die Vorhersage von Lebertoxizit{\"a}t in pr{\"a}klinischen Studien zu verbessern, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei wesentliche Ans{\"a}tze gew{\"a}hlt: 1) die Evaluierung neuer Biomarker, durch die Lebertoxizit{\"a}t zuverl{\"a}ssiger und empfindlicher detektiert werden k{\"o}nnte und 2.) wirkmechanistische Untersuchungen mittels Toxcicogenomics f{\"u}r ein besseres Verst{\"a}ndnis der zugrunde liegenden Mechanismen der Arzneimittel-induzierten Toxizit{\"a}t. Ein Ziel dieser Arbeit war, die F{\"a}higkeit einiger neuer potenzieller Biomarker (NGAL, Thiostatin, Clusterin und PON1) zu bewerten, Arzmeimittel-induzierte Lebertoxizit{\"a}t in Ratten fr{\"u}hzeitig zu erkennen. Die Ergebnisse zeigen, dass PON1 und Clusterin infolge eines durch die verabreichten Arzneistoffkandidaten verursachten Leberschadens nicht konsistent ver{\"a}ndert waren. Diese beiden Marker sind daher, verglichen mit bestehenden klinisch-chemischen Markern, nicht f{\"u}r eine sichere Vorhersage von Arzneistoff-induzierten Lebersch{\"a}den geeignet. Bei Thiostatin und NGAL zeigte sich hingegen ein zeit- und dosisabh{\"a}ngiger Anstieg im Serum und Urin behandelter Tiere. Diese Ver{\"a}nderungen, die gut mit der mRNA Expression im Zielorgan {\"u}bereinstimmten, korrelierten mit dem Schweregrad der Arzneistoff-induzierten Lebersch{\"a}den. Die Analyse mittels ROC zeigte, Thiostatin im Serum, nicht aber NGAL, ein besserer Indikator f{\"u}r Arzneimittel-induzierte hepatobili{\"a}re Sch{\"a}den ist als die routinem{\"a}ßig verwendeten klinische-chemischen Marker, wie z.B. die Leberenzyme ALP, ALT und AST. Thiostatin wird jedoch als Akute-Phase-Protein in einer Vielzahl von Geweben exprimiert und kann somit nicht spezifisch als Lebermarker betrachtet werden. Dennoch zeigen unsere Ergebnisse, dass Thiostatin als sensitiver, minimal-invasiver diagnostischer Marker f{\"u}r Entz{\"u}ndungsprozesse und Gewebesch{\"a}den eine sinnvolle Erg{\"a}nzung in der pr{\"a}klinischen Testung auf Lebertoxizit{\"a}t darstellt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mittels RNA-Interferenz das pharmakologische Target des Arzneistoffkandidaten BAY16, der Glukagonrezeptor, auf mRNA-Ebene gehemmt und anhand von Genexpressionsanalysen untersucht, ob die pharmakologisch-bedingte Modulation des Glukagonrezeptors eine Rolle in der Toxizit{\"a}t von BAY16 spielt. Desweiteren sollten diese Arbeiten Aufschluss geben, welche molekularen Ver{\"a}nderungen auf die pharmakologische Wirkung des Arzneistoffs zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind, und daher f{\"u}r den Mechanismus der Toxizit{\"a}t m{\"o}glicherweise wenig relevant sind. W{\"a}hrend BAY16 in Konzentrationen von 75 µM starke zytotoxische Wirkungen aufwies, hatte die siRNA vermittelte Depletion des Glukagonrezeptors keinen Einfluss auf die Vitalit{\"a}t prim{\"a}rer Rattenhepatozyten. Daraus l{\"a}sst sich ableiten, dass die Hepatotoxizi{\"a}t von BAY16 in vitro und in vivo nicht mit der pharmakologischen Modulation des Glukagonrezeptors assoziiert ist. Diese Ergebnisse wurden durch die Tatsache gest{\"u}tzt, dass die meisten der durch BAY16 induzierten Genexpressionsver{\"a}nderungen unabh{\"a}ngig von der pharmakologischen Modulation des Glucagonrezeptors auftraten. Diese beobachteten off-target-Effekte beinhalteten Ver{\"a}nderungen im Fremdstoffmetabolismus, oxidativer Stress, erh{\"o}hte Fetts{\"a}uresynthese und Ver{\"a}nderungen im Cholesterol- und Gallens{\"a}uremetabolismus. Obwohl Ver{\"a}nderungen in diesen molekularen Mechanismen zum Fortschreiten eines Leberschadens beitragen k{\"o}nnen, ist es anhand dieser Daten nicht m{\"o}glich einen eindeutigen Mechanismus f{\"u}r die Toxizit{\"a}t von BAY16 abzuleiten. In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass die Anwendung der siRNA-Technologie einen neuen methodischen Ansatz darstellt, um Mechanismen arzneimittelbedingter Toxizit{\"a}t besser verstehen zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Biomarker},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Lorenz2007,
  author    = {Lorenz, Ren{\´e}},
  title     = {Vergleichende Langzeitbeobachtung Zidovudin- und Stavudin-haltiger Therapieregime in der antiretroviralen Therapie HIV-positiver Patienten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25897},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die Nukleosidischen Reverse Transkriptase Hemmer (NRTI) Zidovudin (AZT) und Stavudin (d4T) sind h{\"a}ufig eingesetzte Bestandteile der antiretroviralen Kombinationstherapie. Die Behandlung erstreckt sich oft {\"u}ber viele Jahre, sodass neben der antiviralen und immunologischen Effektivit{\"a}t besonders das Auftreten von Langzeitnebenwirkungen von Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden retrospektiv die Langzeit-Therapieverl{\"a}ufe von 213 Patienten, die zwischen 1990 und 2003 mit Zidovudin oder Stavudin behandelt wurden, verglichen. Die Kombinationsegime unterschieden sich nicht in ihrer antiretroviralen Wirksamkeit oder Einnahmedauer, jedoch in ihrem Nebenwirkungsprofil. So traten h{\"a}matologische Nebenwirkungen (An{\"a}mien, Leukopenien, Neutropenien) signifikant h{\"a}ufiger unter AZT auf. Die Gabe von Stavudin kann die h{\"a}matotoxische Wirkung von Zidovudin zum Teil kompensieren. Nach Therapieumstellung von AZT auf d4T kam es zu einem Anstieg der absoluten Leukozyten, der neutrophilen Granulozyten und des H{\"a}moglobins. Sowohl in Zidovudin- als auch Stavudin-haltigen Regimen trat nach Beginn der antiretroviralen Therapie eine Makrozytose auf. Patienten mit Noncompliance zeigten eine anhaltende Normozytose bzw. eine Normalisierung des MCV, falls nach Beginn der ART eine Makrozytose bestand. Das MCV kann als Compliancemarker genutzt werden. Unter d4T-haltigen Regimen traten h{\"a}ufiger metabolische Nebenwirkungen wie Hypercholesterin{\"a}mien, Hypertriglycerid{\"a}mien und Hepatotoxizit{\"a}t auf, v.a. in Kombination mit Proteaseinhibitoren. Lipodystrophien wurden unter Proteasehemmer-haltigen und -freien Regimen beobachtet. Unter Stavudin traten Ver{\"a}nderungen der K{\"o}rperfettverteilung signifikant h{\"a}ufiger auf als unter Zidovudin.},
  subject      = {Zidovudin},
  language  = {de}
}