@phdthesis{Wassermann2005, author = {Wassermann, Veronika}, title = {Ueber die Beteiligung der Hitzeschockproteine HSP27 und HSP70 an einer Resistenz, Resistenzentwicklung unter CMF-Therapie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12292}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Ein Problem der Therapie maligner Tumore ist die Resistez gegen{\"u}ber Chemotherapeutika. Diskutiert wird ein Zusammenhang zur Expression von Hitzeschockproteinen (HSP). Insbesondere das in Mamma-Karzinomen stark exprimierte HSP27 und HSP70 scheinen hier beteiligt. Hitzeschockproteine sind Teil eines durch Noxen induzierten Mechanismus, welcher Schutz vor weiterer Noxenexposition verleiht, also die entsprechenen Zellen im Unterschied zu nicht exponierten Kontrollzellen zu {\"u}berleben bef{\"a}higt. Es kommt nach einem Streßereignis zu einer Ver{\"a}nderung von Zelltod unter nachfolgenden Bedingungen, z.B. Verh{\"u}tung von Apoptose (physiologischer Zelltod). Tumortherapie mittels Zytostatika stellt eine „kontrollierte Apoptose" dar. Ziel dieser Therapie muß es also folglich sein, eine HSP-Induktion zu vermeiden, da eine solche den Therapieerfolg und Benefit f{\"u}r den Patienten schm{\"a}lert. Die Exposition einer Tumorzelle mit einem chemotherapeutisch wirksamen Medikament bedeutet f{\"u}r diese Zelle toxischen/oxidativen Streß, den sie nur durch Induktion entsprechender Abwehrmechanismen {\"u}berleben kann. Diese Mechanismen haben letztlich einen wesentlichen Einfluß auf die Wirksamkeit des Medikamentes und Profit des Patienten durch die ihm angebotene Therapie. Eine fr{\"u}he adaptive Zellantwort von S{\"a}ugerzellen auf toxische Einfl{\"u}sse stellt die Expression von Hitzeschockproteinen dar. Den Fokus der vorliegenden Untersuchungen stellen einerseits diejenigen Substanzen dar, welche heutzutage in der Therapie des Mamma-Karzinoms eingesetzt werden, den drei Einzelsubstanzen des CMF-Protokolls Methotrexat, 5-Fluorouracil und Cyclophosphamid, andererseits die Hitzeschockproteine mit der h{\"o}chsten bekannten Bedeutung f{\"u}r Tumorwachstum. In einem ersten Schritt wurde in vitro mit einem Zellsystem, welches durch Transfektion mit dem humanen hsp27-Gen bei bekannter HSP70-Induzierbarkeit als einfaches isoliertes Zellsystem ein gutes Werkzeug zur spezifischen Untersuchung dieser beiden Proteine darstellt, untersucht werden, inwieweit sich diese speziellen Proteine durch die unterschiedlichen Substanzgruppen des CMF-Protokolls induzieren lassen. Es wurde also nach einer adaptiven Zellantwort in Form einer Induktion von HSP27 und HSP70 nachfolgend einer Noxenexposition gesucht werden. In einem zweiten Schritt wurde untersucht, ob die f{\"u}r diese beiden HSPs postulierte zytoprotektive Eigenschaften auch f{\"u}r Zytostatika gelten. Es wurde {\"u}berpr{\"u}ft , inwieweit Chemotherapeutika unter dem Einfluß von HSP70 und HSP27 stehen, also inwieweit die Expression von HSP27 und HSP70 einen Zellschutz gegen toxischen Streß (durch CMF) in den verwendeten L929-Mausfibroblasten darstellen kann.}, language = {de} } @phdthesis{Stingl2012, author = {Stingl, Lavinia}, title = {Die Bedeutung des Hitzeschockproteins HSP90 f{\"u}r die Strahlenempfindlichkeit von Tumorzellen unterschiedlicher Entit{\"a}ten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71984}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Krebs ist die zweith{\"a}ufigste Todesursache in Deutschland. F{\"u}r die Behandlung von Tumorerkrankungen wird unter anderen die Strahlentherapie angewendet. Allerdings ist die Wirkung der Bestrahlung durch die Radiotoxizit{\"a}t auf normalem Gewebe sowie durch die Radioresistenz vieler Tumoren bei klinisch relevanten Dosen limitiert. Ein vielversprechendes Target f{\"u}r die Radiosensibilisierung von Tumorzellen scheint das Hitzeschockprotein HSP90 zu sein, ein wichtiges molekulares Chaperon, das f{\"u}r die Faltung, Aktivierung, Translokation und Degradation der so genannten Klientenproteine zust{\"a}ndig ist. Durch die pharmakologische Blockierung seiner Funktion wird die simultane Degradation multipler HSP90 Klientenproteine eingeleitet, darunter Radioresistenz-assoziierte Proteine wie RAF-1, AKT, EGFR, Survivin, DNA-Reparaturproteine. Verschiedene Studien belegen das Potential der HSP90 Inhibitoren Geldanamycin und seiner Derivaten als Radiosensibilisatoren. Im Gegensatz zu diesen Substanzen sind die neuartigen HSP90 Inhibitoren NVP-AUY922 und NVP-BEP800 wasserl{\"o}slich und nicht hepatotoxisch. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Wirkung von NVP-AUY922 und NVP-BEP800 (200 nM, 24 h vor der Bestrahlung) auf die Strahlenempfindlichkeit humaner Tumorzelllinien unterschiedlicher Entit{\"a}ten, darunter eine Lungenkarzinomzellinie A549, eine Fibrosarkomzelllinie HT1080, sowie zwei Glioblastomzelllinien GaMG und SNB19, untersucht. Die neuartigen HSP90 Inhibitoren zeigten in Kolonietest eine strahlensensibilisierende Wirkung in allen getesteten Tumorzelllinien. Weiterhin wurde mit diversen Methoden den Mechanismus der Radiosensibilisierung untersucht. Die HSP90 Inhibition erh{\"o}hte den Anteil der Zellen mit hypodiploiden DNA-Gehalt in den meisten untersuchten Tumorzelllinien. Außerdem induzierte die HSP90 Inhibition die Depletion der anti-apoptotischen Proteine AKT, pAKT und RAF-1 in allen Tumorzelllinien. Wie die erh{\"o}hte Expression von beiden Apoptosemarkern, aktivierte Caspase-3 und inaktiviertes PARP, nahe legt, wurde verst{\"a}rkt die Caspase-abh{\"a}ngige Apoptose in den meisten untersuchten Tumorzelllinien nach HSP90 Inhibition eingeleitet. Laut Comet Assay induzierte die HSP90 Inhibition eine geringere DNA-Fragmentierung in bestrahlten Tumorzellen, gleichzeitig konnte aber eine langsamere Restitution der chromosomalen DNA festgestellt werden. {\"U}ber die Messungen der γH2AX-Expression als Marker f{\"u}r DNA-Doppelstrangbr{\"u}che konnte eine erh{\"o}hte Induktion von DNA-Sch{\"a}den nach HSP90 Inhibition und Bestrahlung sowie eine verlangsamte Reparatur der induzierten DNA-Sch{\"a}den gemessen werden. Diese korrelierte mit der Depletion der DNA-Reparaturproteine KU70/KU80. Die HSP90 Inhibition f{\"u}hrte zus{\"a}tzlich zu einem ausgepr{\"a}gten G2/M-Arrest, der durch die Bestrahlung verst{\"a}rkt werden konnte. NVP-AUY922 induzierte außerdem eine Depletion der S-Phase. Die Depletion der Zellzyklus-regulierenden Proteine CDK1 und CDK4 sowie pRB korrelierte mit den beobachteten Zellzyklusst{\"o}rungen. Die hier gewonnenen Ergebnisse verdeutlichen, dass der komplexe Mechanismus der Radiosensibilisierung nach HSP90 Inhibition die simultane Degradation diverser HSP90 Klientenproteine involviert, was verschiedene zellul{\"a}re Auswirkungen hat: verlangsamte Zellteilung durch anhaltende Zellzyklusst{\"o}rungen, erh{\"o}hte DNA-Sch{\"a}den und Verlangsamung der Reparatur der DNA-Sch{\"a}den nach Bestrahlung sowie Apoptoseinduktion. Die HSP90 Inhibition induzierte gleichzeitig die Expression der Hitzeschockproteine HSP90 und HSP70, deren anti-apoptotischen Funktionen die radiosensibilisierenden Effekte der HSP90 Inhibitoren vermindern k{\"o}nnen. In dieser Arbeit wurden zwei Strategien getestet, um die Hochregulation von HSP90/HSP70 nach HSP90 Inhibition in den Tumorzelllinien A549 und GaMG zu unterdr{\"u}cken. Zum einen wurden siRNAs gegen die stressinduzierbare α-Isoform von HSP90 angewendet, zum anderen wurde KNK437, eine Substanz die die Expression der HSP auf Transkriptionsebene unterdr{\"u}ckt, eingesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Transfektion mit siRNA gegen HSP90α gefolgt von NVP-AUY922 die Hochregulation von HSP90α um circa 50\% unterdr{\"u}ckte. Allerdings wurde dadurch keine Erh{\"o}hung der NVP-AUY922-vermittelten Radiosensibilisierung erreicht. Es wurden außerdem keine signifikanten Ver{\"a}nderungen betreffend der Induktion und Reparatur der DNA-Sch{\"a}den, Zellzyklusverteilung, Apoptoseinduktion sowie Expression der getesteten HSP90 Klientenproteine im Vergleich zu alleiniger HSP90 Inhibition festgestellt. Im dritten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die simultane Behandlung mit NVP-AUY922 und KNK437 die NVP-AUY922-vermittelte Hochregulation von HSP90 und HSP70 in beiden Tumorzelllinien tempor{\"a}r unterdr{\"u}ckt. Obwohl die alleinige Behandlung mit KNK437 in der A549-Tumorzelllinie laut Kolonietest radiosensibilisierend wirkte, konnte die simultane Behandlung mit beiden Inhibitoren die NVP-AUY922-vermittelte Radiosensibilisierung nicht erh{\"o}hen. Obwohl die Unterdr{\"u}ckung der Stressantwort nach HSP90 Inhibition mittels KNK437 in beiden Tumorzelllinien einen anhaltenden G2/M-Arrest induzierte, blieb die Expression der anti-apoptotischen HSP90-Klientenproteine AKT und RAF-1 unver{\"a}ndert im Vergleich zu NVP-AUY922. Außerdem wurde die inhibierende Wirkung von NVP-AUY922 auf die Reparatur der strahleninduzierten DNA-Sch{\"a}den nicht erh{\"o}ht. Die hier gezeigten in vitro Ergebnisse unterst{\"u}tzen die Anwendung von NVP-AUY922 und NVP-BEP800 f{\"u}r in vivo Studien sowie in klinischen Studien alleine oder in Kombination mit der Bestrahlung. Unsere Arbeit ist von besonderem Interesse f{\"u}r die Strahlentherapie, da NVP-AUY922 bereits in klinischen Studien getestet wird.}, subject = {Hitzeschockprotein}, language = {de} } @phdthesis{Redel2004, author = {Redel, Andreas}, title = {Charakterisierung der kardialen Funktion des Stressproteins alpha-B-Crystallin am isolierten Papillarmuskel der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11984}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Eine famili{\"a}re Myopathie und Kardiomyopathie, der eine Missense-Mutation des alpha-B-Crystallin-Gens zugrunde liegt, weist auf eine wichtige Bedeutung des Stressproteins alpha-B-Crystallin im Herzen hin. Die chaperone-{\"a}hnlichen Eigenschaften von alpha-B-Crystallin und die unter kardialer Isch{\"a}mie zu beobachtende schnelle Translokation vom Zytosol an das elastische Titin-Filamentsystem lassen eine protektive Rolle von alpha-B-Crystallin unter Stressbedingungen vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine eventuelle kardioprotektive Funktion von alphaB-Crystallin durch die Charakterisierung alpha-B-Crystallin gendeletierter M{\"a}use nachzuweisen. Wir etablierten hierf{\"u}r ein Versuchssystem zur Untersuchung der Kontraktilit{\"a}t isolierter Papillarmuskeln im Organbad. Im Rahmen des Aufbaus unseres Versuchssystems untersuchten wir zun{\"a}chst den Einfluss der Ca2+-Konzentration, der Temperatur und der Kontraktionsbedingungen (Auxotonie vs. Isometrie) auf die Kraft-Frequenz-Beziehung von murinem Myokard. Wir konnten zeigen, dass die Kraft-Frequenz-Beziehung von Myokardpr{\"a}paraten der Maus von den genannten Versuchsbedingungen abh{\"a}ngig ist. Bei niedrigen Ca2+-Konzentrationen und Temperaturen ([Ca2+] = 1,0 mM, Temp. = 27 °C) ist sie positiv, flacht bei zunehmender Ca2+-Konzentration und Temperatur ab und ist f{\"u}r [Ca2+] = 5,0 mM, Temp. = 37 °C negativ. Auxotone Kontraktionsbedingungen f{\"u}hren im Vergleich zu isometrischen bei gleichen Ca2+-Konzentrationen und Temperaturen zu einem flacheren Verlauf der Kraft-Frequenz-Beziehung. Unter ann{\"a}hernd physiologischen Bedingungen verl{\"a}uft die Kraft-Frequenz-Beziehung des M{\"a}use-Myokards flach bis leicht positiv. Im Gegensatz zum Menschen scheinen somit bei der Maus f{\"u}r eine Steigerung des Herz-Zeit-Volumens andere Mechanismen als eine positive Kraft-Frequenz-Beziehung von Bedeutung zu sein. Hierbei ist insbesondere der Frank-Starling-Mechanismus und die sympathoadrenerge Innervation des Herzens zu erw{\"a}hnen. Zur Charakterisierung der kardialen Funktion von alphaB-Crystallin untersuchten wir die Kontraktilit{\"a}t isolierter Papillarmuskeln von Wildtyp- und alpha-B-Crystallin gendeletierten M{\"a}usen unter simulierter Isch{\"a}mie (Glucose- und Sauerstoffentzug) und Reperfusion im Organbad. Unter Kontrollbedingungen zeigten sich zwischen wt- und alpha-B-/- Muskeln keine Unterschiede in der Zuckungskraft, der Geschwindigkeit der Kraftentwicklung und der Relaxationszeit. Die w{\"a}hrend der 20-min{\"u}tigen simulierten Isch{\"a}mie entwickelte Kontraktur setzte jedoch bei den alpha-B-/- Muskeln signifikant fr{\"u}her ein und verlief signifikant st{\"a}rker als bei wt-Muskeln. Nach einer 60-min{\"u}tigen Reperfusionsphase blieb die Kontraktur der alpha-B-/- Muskeln im Vergleich zu wt-Muskeln signifikant erh{\"o}ht. Bez{\"u}glich Zuckungskraft, Geschwindigkeit der Kraftentwicklung und Relaxationszeit zeigten sich weder w{\"a}hrend noch nach simulierter Isch{\"a}mie deutliche Unterschiede zwischen den Muskeln beider M{\"a}usest{\"a}mme. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das Fehlen von alpha-B-Crystallin am Gesamtherz nicht zu einer St{\"o}rung der systolischen Herzfunktion, sondern zu einer eingeschr{\"a}nkten myokardialen Relaxationsf{\"a}higkeit unter Isch{\"a}mie und Reperfusion f{\"u}hren w{\"u}rde. Da alpha-B-Crystallin unter kardialer Isch{\"a}mie an das elastische Titin-Filamentsystem bindet, k{\"o}nnten die elastischen Eigenschaften des Myokards unter Isch{\"a}mie durch einen Mangel an alpha-B-Crystallin derart beeintr{\"a}chtigt werden, dass es zu einer h{\"o}heren Rigidit{\"a}t der Muskulatur kommt. Eine Funktion von alpha-B-Crystallin im Herzen ist somit m{\"o}glicherweise die Aufrechterhaltung der elastischen Eigenschaften des Myokards unter kardialer Isch{\"a}mie und Reperfusion.}, language = {de} }