@phdthesis{Roth2021,
  author    = {Roth, Bernhard},
  title     = {Entwicklung von Plasmiden mit multiplen short hairpin RNA-Expressionskassetten f{\"u}r den simultanen Knockdown onkogener Zielstrukturen im Multiplen Myelom},
  doi       = {10.25972/OPUS-21946},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-219464},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Zielvorgabe dieser Dissertation stellte die Konstruktion eines Plasmides mit mehreren shRNA-Expressionskassetten f{\"u}r den simultanen Knockdown onkogener Zielstrukturen im Multiplen Myelom dar. Es sollte sich zudem um ein Konstrukt handeln, bei dem ein beliebig h{\"a}ufiges Einf{\"u}gen oder Ersetzen von Expressionskassetten durch einfache Klonierungsschritte m{\"o}glich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Plasmide mit bis zu vier unterschiedlichen shRNA-Expressionskassetten konstruiert und getestet. Mittels Elektroporation und anschließender Analyse der Knock-down-Effizienz im Western Blot konnte beispielhaft an Proteinen des MEK-ERK-Signalweges gezeigt werden, dass mithilfe der klonierten Plasmide die Spiegel von mindestens vier Zielproteinen gleichzeitig herunterreguliert werden k{\"o}nnen, ohne dass es dabei zu Einschr{\"a}nkungen im Vergleich zur Verwendung von Einzel-shRNA-Expressionsvektoren kommt. Es konnte gezeigt werden, dass weder die zunehmende Menge an hintereinander klonierten Kassetten noch die Reihenfolge der einzelnen Expressionskassetten im Plasmid einen negativen Einfluss auf das Knock-down-Ergebnis haben. Dieses Ergebnis konnte in verschiedenen Zelllinien des Multiplen Myeloms best{\"a}tigt werden. Die Vorteile des Verfahrens liegen vor allem in der Kosteneffizienz, der einfachen Herstellung und Modifikation, sowie der niedrigen biologischen Sicherheitsstufe der Versuchsschritte. Bedeutend ist zudem die Vermeidung von toxischen Effekten, welche das Einbringen von Fremd-DNA in Zellen ab gewissen Mengen mit sich bringt, durch Klonierung aller shRNA-Expressionskassetten zu lediglich einem Plasmidkonstrukt. Einschr{\"a}nkungen erf{\"a}hrt die etablierte Methodik dadurch, dass die zu untersuchenden Zellen sich f{\"u}r die Transfizierung mit Plasmiden eigenen m{\"u}ssen und ein Verfahren der Selektion transfizierter von nativen Zellen verf{\"u}gbar sein muss. Durch genannte Vorteile stellt das Konstrukt jedoch ein hervorragendes Mittel zur Erforschung zellul{\"a}rer Signalwege und ihrer Interaktionen weit {\"u}ber die Erkrankung des Multiplen Myeloms hinaus dar. Es kann zudem als kosteng{\"u}nstige molekulare Methode zur Identifizierung neuer pharmakologischer Angriffspunkte bei Tumorerkrankungen dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden in Folgeversuchen genutzt um eine stabile Integration der shRNA-Expressionskassetten in die zellul{\"a}re DNA sowie eine pharmakologische Induzierbarkeit zu erreichen. Es konnte somit der Sprung von den transienten Knock-down-Versuchen dieser Arbeit hin zur langfristig verminderten Proteintranslation geschafft werden. Am Ende dieser Arbeit verblieb zu eruieren, inwieweit die Anzahl der shRNA-Expressionskassetten {\"u}ber die getestete Anzahl von vier erweiterbar w{\"a}re und ob die guten Erfahrungen mit dieser Methodik auch bei anderen Arten von Tumorzellen replizierbar sind. Das etablierte Vektorsystem k{\"o}nnte in k{\"u}nftigen Versuchen zur schnellen Erforschung bisher wenig untersuchter oder unbekannter Signalwege dienen.},
  subject      = {RNS-Interferenz},
  language  = {de}
}