@phdthesis{Mourad2019,
  author    = {Mourad, Caroline},
  title     = {RNA-Interferenz humaner Nat{\"u}rlicher Killer-Zellen unter Einf{\"u}hrung von siRNA mittels Lipofektion und Elektroporation},
  doi       = {10.25972/OPUS-18545},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-185458},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Als Teil des angeborenen Immunsystems spielen Nat{\"u}rliche Killer(NK)- Zellen eine entscheidende Rolle in der Interaktion mit Pathogenen und Tumorzellen. Mithilfe der RNA-Interferenz bestimmter Gene wie beispielsweise CD56 k{\"o}nnten Hinweise auf die genaue Funktionsweise der NK-Zellen gewonnen werden. Ziel dieser Arbeit war es eine geeignete Transfektionsmethode zum Einf{\"u}hren von siRNA in NK-Zellen zu finden, welche eine hohe Transfektionseffizienz bei gleichzeitig hoher Zellviabilit{\"a}t aufweist. Hierf{\"u}r wurden drei verschiedene Lipofektionsreagenzien und sechs verschiedene Elektroporationsprogramme verglichen. Zun{\"a}chst wurde die Transfektionseffizienz mit an AF488 gekoppelter negativer siRNA per Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie evaluiert und jeweils das effizienteste Lipofektionsreagenz bzw. Elektroporationsprogramm ausgew{\"a}hlt. Mit diesen wurde anschließend eine Herunterregulation des CD56-Gens mit CD56-siRNA per RNA-Interferenz versucht. Die CD56-Gen-Expression wurde auf Proteinebene per Durchflusszytometrie und auf mRNA-Ebene per PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) evaluiert.},
  subject      = {RNS-Interferenz},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Endter2008,
  author    = {Endter, J{\"o}rg-Michael},
  title     = {Mechanismen der Elektropermeabilisierung und Elektrofusion eukaryotischer Zellen und Protoplasten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29647},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {In dieser Arbeit konnten grundlegende Erkenntnisse {\"u}ber die Wirkung elektrischer Felder auf Membranen von eukaryotischen Zellen gewonnen werden. Dieses Wissen erm{\"o}glichte eine detaillierte Aufkl{\"a}rung der Mechanismen der Elektropermealisierung und der Elektrofusion. Maßgeblich hierf{\"u}r war die dielektrische Analyse von Pflanzen- bzw. Hefeprotoplasten durch umfassende Messungen auf Basis der Elektrorotationsmethode. Mithilfe dieser Methode wurden die elektrischen Eigenschaften wie die fl{\"a}chenspezifische Membrankapazit{\"a}t und die innere Leitf{\"a}higkeit von Pichia pastoris Protoplasten ermittelt. Die Kenntnis dieser Zelleigenschaften verhalf dazu, einerseits das Sammelfeld im Hinblick auf seine Feldst{\"a}rke und Frequenz einzustellen. Damit wurde ein optimaler Kontakt der Zellmembranen w{\"a}hrend der Fusion erm{\"o}glicht und st{\"o}rende Einfl{\"u}sse, wie beispielsweise die Multizellrotation, minimiert. Anderseits wurde der Durchbruchpuls bez{\"u}glich der Pulsl{\"a}nge und der Feldst{\"a}rke den Anforderungen f{\"u}r die Elektrofusion der relativ kleinen Protoplasten angepasst. In Folge dessen war es m{\"o}glich, ein Protokoll zur Herstellung von Riesenzellen aus Pichia pastoris Protoplasten zu erstellen. Diese Erkenntnisse sind besonders interessant, da der Einsatz von Riesenzellen die Erforschung der aktiven elektrischen Eigenschaften von Zellmembranen durch kombinierte Anwendung intrazellul{\"a}rer Mikroelektroden mit etablierten elektrophysiologischen Techniken erm{\"o}glicht. Als Beispiele seien hier „current-„ und „voltage-clamp", „patch clamp" sowie die Ladungspulsmethode genannt. Die erhebliche Vergr{\"o}ßerung der Membranoberfl{\"a}che bei Riesenzellen f{\"u}hrt zu einer Erh{\"o}hung der Gesamtzahl von Membranproteinen wie beispielsweise Transmembrankan{\"a}le. Daher kann erwartet werden, dass kanalvermittelte Signale deutlich st{\"a}rker ausfallen und ihre Untersuchungen erleichtert werden. Die komplexen Ergebnisse der Elektrorotation von vakuolisierten BY-2 Protoplasten konnten sehr genau mit Hilfe des Dreischalenmodells erkl{\"a}rt werden, welches die Struktur der pflanzlichen Zellen, insbesondere die zwei seriell geschalteten Kapazit{\"a}ten des Plasmalemmas und des Tonoplasten, ber{\"u}cksichtigt. Die Anwendung dieses Modells erlaubte eine getrennte Berechnung der Potentialprofile {\"u}ber das Plasmalemma (Up) und den Tonoplasten (Ut), welche durch einen kurzen Gleichstrompuls induziert wurden. Anhand dieser Potentialprofile war es m{\"o}glich, die Abh{\"a}ngigkeit des Ca2+-Einstromes in das Cytoplasma aus der Vakuole oder dem extrazellul{\"a}ren Raum vom applizierten elektrischen Feld und der externen Leitf{\"a}higkeit zu erkl{\"a}ren. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Aufladung des Plasmalemmas und des Tonoplasten und daraus folgend der elektrischen Membrandurchbruch der jeweiligen Membran stark von der externen Leitf{\"a}higkeit abh{\"a}ngen. Die Tatsache, dass elektrische Pulssequenzen von niedriger Intensit{\"a}t einen erhebliche Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration bewirken k{\"o}nnen und sich durch Modulation ihrer Amplitude reizspezifische Ca2+-Signaturen simulieren lassen, er{\"o}ffnet eine schonende M{\"o}glichkeit zur Untersuchung von Ver{\"a}nderungen des cytosolischen Ca2+-Spiegels unabh{\"a}ngig von persistierenden exogenen Stimuli. Da Ca2+ in Pflanzen ein wichtiger „second messenger" ist, bieten sich elektrische Felder als neues wirksames Werkzeug zur Kontrolle zellinterne Signalwege f{\"u}r die Grundlagenforschung sowie f{\"u}r Anwendungen in der Biotechnologie, wie beispielsweise Elektrotransfektion und -fusion, an. Als wichtige Konsequenz kann aus den hier gewonnen Erkenntnissen gezogen werden, dass Behandlungen pflanzlicher Zellen mit elektrischen Feldern in niedrig leitende Medien durchgef{\"u}hrt werden, um eine minimale Freisetzung von Ca2+ und anderen Inhaltstoffen aus der Vakuole zu gew{\"a}hrleisten.},
  subject      = {Elektrofusion},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Keller2007,
  author    = {Keller, Christian},
  title     = {The role of dendritic cells in the immunoregulation of leishmaniasis - transfection of dendritic cells with mRNA encoding a molecularly defined parasitic antigen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26208},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die kutane Leishmaniose ist eine Infektionskrankheit, die besonders in tropischen und W{\"u}stenregionen endemisch ist, mit einer Inzidenz von 1,5 Millionen F{\"a}llen im Jahr und einer Pr{\"a}valenz von 12 Millionen Infizierten weltweit. Die Infektion kann durch den intrazellul{\"a}ren Parasiten Leishmania major hervorgerufen werden. Am Mausmodell ist die Krankheit ausf{\"u}hrlich untersucht. Wie dabei deutlich wurde, ist f{\"u}r die Immunit{\"a}t gegen den Erreger die Induktion einer Klasse von Interferon (IFN)-\&\#61543;-produzierenden CD4+ T-Helfer-Zellen (TH1-Zellen) entscheidend, welche Makrophagen dazu aktivieren, die von ihnen beherbergten Parasiten abzut{\"o}ten. Die Umlenkung der Immunantwort in Richtung einer sch{\"u}tzenden TH1-Antwort wird auch der Schl{\"u}ssel zu einem effektiven Impfstoff sein. Ex vivo mit Leishmanienantigenen beladene dendritische Zellen sind vor einiger Zeit als Vakzine gegen L. major-Infektionen beschrieben worden. Ein einzelnes rekombinantes Antigen, LeIF (Leishmania homologue of eukaryotic ribosomal initiation factor 4a), ein parasit{\"a}res Protein, das die IL-12-Produktion durch dendritische Zellen stimuliert und das als mikrobiell konserviertes Strukturmolek{\"u}l (pattern-associated molecular pattern; PAMP) diskutiert wird, vermittelte dabei, zum Pulsen von dendritischen Zellen verwendet, einen sch{\"u}tzenden TH1-abh{\"a}ngigen Effekt. Der Einsatz rekombinanter Proteine ist jedoch mit etlichen Nachteilen verbunden, weshalb andere Methoden zur Verabreichung von Antigenen entwickelt wurden. Aus der Tumorforschung ist unl{\"a}ngst die RNA-Elektroporation dendritischer Zellen als eine sichere und vielseitige Methode hervorgegangen, bei der eine große Anzahl von RNA-Molek{\"u}len, die f{\"u}r ein bestimmtes Antigen kodieren, durch einen elektrischen Impuls in das Cytosol dendritischer Zellen gelangt. Die vorliegende Arbeit beschreibt zum ersten Mal die Transfektion dendritischer Zellen mit RNA eines molekular definierten Parasitenantigens. Zun{\"a}chst erfolgte die Etablierung eines standardisierten Protokolls f{\"u}r die RNA-Transfektion mit dem enhanced green fluorescent protein (EGFP) als Reporterantigen. EGFP-RNA war gut translatierbar in einem In-vitro-Translationssystem, und es konnten sowohl eine Zellinie (fetal skin-derived dendritic cells; FSDC) als auch prim{\"a}re, aus Knochenmarkkulturen der Maus gewonnene dendritische Zellen (bone marrow-derived dendritic cells; BMDC) mit einem Anteil von bis zu 90\% bzw. 75\% effizient EGFP-transfiziert werden. In beiden Zelltypen wurde die maximale Transfektionseffizienz mit 20 µg RNA erreicht, die mit gr{\"o}ßeren Mengen an RNA nicht weiter zu steigern war. Die H{\"o}he der Antigenexpression, gemessen als mittlere Fluoreszenzintensit{\"a}t (MFI) in der Durchflußzytometrie, war direkt proportional zur verwendeten RNA-Menge. In FSDC waren die Transfektionseffizienz und die MFI generell h{\"o}her als in BMDC bei gleicher RNA-Menge. Zudem konnte gezeigt werden, daß eine Behandlung mit LPS die Kinetik beeinflußt: Die maximale Expression war h{\"o}her und wurde auch eher erreicht, worauf zudem ein schnellerer Abfall folgte. In den Transfektionsexperimenten mit LeIF wurden zwei Varianten von LeIF-RNA verwendet: eine f{\"u}r die gesamte LeIF-Sequenz kodierende LeIF(fl)-RNA, und eine nur f{\"u}r die aminoterminale H{\"a}lfte der LeIF-Sequenz (226 Aminos{\"a}uren), dem immunogenen Teil des LeIF-Molek{\"u}ls, kodierende LeIF(226)-RNA. Im Western Blot von Ganzzellysaten dendritischer Zellen war nur LeIF(fl) nach Transfektion nachzuweisen, wohingegen LeIF(226) in LeIF(226)-transfizierten BMDC nie nachzuweisen war. Da beide Konstrukte aber gut im zellfreien System translatierbar waren, stellte der fehlgeschlagene Nachweis von LeIF(226) kein Fehlschlagen der RNA-Translation, sondern vielmehr einen raschen Antigenabbau dar. Es bestand daher die Erwartung, daß LeIF(226)-transfizierte BMDC trotzdem in der Lage sein m{\"u}ßten, von LeIF(226) abgeleitete antigene Peptide an T-Zellen von mit rekombinantem LeIF (rLeIF) immunisierten BALB/c-M{\"a}usen zu pr{\"a}sentieren. Diese Vermutung wurde durch Messung von IFN-\&\#61543; in Stimulationsversuchen mit BMDC und T-Zellen best{\"a}tigt, die zeigten, daß am Tag 7 der Kultur mit rLeIF gepulste, LeIF(226)- und LeIF(fl)-transfizierte BMDC in der Tat antigenspezifisch T-Zellen aus LeIF-immunisierten M{\"a}usen aktivierten. IL-4 hingegen wurde nicht produziert, was mit der Tatsache vereinbar ist, daß in Lymphknoten LeIF-vakzinierter M{\"a}usen haupts{\"a}chlich T-Zellen vom TH1-Typ zu finden sind. In den {\"U}berst{\"a}nden LeIF-transfizierter BMDC-Kulturen, im Gegensatz zu rLeIF-gepulsten BMDC, waren die proinflammatorischen Zytokine IL-1\&\#946;, IL-6, IL-10 und IL-12 nicht nachzuweisen. Dieser Effekt lag nicht am Elektroporationsvorgang, da die Zytokinproduktion von mit rekombinantem LeIF elektroporierten BMDC nur teilweise beeintr{\"a}chtigt war. Die Expression von CD86 war nach LeIF-Transfektion zudem geringer als nach Pulsen mit rLeIF. LeIF-Transfektion f{\"u}hrte mithin nicht zur Reifung dendritischer Zellen. LeIF-transfizierte BMDC k{\"o}nnten im Ergebnis als antigenspezifische Toleranzinduktoren fungiert haben, mit regulatorischen T-Zellen als Respondern. Der Effekt der Transfektion mit LeIF-RNA auf die immunstimulatorische Wirkung von BMDC war nicht signifikant erh{\"o}ht, wenn BMDC am Tag 8 oder 9 der Kultur verwendet wurden. BMDC, die am Tag 8, und mehr noch am Tag 9 mit rLeIF gepulst wurden, induzierten hingegen eine energische T-Zell-Antwort. BMDC vom Tag 9 waren sogar in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren. Bevor eine starke, gegen LeIF gerichtete T-Zell-Antwort eingeleitet werden kann, m{\"u}ssen dendritische Zellen also letztlich - neben Pr{\"a}sentation des Antigens und Expression kostimulatorischer Molek{\"u}le - eine gewisse „Empfindlichkeit" gegen{\"u}ber dem Strukturmolek{\"u}l LeIF besitzen, die mit ihrem Reifungsalter in Zusammenhang steht. Dieses dritte Signal wird nicht durch intrazellul{\"a}res LeIF nach Transfektion mit LeIF-RNA {\"u}bermittelt, oder es wird unterdr{\"u}ckt. Dar{\"u}ber hinaus war nach Elektroporation von rLeIF die IL-12-Produktion von BMDC g{\"a}nzlich aufgehoben, die Produktion von IL-1\&\#61538; bei h{\"o}heren Antigendosen reduziert und die Produktion von IL-10 teilweise erh{\"o}ht. Die Produktion von IL-6 war unbeeinflußt. Dieses ver{\"a}nderte Zytokinprofil legt eine Doppelnatur von LeIF als PAMP nahe: Neben der bei extrazellul{\"a}rem Vorliegen von LeIF erwiesenen Eigenschaft, die Produktion von IL-12 zu stimulieren, welches die Resistenz des Wirtes gegen L. major steigert, k{\"o}nnte LeIF bei intrazellul{\"a}rem Vorliegen auch zu Evasionsmechanismen des Parasiten vor dem Immunsystem des Wirtes beitragen, m{\"o}glicherweise durch Wechselwirkung mit MAP (mitogen-activated protein)-Kinase-Signalwegen. Die Eigenschaften von LeIF als Adjuvans h{\"a}ngen also sowohl von der Verabreichungsmethode (Transfektion mit RNA bzw. Pulsen mit dem rekombinanten Protein) als auch vom Zielkompartiment (extra- bzw. intrazellul{\"a}r) ab. Zusammenfassend konnte also in dieser Arbeit gezeigt werden, daß BMDC mit einem Parasitenantigen transfizierbar sind. Das Antigen wird dabei prozessiert und pr{\"a}sentiert, aber von dendritischen Zellen nicht als PAMP erkannt. Durch Transfektion mit antigenkodierender mRNA alleine werden mithin nicht alle notwendigen Signale f{\"u}r die Induktion einer potenten Immunantwort {\"u}bermittelt.},
  subject      = {Elektroporation},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Friedrich2000,
  author    = {Friedrich, Uwe},
  title     = {Elektroporation von S{\"a}ugerzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1241},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Ziel der Arbeit war es, die wissenschaftlichen und technischen Voraussetzungen zu schaffen, um eine effiziente Elektroporation von großen aber auch kleinen Zellzahlen zu erreichen. Ein großer Teil der Arbeit diente der Entwicklung eines neuen Elektroporationsger{\"a}tes, des Multiporators. Die synergetischen Effekte dieser Technik tragen dazu bei, dass sehr hohe Ausbeuten bei der Elektrotransfektion von Zellen erzielt werden. Damit konnte zum ersten Mal der Gentransfer durch k{\"u}nstliche S{\"a}ugerzell-Chromosomen (MACs) nachgewiesen werden. Eine weitere Anwendung der Elektroporation liegt in der Transfektion von prim{\"a}ren Zellen. Dabei ist der entscheidende Punkt f{\"u}r eine hohe Transfektionseffizienz der Zellzyklus. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Konzept entwickelt, das als Basis f{\"u}r ein neues Elektroporationssystem benutzt werden kann.},
  subject      = {S{\"a}ugetiere},
  language  = {de}
}
@incollection{ZimmermannStopper1987,
  author    = {Zimmermann, U. and Stopper, Helga},
  title     = {Electrofusion and electropermeabilization of cells},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73065},
  publisher      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {1987},
  abstract  = {No abstract available.},
  subject      = {Elektrofusion},
  language  = {en}
}
@article{ZimmermannStopper1986,
  author    = {Zimmermann, U. and Stopper, Helga},
  title     = {Elektrofusion und Elektropermeabilisierung von Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-86865},
  year      = {1986},
  abstract  = {No abstract available.},
  subject      = {Elektrofusion},
  language  = {de}
}