@phdthesis{Kastner2019,
  author    = {Kastner, Carolin},
  title     = {LASP1 - ein neuer, phosphorylierungs-abh{\"a}ngiger Bindungspartner von CrkL in CML},
  doi       = {10.25972/OPUS-18753},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-187539},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Das Verst{\"a}ndnis der molekularen Mechanismen, die einer malignen Erkrankung zugrunde liegen, ist der Schl{\"u}ssel zur Entwicklung zielgerichteter und effektiver therapeutischer M{\"o}glichkeiten. F{\"u}r das LIM und SH3 Dom{\"a}nen Protein 1, LASP1, konnte im Kontext zahl-reicher Tumorerkrankungen wie dem Mamma-Karzinom, dem Prostata-Karzinom oder dem Ovarial-Karzinom eine {\"U}berexpression ebenso wie eine Korrelation mit Aggressivit{\"a}t und Prognose der Tumorerkrankung gezeigt werden. Bisher war eine Relevanz von LASP1 jedoch nur f{\"u}r solide Tumorerkrankungen nachgewiesen worden. K{\"u}rzlich allerdings wurde lasp1 als eines von 6 Genen identifiziert, die eine exaktere Vorhersage von Krankheitsprogress und -rezidiv bei Patienten mit einer chronischen myeloischen Leuk{\"a}mie (CML) zulassen sollen. Zudem konnte, wie bereits bei zahlreichen anderen, soliden Tumorerkrankungen, eine signifikante {\"U}berexpression des lasp1-Gens in CML-Zellen nachgewiesen werden.Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen besch{\"a}ftigte ich mich im Rahmen dieser Arbeit mit der Frage, welche Funktion LASP1 im Netz der einer CML zugrunde liegenden, molekularen Mechanismen {\"u}bernimmt. Mittels verschiedener Interaktionsassays konnte LASP1 als ein neuer, phosphorylierungs-abh{\"a}ngiger Bindungspartner von CrkL, dem wohl prominentesten Substrat der BCR-ABL-Kinase, identifiziert werden. Dabei impliziert das Attribut „phosphorylierungs-abh{\"a}ngig" sowohl den Phosphorylierungsstatus von LASP1 als auch des Interaktionspartners CrkL. Wie in Vorarbeiten gezeigt, stellt das Tyrosin 171 in der Aminos{\"a}urensequenz von LASP1 eine Phosphorylierungsstelle f{\"u}r die BCR-ABL-Kinase dar; mit LASP1 wurde somit auch ein neues Substrat dieser konstitutiv aktiven Tyrosinkinase entdeckt. Phosphoryliert an Tyrosin 171 kann LASP1 an die SH2-Dom{\"a}ne von CrkL, genauer an das FLVR-Motif innerhalb dieser, binden. Jedoch selbst an Tyrosin 207 durch die BCR-ABL-Kinase phosphoryliert, blockiert CrkL die eigene SH2-Dom{\"a}ne durch intramolekulare Wechselwirkungen f{\"u}r andere Protein-Protein-Interaktionen in gewissem Umfang. Diese neu gewonnenen Erkenntnisse liefern ein weiteres Puzzlest{\"u}ck zum Verst{\"a}ndnis des molekularen Netzwerks, das einer CML-Erkrankung zugrunde liegt und tragen so dazu bei, die Therapieoptionen dieser stetig zu verbessern.},
  subject      = {Chronisch-myeloische Leuk{\"a}mie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Offner2017,
  author    = {Offner, Kristin},
  title     = {SH3-mediated protein interactions of Mena and VASP},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-154481},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {Regulation of actin cytoskeletal turnover is necessary to coordinate cell movement and cell adhesion. Proteins of the Enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) family are important mediators in cytoskeleton control, linking cyclic nucleotide signaling pathways to actin assembly. In mammals, the Ena/VASP family consists of mammalian Enabled (Mena), VASP, and Ena-VASP-like (EVL). The family members share a tripartite domain organization, consisting of an N-terminal Ena/VASP homology 1 (EVH1) domain, a central proline-rich region (PRR), and a C-terminal EVH2 domain. The EVH1 domain mediates binding to the focal adhesion proteins vinculin and zyxin, the PRR interacts with the actin-binding protein profilin and with Src homology 3 (SH3) domains, and the EVH2 domain mediates tetramerization and actin binding. Endothelial cells line vessel walls and form a semipermeable barrier between blood and the underlying tissue. Endothelial barrier function depends on the integrity of cell-cell junctions and defective sealing of cell-cell contacts results in vascular leakage and edema formation. In a previous study, we could identify a novel interaction of the PRR of VASP with αII-spectrin. VASP-targeting to endothelial cell-cell contacts by interaction with the αII-spectrin SH3 domain is sufficient to initiate perijunctional actin filament assembly, which in turn stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, barrier function of VASP-deficient endothelial cells and microvessels of VASP- null mice is defective, demonstrating that αII-spectrin/VASP complexes regulate endothelial barrier function in vivo. The aim of the present study was to characterize the structural aspects of the binding of Ena/VASP proteins to αII-spectrin in more detail. These data are highly relevant to understand the cardiovascular function of VASP and its subcellular targeting. In the present study, the following points were experimentally addressed: 1. Comparison of the interaction between αII-spectrin and Mena, VASP, or EVL In contrast to the highly conserved EVH1/EVH2 domains, the PRR is the most divergent part within the Ena/VASP proteins and may differ in binding modes and mechanisms of regulation. More specifically, VASP contains a triple GP5 motif, whereas EVL and Mena contain one or more GP6 motifs or even longer proline stretches. In the present study, we used peptide scans and competitive αII-spectrin SH3 pull-down assays with the recombinant Mena, VASP, and VASP mutants to investigate the relative binding efficiency. Our results indicate that binding of the αII-spectrin SH3 domain to GP6 motifs is superior to GP5 motifs, giving a rationale for a stronger interaction of αII-spectrin with EVL and Mena than with VASP. 2. Interaction of SH3i with Ena/VASP proteins In the mammalian heart, an αII-spectrin splice variant exists (SH3i), which contains a 20 amino acid insertion C-terminal to the SH3 domain. We used GST-fusion proteins of αII-spectrin, comprising the SH3 domain with or without the alternatively spliced amino acids, to pull-down recombinant Mena, VASP or VASP mutants. The results demonstrate a substantially increased binding of the C-terminal extended SH3 domain as compared to the general αII-spectrin isoform without the 20 amino acid insertion. These findings were also confirmed in pull-down experiments with heart lysates and purified Mena from heart muscle. The increased binding was not due to an alternative, SH3-independent binding interface because a pointmutation of the SH3 domain (W1004R) in the alternatively spliced αII-spectrin isoform completely abrogated the interaction. To analyze the interaction of SH3i and Ena/VASP proteins in living cells, we expressed the extended SH3 domain as GFP fusion proteins in endothelial cells. Here, we observed an extensive co-localization with Mena and VASP at the leading edge of lamellipodia confirming the in vivo relevance of the interaction with potential impact on cell migration and angiogenesis. 3. Binding affinity and influence of the Ena/VASP tetramerization domain We also determined the binding affinity of the general and the alternatively spliced αII-spectrin SH3 with Ena/VASP proteins by isothermal titration calorimetry (ITC) using a peptide from the PRR of Mena (collaboration with Dr. Stephan Feller, University of Oxford). Surprisingly, the binding affinity of the general SH3 domain was low (~900 μM) as compared to other SH3 domain- mediated interactions, which commonly display binding constants in the low micromolar range. Furthermore and in contrast to the pull-down assays, we could not detect an increased binding affinity of the C-terminally extended SH3 domain. This could be either explained by the existence of a third protein, which "bridges" the Mena/αII-spectrin complex in the pull-down assays, or, more likely, by the small size of the Mena peptide, which lacks major parts of the Mena protein, including the tetramerization domain. Indeed, it has been previously shown that the tetramerization of Ena is crucial for the interaction with the Abl- SH3 domain, although no SH3 binding sites are found in the tetramerization domain. To address this point experimentally, we used a VASP mutant that lacks the tetramerization domain in pull-down assays. Neither the general nor the alternatively spliced SH3 domain bound to the monomeric VASP, demonstrating the crucial (indirect) impact of Ena/VASP tetramerization on the interaction with αII-spectrin. In summary, we conclude that the αII-spectrin SH3 domain binds to the proline- rich region of all Ena/VASP proteins. However, binding to EVL and Mena, which both possess one or more GP6 motifs, is substantially more efficient than VASP, which only contains GP5 motifs. The C-terminally extended SH3 domain, which is present in the αII-spectrin splice variant SH3i, binds stronger to the Ena/VASP proteins than the general isoform and expression of the isolated domain is sufficient for co-localization with Ena/VASP in living endothelial cells. Finally, the tetramerization of the Ena/VASP proteins is indispensable for the interaction with either isoform of αII-spectrin.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schaafhausen2011,
  author    = {Schaafhausen, Anne},
  title     = {Proteininteraktionen der Vitamin K Epoxid Reduktase Proteine VKORC1 und VKORC1L1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55442},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Seit der Entdeckung des ersten Gens f{\"u}r den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schl{\"u}ssel-Enzym f{\"u}r die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zus{\"a}tzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anf{\"a}llt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen f{\"u}hren zu einem signifikanten Effekt auf die ben{\"o}tigte Coumarin-Dosis und die Stabilit{\"a}t der H{\"a}mostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1" (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit v{\"o}llig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellul{\"a}ren Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein k{\"o}nnen. Die Ergebnisse k{\"o}nnen wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke {\"A}hnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivit{\"a}t, wobei die Affinit{\"a}ten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich h{\"o}her sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen f{\"u}hrt in beiden Proteinen zu einem fast vollst{\"a}ndigen Verlust der Aktivit{\"a}t. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 - wie VKORC1 - in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine {\"a}hnliche Struktur, die gleiche zellul{\"a}re Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivit{\"a}t hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen k{\"o}nnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out M{\"a}usen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem f{\"u}r Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als K{\"o}der 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferh{\"a}ufigkeit und funktioneller {\"U}berlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpr{\"a}zipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation n{\"a}her untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke {\"U}berschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies k{\"o}nnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, f{\"u}hrt aber auch zu neuen Hypothesen bez{\"u}glich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1" (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals W{\"u}rzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein" (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP f{\"u}hren zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die {\"A}hnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch {\"u}berh{\"o}hte Dosierung von Coumarinen w{\"a}hrend der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpr{\"a}zipitationsexperimenten nicht best{\"a}tigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bed{\"u}rfen weiterf{\"u}hrender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen w{\"a}re auch eine kritische Betrachtung der {\"u}brigen 85 prim{\"a}ren Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll.},
  subject      = {Vitamin-K-Gruppe},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Fischer2010,
  author    = {Fischer, Andreas},
  title     = {The Role of Protein-Protein Interactions in the Activation Cycle of RAF Kinases},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48139},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Members of the RAF protein kinase family are key regulators of diverse cellular processes. The need for isoform-specific regulation is reflected by the fact that all RAFs not only display a different degree of activity but also perform isoform-specific functions at diverse cellular compartments. Protein-protein-interactions and phosphorylation events are essential for the signal propagation along the Ras-RAF-MEK-ERK cascade. More than 40 interaction partners of RAF kinases have been described so far. Two of the most important regulators of RAF activity, namely Ras and 14-3-3 proteins, are subject of this work. So far, coupling of RAF with its upstream modulator protein Ras has only been investigated using truncated versions of RAF and regardless of the lipidation status of Ras. We quantitatively analyzed the binding properties of full-length B- and C-RAF to farnesylated H-Ras in presence and absence of membrane lipids. While the isolated Ras-binding domain of RAF exhibit a high binding affinity to both, farnesylated and nonfarnesylated H-Ras, the full-length RAF kinases demonstrate crucial differences in their affinity to Ras. In contrast to C-RAF that requires carboxyterminal farnesylated H-Ras for interaction at the plasma membrane, B-RAF also binds to nonfarnesylated H-Ras in the cytosol. For identification of the potential farnesyl binding site we used several fragments of the regulatory domain of C-RAF and found that the binding of farnesylated H-Ras is considerably increased in the presence of the cysteine-rich domain of RAF. In B-RAF a sequence of 98 amino acids at the extreme N terminus enables binding of Ras independent of its farnesylation status. The deletion of this region altered Ras binding as well as kinase properties of B-RAF to resemble C-RAF. Immunofluorescence studies in mammalian cells revealed essential differences between B- and C-RAF regarding the colocalization with Ras. In conclusion, our data suggest that that B-RAF, in contrast to C-RAF, is also accessible for nonfarnesylated Ras in the cytosolic environment due to its prolonged N terminus. Therefore, the activation of B-RAF may take place both at the plasma membrane and in the cytosolic environment. Furthermore, the interaction of RAF isoforms with Ras at different subcellular sites may also be governed by the complex formation with 14-3-3 proteins. 14-3-3 adapter proteins play a crucial role in the activation of RAF kinases, but so far no information about the selectivity of the seven mammalian isoforms concerning RAF association and activation is available. We analyzed the composition of in vivo RAF/14-3-3 complexes isolated from mammalian cells with mass spectrometry and found that B-RAF associates with a greater variety of 14-3-3 proteins than C- and A-RAF. In vitro binding assays with purified proteins supported this observation since B-RAF showed highest affinity to all seven 14-3-3 isoforms, whereas C-RAF exhibited reduced affinity to some and A-RAF did not bind to the 14-3-3 isoforms epsilon, sigma, and tau. To further examine this isoform specificity we addressed the question of whether both homo- and heterodimeric forms of 14-3-3 proteins participate in RAF signaling. By deleting one of the two 14-3-3 isoforms in Saccharomyces cerevisiae we were able to show that homodimeric 14-3-3 proteins are sufficient for functional activation of B- and C-RAF. In this context, the diverging effect of the internal, inhibiting and the activating C-terminal 14-3-3 binding domain in RAF could be demonstrated. Furthermore, we unveil that prohibitin stimulates C-RAF activity by interfering with 14-3-3 at the internal binding site. This region of C-RAF is also target of phosphorylation as part of a negative feedback loop. Using tandem MS we were able to identify so far unknown phosphorylation sites at serines 296 and 301. Phosphorylation of these sites in vivo, mediated by activated ERK, leads to inhibition of C-RAF kinase activity. The relationship of prohibitin interference with 14-3-3 binding and phosphorylation of adjacent sites has to be further elucidated. Taken together, our results provide important new information on the isoform-specific regulation of RAF kinases by differential interaction with Ras and 14-3-3 proteins and shed more light on the complex mechanism of RAF kinase activation.},
  subject      = {Signaltransduktion},
  language  = {en}
}