@phdthesis{Hellmann2013,
  author    = {Hellmann, Tina Verena},
  title     = {Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden die gr{\"o}ßte Untergruppe der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie sekretierter Wachstumsfaktoren. Sie haben Schl{\"u}sselfunktionen w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Embryogenese inne und regulieren dar{\"u}ber hinaus die Organogenese sowie die Hom{\"o}ostase zahlreicher Organe und Gewebe. BMPs vermitteln ihre Signale {\"u}ber zwei Typen transmembran{\"a}rer Serin-/Threoninkinaserezeptoren, die als Typ I und Typ II Rezeptoren bezeichnet werden. Den etwa zwanzig BMP-Liganden stehen dabei nach aktuellem Kenntnisstand nur f{\"u}nf Typ I und drei Typ II Rezeptorkinasen gegen{\"u}ber, wodurch sich insbesondere die BMP-Familie durch eine hohe Promiskuit{\"a}t der Ligand-Rezeptor-Interaktion auszeichnet. Damit dennoch Liganden-spezifische Signale vermittelt werden k{\"o}nnen, m{\"u}ssen die Signaleigenschaften dieser Faktoren komplex reguliert werden. Die Mehrzahl der Regulationsmechanismen beeinflusst die Signaltransduktion negativ. K{\"u}rzlich wurden jedoch die ersten, spezifisch auf die BMP-Familie wirkenden membranassoziierten Agonisten beschrieben - die Corezeptoren der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Familie bestehend aus RGMa, RGMb und RGMc. F{\"u}r das Familienmitglied RGMb werden neben pro-BMP-Prozessen allerdings auch hemmende Wirkungen auf die BMP-abh{\"a}ngige Signaltransduktion diskutiert. Um diese teils widerspr{\"u}chlichen Funktionen zu beleuchten, wurde RGMb im Rahmen dieser Arbeit umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zun{\"a}chst konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von hochreinem rekombinanten RGMb Corezeptorprotein etabliert werden. Dies erm{\"o}glichte die Entwicklung umfangreicher in vitro Interaktionsstudien mit verschiedenen Liganden sowie Rezeptorektodom{\"a}nen der TGF-β Superfamilie basierend auf dem Verfahren der Oberfl{\"a}chen-Plasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Dadurch konnte gezeigt werden, dass RGMb spezifisch und hochaffin mit Wachstumsfaktoren der BMP-Familie, nicht aber mit Vertretern anderer Untergruppen der TGF-β Superfamilie wechselwirkt. Im Widerspruch zu Literaturdaten konnten dar{\"u}ber hinaus keine direkten Interaktionen zwischen RGMb und den analysierten Typ I und Typ II Rezeptorektodom{\"a}nen nachgewiesen werden. Zellbasierte Kompetitionsanalysen ergaben, dass der l{\"o}sliche RGMb Corezeptor BMP-induzierte Signale dosisabh{\"a}ngig inhibiert, w{\"a}hrend die membranverankerte RGMb-Variante eine Verst{\"a}rkung des BMP-Signals durch eine Erniedrigung der halbmaximalen Ligandenkonzentration hervorruft. Mittels Oberfl{\"a}chen-Plasmonresonanz konnte im Rahmen von Coinjektionsstudien außerdem beobachtet werden, dass RGMb die Bindung der untersuchten BMP-Liganden an die Typ I Rezeptorektodom{\"a}nen hemmt. Daraus kann geschlossen werden, dass RGMb an das Typ I Rezeptorbindeepitop der BMP-Liganden bindet und dadurch deren Signalaktivit{\"a}t neutralisiert. Ein abweichendes Bild zeigt sich f{\"u}r die Beeinflussung der BMP/Typ II Rezeptorinteraktion durch RGMb. So wurde im Rahmen von SPR-basierten Coinjektionsstudien beobachtet, dass BMP-Liganden in Gegenwart des Corezeptors RGMb ausschließlich mit der Ektodom{\"a}ne des Typ II Rezeptors ActR IIB, nicht aber mit den Rezeptoren ActR-II oder BMPR-II interagieren k{\"o}nnen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar der Kernbereich des Typ II Rezeptorepitops durch die Interaktion des Liganden mit RGMb unbeeinflusst bleibt, jedoch eine partielle periphere {\"U}berlagerung bei gleichzeitiger Bindung von RGMb und den Typ II Rezeptoren f{\"u}r die Ausbildung der beobachteten Selektivit{\"a}t verantwortlich sein muss. Um diese Wechselwirkungen auch auf zellul{\"a}rer Ebene analysieren zu k{\"o}nnen, wurden fluoreszenzbasierte Fusionskonstrukte f{\"u}r BMP-Rezeptoren sowie f{\"u}r RGMb synthetisiert und ein funktionelles F{\"a}rbeprotokoll f{\"u}r die konfokale Mikroskopie etabliert. Die biochemischen Analysen sowie die in dieser Arbeit pr{\"a}sentierten umfassenden Charakterisierungen der Corezeptorinteraktionen mit einer Vielzahl an BMP-Liganden sowie deren Rezeptoren grenzen das RGMb-Bindeepitop ein und bilden so einen idealen Ausgangspunkt f{\"u}r die genaue Identifizierung und Charakterisierung dieses Epitops mittels gerichteter Mutagenese. Dar{\"u}ber hinaus weisen die vorliegenden in vitro Bindungsstudien auf einen deutlich komplexeren als bisher in der Literatur angenommenen, m{\"o}glicherweise v{\"o}llig neuartigen Modulationsmechanismus des BMP-Signalweges durch den Corezeptor RGMb hin. So wird in Anwesenheit von RGMb die Typ II Rezeptorspezifit{\"a}t und vermutlich auch die Lokalisierung der BMP-Liganden in bestimmten Membrankompartimenten - etwa Lipid Rafts - selektiv reguliert, wodurch BMP-induzierte Signale fein moduliert werden k{\"o}nnten. Die in dieser Arbeit synthetisierten fluoreszenzbasierten Fusionskonstrukte stellen zudem zusammen mit den etablierten Protokollen zur konfokalen Mikroskopie effektive Werkzeuge f{\"u}r eine zuk{\"u}nftige detaillierte Aufkl{\"a}rung (z. B. durch FRET-Studien) der komplexen RGMb-abh{\"a}ngigen Regulation des BMP-Signalweges auf zellul{\"a}rer Ebene dar.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Straube2000,
  author    = {Straube, Frank},
  title     = {Untersuchungen zur Rolle von CD8 bei der Aktivierung von gamma-delta-T-Zellen der Ratte},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2381},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {CD8 wird von thymisch gereiften a/b T Zellen als CD8ab-Heterodimer exprimiert und dient als Korezeptor bei der MHC Klasse I (MHC I) restringierten Antigenerkennung. In dieser Funktion stabilisiert CD8 die Bindung des T Zellrezeptors (TCR) an seinen Liganden (MHC I mit antigenem Peptid) und vermittelt dar{\"u}ber hinaus kostimulatorische Signale an die T Zelle. Die Antigene der g/d T Zellen sind bis auf einige Ausnahmen unbekannt, aber g/d T Zellen von Maus und Mensch weisen im allgemeinen h{\"o}chstwahrscheinlich keine MHC-restringierte Antigenerkennung auf. Dementsprechend findet man auf den meisten g/d T Zellen dieser Spezies keinen der MHC-spezifischen Korezeptoren CD4 oder CD8. In auff{\"a}lligem Gegensatz dazu exprimieren in der Milz der Ratte bis zu 80 Prozent der g/d T Zellen das CD8ab-Heterodimer. Um die m{\"o}gliche Funktion von CD8ab auf g/d T Zellen besser zu verstehen, wurden zun{\"a}chst die CD8-vermittelten Signale untersucht. Eine Schl{\"u}sselrolle bei der Initiierung der TCR-Signalkaskade kommt der mit CD8a assoziierten Proteintyrosinkinase p56lck zu. Diese ist, wie durch Kopr{\"a}zipitationsexperimente gezeigt wurde, bei a/b und g/d T Zellen gleichermaßen mit CD8 assoziiert und zeigt dieselbe Kinaseaktivit{\"a}t. Weiterhin konnte in vitro ein kostimulatorisches Potential von CD8-spezifischen Antik{\"o}rpern f{\"u}r a/b und g/d T Zellen gezeigt werden. Demnach besitzt CD8 auf a/b und g/d T Zellen prinzipiell eine vergleichbare F{\"a}higkeit zur {\"U}bertragung kostimulatorischer Signale. Es war folglich naheliegend, einen Zusammenhang zwischen der CD8ab-Expression der g/d T Zellen mit einer m{\"o}glichen MHC I estringierten Antigenerkennung zu pr{\"u}fen. Da bisher keine Antigene f{\"u}r g/d T Zellen der Ratte bekannt sind, wurden die Antigen bindenden Regionen des g/d TCR analysiert. Bei Antigenrezeptoren von Mensch und Maus bestehen n{\"a}mlich charakteristische L{\"a}ngenunterschiede zwischen den mit dem Antigen interagierenden CDR3-Proteinschleifen (englisch: complementarity determining regions), die in der Verkn{\"u}fungsregion der V-, D- und J-Gensegmente codiert sind. Bei Maus und Mensch sind die CDR3-L{\"a}ngen der TCRd-Kette {\"a}hnlich variabel und etwa so lang wie bei der schweren Kette des B Zellrezeptors. Dagegen sind die CDR3-Regionen der TCRb-Kette sehr kurz, was wahrscheinlich durch die notwendige Interaktion des MHC-Peptid-Komplexes mit allen drei CDR-Schleifen bedingt wird. Daraus wurde geschlossen, daß die Bestimmung der CDR3d-L{\"a}ngen Aussagen {\"u}ber eine m{\"o}gliche MHC-Restriktion von g/d T Zellen der Ratte erlauben sollte. Zur Durchf{\"u}hrung der CDR3d-L{\"a}ngenanalysen wurde die Methode des Spektratyping etabliert. Hierf{\"u}r wurden in der Milz h{\"a}ufig vorkommende TCRd V-Gensegmente (DV105 und f{\"u}nf Mitglieder der ADV7-Familie) partiell kloniert und sequenziert. In CD8 positiven und negativen g/d T Zellen wurden sowohl DV105 als auch Mitglieder der ADV7-Familie jeweils etwa gleich h{\"a}ufig exprimiert. Spektratyp-Analysen ergaben in g/d T Zellen der Ratte f{\"u}r beide V-Genfamilien etwas l{\"a}ngere CDR3d-Schleifen als bei der Maus; CD8ab positive, CD8aa positive und CD8 negative g/d T Zellen der Ratte besaßen identische L{\"a}ngenspektren. Demnach kann man die CD8ab-Expression von g/d T Zellen der Ratte nicht als Hinweis auf eine der klassischen MHC-Restriktion {\"a}hnliche Antigenerkennung werten. Als spezifische Eigenschaft von g/d T Zellen der Ratte wurde eine Modulation der CD8b-Genexpression nachgewiesen, die mit der St{\"a}rke des Aktivierungssignals zunahm. Nach Aktivierung in vitro exprimierte ein großer Teil zuvor CD8ab positiver g/d T Zellen nur noch das CD8aa-Homodimer, das auf MHC I restringierten a/b T Zellen deutlich schlechtere Korezeptoreigenschaften aufweist als das CD8ab-Heterodimer. Die Modulation war irreversibel, fand pr{\"a}translational statt und zeigte keine Einfl{\"u}sse auf Effektorfunktionen der g/d T Zellen wie Interferon-g-Produktion oder zytotoxische F{\"a}higkeiten. {\"U}ber die physiologische Bedeutung dieser Modulation kann nur spekuliert werden, doch k{\"o}nnte sie ein Mechanismus sein, um den Schwellenwert f{\"u}r Signale einer erneuten T Zellaktivierung zu erh{\"o}hen. Dar{\"u}ber hinaus limitiert sie den Nutzen der CD8ab-Expression als Marker f{\"u}r die thymisch gereifte Linie von g/d T Zellen.},
  subject      = {Antigen CD8},
  language  = {de}
}