@phdthesis{RombachgebGrosso2024, author = {Rombach [geb. Grosso], Franziska}, title = {Der Interaktionsrezeptor des Masernvirus auf h{\"a}matopoetischen Zellen}, doi = {10.25972/OPUS-35339}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-353394}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2024}, abstract = {Das Masernvirus (MV) kann in Erkrankten eine schwere, langanhaltende Immunsuppression verursachen, wodurch Infektionen mit opportunistischen Pathogenen beg{\"u}nstigt werden. Diese basiert auf einer Paralyse der h{\"a}matopoetischen Zellen, welche das Virus durch Kontakt eines viralen Glykoproteinkomplexes zu einem unbekannten RezeptorX auf der Zell- Oberfl{\"a}che induzieren kann. Kerncharakterisitika hiervon sind unter anderem die Herabregulation der Akt-Kinase-Phosphorylierung, die Inhibition der zellul{\"a}ren Proliferation und die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase 2 (NSM2). In einem kinetischen Phosphoproteom konnten zwei potentielle Interaktionsrezeptoren des MV identifiziert werden: CD43 und P2X3. Das hochglykosylierte Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}l CD43 ist auf h{\"a}matopoetischen Zellen ubiquit{\"a}r exprimiert und reguliert in T-Zellen deren {\"U}berleben, Proliferation, Aktivierung, Migration und Adh{\"a}sion. P2X3 wird in h{\"a}matopoetischen Zellen nur in geringem Maße exprimiert. Seine funktionelle Bedeutung ist in diesem Kompartiment nicht bekannt. Beide Kandidaten wurden mittels CRISPR/Cas9 Verfahren einzeln oder kombiniert aus Jurkat-T-Zellen ablatiert, welche nachfolgend nach MV-Kontakt hinsichtlich der oben erw{\"a}hnten MV-modulierten Parameter getestet wurden. Zus{\"a}tzlich wurden iso- und allosterische P2X3-Inhibitoren an prim{\"a}ren und Jurkat-T-Zellen verwendet, um dessen Rolle in Ca2+-Mobilisierung und Proliferation nach T-Zell-Rezeptor Co-Stimulation zu analysieren. Die genetische Depletion beider Rezeptor-Kandidaten verringerte die Effekte des MV auf alle getesteten Parameter signifikant, was darauf hindeutet, dass beide Proteine entscheidend an der T-Zell-Suppression beteiligt sind. W{\"a}hrend die isosterische Inhibition von P2X3 keinen Effekt hatte, wurde die Proliferation prim{\"a}rer T-Zellen durch dessen allosterische Inhibition vor Co-Stimulation fast verdoppelt und die Effizienz der Ca2+-Mobilisierung in Jurkat- und prim{\"a}ren T-Zellen signifikant erh{\"o}ht. In P2X3-depletierten Jurkat-Zellen hingegen war die Ca2+-Mobilisierung nach Stimulation signifikant geringer als in WT-Zellen. In dieser Arbeit konnten zwei wichtige Mediatoren der MV induzierten T-Zell-Suppression identifiziert werden. Vor allem P2X3, dessen Expression, Regulation und funktionelle Bedeutung im h{\"a}matopoetischen Kompartiment noch nicht erforscht wurde, k{\"o}nnte ein vielversprechender Kandidat f{\"u}r eine antivirale Therapie darstellen, da ein klinisch getesteter P2X3-Inhibitor bereits verf{\"u}gbar ist.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Pilgram2020, author = {Pilgram, Lisa}, title = {Produktion und pathophysiologische Bedeutung von Sphingosin-1-Phosphat in humanen dendritischen Zellen}, doi = {10.25972/OPUS-21021}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-210214}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Dendritische Zellen (DCs) sind als Zielzellen des MV f{\"u}r dessen Pathogenese von zentraler Bedeutung und f{\"o}rdern sowohl Dissemination und Transmission des Virus. Auf zellul{\"a}rer Ebene findet sich eine Modulation des Sphingolipidmetabolismus in MV-infizierten DC-Kulturen. S1P selbst ist ein bioaktives Sphingolipid, das {\"u}ber auto- und parakrine S1P-Rezeptorstimulation Funktion, Migration und Positionierung von Immunzellen, aber auch als intrazellul{\"a}rer Botenstoff Calcium-Haushalt, Apoptose und Proliferation reguliert. {\"U}ber die an der Vermittlung der intrazellul{\"a}ren S1P-Effekte beteiligten Strukturen ist bisher weniger bekannt und der S1P-Metabolismus einzelner Zellen trotz Kompartiment-abh{\"a}ngiger Schwankungen der S1P-Konzentrationen kaum adressiert. F{\"u}r murine DCs konnte eine kontinuierliche S1P-Produktion und Sekretion nachgewiesen werden. Ob dies auch auf humane DCs zutrifft und pathophysiologisch im Rahmen einer MV-Infektion moduliert wird, ist bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit wurde das Vorkommen S1Ps sowie dessen Metabolismus in humanen DCs quantitativ erfasst, und der Einfluss inflammatorischer, bakterieller und viraler (MV) Stimuli einbezogen. In Anbetracht der bekannten chemoattraktiven Potenz wurde nachfolgend der Beitrag S1Ps f{\"u}r die DC-induzierte T-Zellmigration untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass beide SphK Isoenzyme und auch die irreversibel degradierende SPL in humanen unreifen DCs (iDCs) auf mRNA-Ebene exprimiert werden. S1P konnte intrazellul{\"a}r nachgewiesen werden, eine mit Erythroyzten vergleichbare Speicherkapazit{\"a}t ist nicht anzunehmen. Unter bakteriell oder inflammatorisch vermittelter Ausreifung (mDCs) wurde eine Reduktion des S1P Gehalts in DCs beobachtet. Abweichend davon behielten insbesondere stark MV infizierte DC-Kulturen die hohen S1P-Spiegel unreifer DCs bei, was m{\"o}glicherweise neben der modulierten Chemokinsynthese und Oberfl{\"a}chenexpression ko-stimulatorischer Molek{\"u}le einen weiteren Parameter ihrer inkompletten Reifung nach MV Infektion reflektiert. Da die Ver{\"a}nderungen zwischen MV-infizierten DCs und mDCs nur f{\"u}r S1P, nicht aber f{\"u}r andere Sphingolipidmetaboliten messbar waren, liegt ihnen wohl eine Regulation der Sphingosinkinasen oder S1P degradierender Enzyme zugrunde. Bei unver{\"a}nderter Akkumulation der hierf{\"u}r spezifischen mRNAs m{\"u}sste dies auf Ebene der Translation, Stabilit{\"a}t oder Aktivit{\"a}t der Enzyme beruhen. Die indirekte Messung des extrazellul{\"a}ren S1Ps anhand der gegenl{\"a}ufigen S1P1-Dichte ließ vermuten, dass in DCs synthetisiertes S1P extrazellul{\"a}r wirken konnte. Es kann dabei autokrin auf DCs wirken, beispielsweise deren Motilit{\"a}t oder Genexpression regulieren, ist aber auch Voraussetzung zum Aufbau eines S1P-Gradienten und damit parakriner Regulation lymphozyt{\"a}rer Migrationsvorg{\"a}nge. Einen Beitrag S1Ps zur mDCs-induzierten T Zellchemotaxis konnte durch die erhobenen Daten mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Bez{\"u}glich der durch iDCs oder MV infizierte DCs induzierten T Zellchemotaxis konnte aufgrund experimenteller Limitationen keine abschließende Aussage zur Beteiligung S1Ps getroffen werden. Die T-Zellmigration auf DCs erwies sich im 2 D-System als gerichtete Bewegung. Weder Ausreifung noch MV-Infektion der DCs hatten Auswirkungen auf die Quantit{\"a}t der T-Zellmigration. Differentielle Expressionsmuster von Chemokinen in iDCs, mDCs und MV infizierten DCs sind jedoch bekannt und legen Variationen der Subset-Komposition innerhalb der migrierenden T Zellen nahe. Diese sollten gezielt in nachfolgenden Arbeiten untersucht werden. Zusammenfassend weist die vorliegende Arbeit eine kontinuierliche Synthese S1Ps in DCs mit Stimulus-abh{\"a}ngiger Fluktuation nach. Eine MV Infektion l{\"o}st dabei einen zu inflammatorischen und bakteriellen Stimuli divergenten Effekt auf den S1P-Gehalt aus mit m{\"o}glichen pathophysiologischen Konsequenzen. Eine Modulation der T Zellchemotaxis und damit der DC-T-Zell-Interaktion w{\"a}re im Rahmen inflammatorischer, bakterieller oder viraler Szenarien denkbar. Unter inflammatorischen und bakteriellen Bedingungen trug S1P jedoch nicht zur T-Zellchemotaxis bei, f{\"u}r MV blieb dies unklar. Dahingegen zeigten weitere Experimente der Arbeitsgruppe einen autokrin vermittelten Beitrag des intrazellul{\"a}r produzierten S1Ps zur Migration MV-infizierter DCs im respiratorischen Epithel und identifizierten damit einen bisher unbekannten Einflussfaktor einer erfolgreichen MV-Transmission.}, subject = {Dendritische Zelle}, language = {de} } @phdthesis{Lieberherr2019, author = {Lieberherr, Christina}, title = {Untersuchung der Wirkung potentieller Inhibitoren der Masernvirus-Infektion}, doi = {10.25972/OPUS-17675}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-176752}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {Die Infektion mit dem Masernvirus (MV) stellt weltweit immer noch ein großes Problem dar. Trotz des vorhandenen Lebendimpfstoffs, der eine Erkrankung sicher zu verhindern vermag, haben nicht nur die Entwicklungsl{\"a}nder, in denen ein fl{\"a}chendeckender Impfschutz schwieriger zu erreichen ist, mit der Erkrankung und ihren Komplikationen zu k{\"a}mpfen. Hat sich die Erkrankung klinisch manifestiert gibt es keine kausalen Therapiem{\"o}glichkeiten und es kann nur noch symptomatisch behandelt werden. Dies ist v.a. auch in Hinblick auf die schweren Komplikationen der Maserninfektion von Bedeutung. Bei Erstkontakt mit dem Masernvirus ist die Suszeptibilit{\"a}t nicht geimpfter Menschen sehr hoch. Das bedeutet, dass es in 95-98 \% der F{\"a}lle nach einer Infektion mit dem Masernvirus auch zum klinischen Bild der Masern kommt, unabh{\"a}ngig von Alter und Geschlecht. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, potentielle Hemmstoffe der Maserninfektion auf ihre Wirkung zu testen und zu verstehen, wo im Infektions- und Replikationszyklus des MV sie eingreifen. Es wurden eine Reihe Substanzen mit potentiell-inhibitorischen Eigenschaften in Infektions-Hemmtests und im Zytotoxizit{\"a}tstest untersucht, von denen im Anschluss die drei besten Inhibitoren (JK80, QD6-8 und Droseron) weiter untersucht wurden. JK80 und QD6-8 waren beide mit IC50-Werten um 30 µM und SI-Werten von {\"u}ber 2 nur m{\"a}ßig spezifisch antiviral wirksam. W{\"a}hrend JK80 vermutlich den Eintritt des MV in die Zellen verhindert, hemmt QD6-8 die intrazellul{\"a}re Virusreplikation und w{\"a}re im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger, spezifischer Medikamente gegen die Maserninfektion von grossem Interesse. Eine Zielmolek{\"u}lanalyse der Substanz und die Testung anderer Derivate k{\"o}nnten Aufschluss dar{\"u}ber geben, wie Substanzen aussehen m{\"u}ssten, die eine spezifische Hemmung der intrazellul{\"a}ren Replikation bewirken k{\"o}nnen. Der Naturstoff Droseron k{\"o}nnte mit einer spezifischen Hemmung (IC50 ca. 10 µM; SIWert 6 im Fluoreszenzreader, bzw. IC50 ca. 2 µM; SI-Wert 30 in der Titration) eine m{\"o}gliche Leitsubstanz f{\"u}r einen neuen MV-Inhibitor darstellen. Allerdings waren alle bisher getesteten Droseron-Derivate entweder weniger inhibitorisch wirksam oder deutlich zytotoxischer als Droseron selbst. Die Ergebnisse der Infektionshemmversuche mit Zugabe von Droseron vor, w{\"a}hrend oder nach der Infektion mit MV sprechen daf{\"u}r, dass Droseron den Eintritt des Virus in die Zelle st{\"o}rt.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Hollmann2017, author = {Hollmann, Claudia Beate}, title = {Einfluss der sauren Sphingomyelinase auf anti-virale T-Zellantworten im Masernvirus-Infektionsmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-153807}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2017}, abstract = {Die saure Sphingomyelinase (Asm), ein Enzym des Sphingolipidmetabolismus, spaltet Sphingomyelin zu Ceramid und Phosopocholin. Aktiviert wird die Asm unter anderem durch Stimulation des CD28 Rezeptors. CD28 Signale werden auch f{\"u}r die Aktivierung von konventionellen T-Zellen (Tconv) und f{\"u}r die Kostimulation ben{\"o}tigt und sind essentiell f{\"u}r die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen (Treg) im Thymus und deren Erhalt in der Peripherie. Wir konnten zeigen, dass sich Tconv und Treg Zellen hinsichtlich der Asm unterscheiden. Treg haben eine h{\"o}here "basale" Asm Aktivit{\"a}t, widergespiegelt im h{\"o}heren Ceramidgehalt und haben eine niedrigere Lipidordnung als Tconv Zellen. Die Abwesenheit der Asm in defizienten M{\"a}usen bewirkt einen relativen Anstieg der Treg-Frequenz innerhalb der CD4+ T-Zellen. Außerdem f{\"u}hrt die Asm-Defizienz in Treg Zellen zu einer erh{\"o}hten Umsatzrate des immunsupprimierenden Molek{\"u}ls CTLA-4 und zu einer verst{\"a}rkten Suppressivit{\"a}t von Treg Zellen aus Asm-/- M{\"a}usen gegen{\"u}ber Wildtyp Zellen. Ein Anstieg in der Treg-Frequenz, {\"a}quivalent zur genetischen Defizienz, kann auch durch Inhibition der Asm, d. h. durch Wirkstoffe wie Amitriptylin und Desipramin erreicht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibitorbehandlung die absolute Anzahl der Tconv Zellen selektiv verringert, da Treg Zellen gegen{\"u}ber dem Asm Inhibitor-induzierten Zelltod resistenter sind. Mechanistisch erkl{\"a}rbar sind die Unterschiede gegen{\"u}ber den proapoptotischen Inhibitoreffekten zwischen Tconv und Treg Zellen dadurch, dass Treg Zellen durch die Anwesenheit von IL-2 gesch{\"u}tzt sind. In Abwesenheit von IL-2 sterben die Treg Zellen ebenfalls. Die gezielte Ver{\"a}nderung des Verh{\"a}ltnisses von Treg zu Tconv durch den Einsatz von Asm-inhibitorischen Medikamenten kann hilfreich bei der therapeutischen Behandlung von inflammatorischen- und Autoimmunerkrankungen sein. Inwiefern die Asm f{\"u}r die Funktion von T-Zellen in der anti-viralen Immunantwort entscheidend ist, wurde im Masernvirus-Infektionsmodell n{\"a}her untersucht. In Asm-/- M{\"a}usen und Amitriptylin-behandelten M{\"a}usen konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit der Asm die Kontrolle der Masernvirusinfektion verschlechtert ist. Treg sind auch hier von entscheidender Bedeutung, da die Asm-abh{\"a}ngige, verst{\"a}rkte Masernvirusinfektion bei Fehlen der Asm nur in Gegenwart von Treg auftritt. In der akuten Phase gibt es in Asm-/- M{\"a}usen weniger masernvirusspezifische T-Zellen und dadurch eine verringerte Beseitigung der Viruslast. In der chronischen Phase ist die Anzahl masernvirusspezifischer T-Zellen zwischen WT und Asm-/- M{\"a}usen vergleichbar. In Letzteren ist allerdings die Anzahl und Frequenz von T-Zellen im Gehirn infizierter M{\"a}use noch deutlich erh{\"o}ht, was die verst{\"a}rkte Maserninfektion widerspiegelt. Zusammenfassend zeigt sich, dass die Asm die Funktion von Treg moduliert und einen Einfluss auf das Verh{\"a}ltnis von Tconv und Treg zueinander hat. Im Masernvirus-Infektionsmodell kann die Ver{\"a}nderung des Tconv zu Treg Verh{\"a}ltnisses in Abwesenheit der Asm urs{\"a}chlich f{\"u}r die verringerte Viruskontrolle sein. Die Asm Inhibitor-induzierte Treg-Aktivierung und die Beeinflussung des Treg zu Tconv Verh{\"a}ltnisses k{\"o}nnen wiederum f{\"u}r therapeutische Zwecke genutzt werden, wie beispielsweise bei Multipler Sklerose und Rheumatoider Arthritis.}, subject = {saure Sphingomyelinase}, language = {de} } @phdthesis{Bieringer2014, author = {Bieringer, Maria}, title = {Analyse der Speziesbarriere humaner Zellen gegen{\"u}ber Infektion mit Hundestaupevirus (CDV)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-97725}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Die geplante Ausrottung der Masern bis 2020 und die damit eventuell einhergehende Beendigung der Masernimpfung k{\"o}nnten die Voraussetzungen daf{\"u}r schaffen, dass andere Morbilliviren, wie beispielsweise das Hundestaupevirus (CDV), einen Wirtswechsel zum Menschen vollbringen k{\"o}nnten. CDV ist ein hoch ansteckendes Pathogen und besitzt einen weiten Wirtstropismus, der sich aktuell immer weiter ausbreitet. Im Gegensatz dazu kann das Masernvirus (MV) nahezu ausschließlich Menschen und nur sehr bedingt wenige Affenarten infizieren. In dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass eine Adaptierung des rekombinanten wildtypischen CDV-Stammes CDV-75/17red an den humanen Rezeptor SLAM (signaling lymphocytic activation molecule, CD150) reproduzierbar und innerhalb weniger Passagen erfolgt. Bei der Adaptierung an das humane SLAM ist dabei nur eine Mutation in dem Gen f{\"u}r das virale H{\"a}magglutinin notwendig. Diese Mutation an Position 8697 von A zu G im viralen Genom (Aminos{\"a}ure D540G im H{\"a}magglutinin) konnte reproduzierbar detektiert werden, obwohl ver{\"o}ffentlicht wurde, dass unterschiedliche Mutationen im H{\"a}magglutinin verschiedener CDV-St{\"a}mme eine SLAM-Adaptierung erm{\"o}glichen. Die Mutation D540G im H{\"a}magglutinin des humanen SLAM-adaptierten CDV-A75/17red kompensiert eine negative Ladung der Aminos{\"a}ure 71E, die speziesspezifisch im humanen SLAM vorhanden ist. Durch Wachstumskinetiken konnte belegt werden, dass das an humanes SLAM-adaptierte CDV-A75/17red auch weiterhin das canine SLAM effizient verwendet. Ein weiterer Eintrittsrezeptor, humanes Nectin4, konnte mit demselben CDV-Stamm ohne adaptive Mutation in den viralen H{\"u}llproteingenen benutzt werden. Wachstumskurven auf verschiedenen humanen B-Lymphozyten Zelllinien zeigen allerdings, dass eine alleinige Adaptierung an die humanen Wirtszellrezeptoren, f{\"u}r eine effiziente Virusreplikation, nicht ausreicht. Damit das CDV die Speziesbarriere durchbrechen kann, muss offenbar ein weiterer Adaptierungsprozess an die humanen Wirtszellen erfolgen, der voraussichtlich mit umfangreicheren Mutationen des viralen Genoms einhergehen w{\"u}rde. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass intrinsische Faktoren und das angeborene Immunsystem eine wichtige Barriere bilden und den Menschen vor einer CDV-Infektion sch{\"u}tzen. Allerdings w{\"u}rde eine Fortf{\"u}hrung der MV-Impfung auch nach Ausrottung der Masern, aufgrund der Kreuzreaktivit{\"a}t gegen andere Morbilliviren, den Schutz vor einer m{\"o}glichen Adaptierung eines Morbillivirus, wie CDV, an den Menschen deutlich verst{\"a}rken.}, subject = {Staupevirus}, language = {de} } @phdthesis{Koethe2012, author = {K{\"o}the, Susanne}, title = {Masernvirus-Infektion von Dendritischen Zellen und Virus-Transmission an T-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73108}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-pr{\"a}sentierende Zellen, die Pathogene erkennen und nach erfolgreicher Reifung spezifische adaptive Immunit{\"a}t induzieren. Die Infektion unreifer DCs durch Masernviren (MV) erfolgt CD150-abh{\"a}ngig und DC-SIGN-unterst{\"u}tzt. Infizierte DCs vermitteln wahrscheinlich den MV-Transport vom Respirationstrakt in sekund{\"a}re lym-phatische Gewebe, wo die MV-spezifische Immunit{\"a}t und die generalisierte Immunsuppressi-on initiiert werden sowie die MV-Transmission an T-Zellen stattfinden kann, die wesentlich f{\"u}r die Dissemination des Virus ist. Die MV-Infektion von iDCs initiierte deren Ausreifung begleitet von der moderaten Hochre-gulierung der CD150-Oberfl{\"a}chenexpression. Die Akkumulation viraler Proteine als auch die Freisetzung viraler Partikel waren in DCs im Vergleich zu Virus-produzierenden B-Zelllinie B95a beeintr{\"a}chtigt. Diese Arbeit verglich die subzellul{\"a}re Verteilung der viralen Proteine in DCs und B95a-Zellen. In DC wiesen Matrix (M)-Proteine eine prominente Assoziation mit den Komponenten des Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexes auf. Die ausgepr{\"a}gte Relokali-sierung des Tetraspanins CD81 zu Phospho (P)-Protein-Kompartimenten und die Inhibition der r{\"a}umliche Interaktion der untersuchten Tetraspanine waren spezifisch f{\"u}r B95a-Zellen. Weder in B95a-Zellen noch f{\"u}r DC konnte f{\"u}r MV ein virus-containing compartment (VCC) detektiert werden, das f{\"u}r HIV-1 zuvor beschrieben wurde. Um den zellul{\"a}ren Transport des M-Proteins in infizierten, lebenden DCs untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde das Protein carboxyterminal mit dem Tetracystein (TC)-Tag fusioniert. Das M-TC Fusionsprotein zeigte alle untersuchten biologischen Eigenschaften des Wildtyp-Proteins bez{\"u}glich seiner subzellul{\"a}ren Verteilung, der Assoziation mit DRMs sowie der Generierung und Freisetzung von virus-like particles (VPLs). Innerhalb des Viruskontextes interferierte der TC-Tag allerdings stark mit der Virusreplikation bzw. Freisetzung. Durch die Verminderung der Partikelproduktion in DCs wird eine spezielle MV-Transmissionsstruktur f{\"u}r die effiziente {\"U}bertragung an T-Zellen ben{\"o}tigt. Die MV-Transmission an autologe T-Zellen basierte vorwiegend auf Infektion von DCs (cis-Infektion) und weniger auf DC-SIGN-gebundenen Virus (trans-Infektion). Die Interaktion zwischen dem MV-Glykoprotein H mit seinem Rezeptor CD150 war wichtig f{\"u}r die Transmission. Die Transmission von MV erfolgte haupts{\"a}chlich durch die Bildung von Kontaktfl{\"a}chen, entspre-chend den beschriebenen virologischen Synapsen, wo virale Proteine akkumulierten und CD150 aktinabh{\"a}ngig rekrutiert wurde, und seltener {\"u}ber aktinreiche Filopodien. Die HIV-VS Markerproteine ICAM-1, aktiviertes LFA-1, CD81, DC-SIGN und der phosphorylierte Ezrin / Radixin / Moesin (ERM)-Proteinkomplex polarisierten zur MV-VS. Moesin und der Substanz P Rezeptor (SPR), die Prozesse des MV-Eintritts oder der Aufnahme unterst{\"u}tzen, akkumulierten ebenfalls in den Transmissionsstrukturen. Zusammengefasst zeigte diese Arbeit, dass die gebildete Plattform f{\"u}r MV-Transmission (MV-VS) wichtige Gemeinsamkeiten mit der HIV-VS teilt. In der MV-VS akkumulierten Proteine, die Aktindynamiken regulieren, die die Konjugatstabilit{\"a}t verst{\"a}rken und die die Membranfusion unterst{\"u}tzen, die einen effizienten Eintritt des MV in T-Zellen erm{\"o}glichen.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Reuter2012, author = {Reuter, Dajana}, title = {Einfluss der Immunkompetenz auf die Etablierung und den Verlauf persistierender viraler Infektionen des zentralen Nervensystems (im Tiermodell Maus/Masernvirus)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71437}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Zu den gef{\"a}hrlichen Komplikationen der Masern geh{\"o}rt die selten vorkommende ZNS-Erkrankung subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE), die erst mehrere Jahre nach einer akuten Masernvirusinfektion auftritt. Die SSPE verl{\"a}uft immer t{\"o}dlich und bis heute gibt es keine spezifische Therapie gegen diese Erkrankung. Unsere Arbeitsgruppe hat ein Modell f{\"u}r eine persistierende, virale ZNS-Infektion entwickelt, in dem 2-Wochen-alte, immunologisch normale C57BL/6-M{\"a}use mit einem rekombinanten, neurotropen Masernvirus (MV), das das H{\"a}magglutinin eines an Nagern angepassten MV-Stammes enth{\"a}lt, intrazerebral (i.c.) infiziert werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle regulatorischer CD4+ CD25+ Foxp3+ T-Zellen (Treg) in diesem Mausmodell analysiert und untersucht, ob die persistierende ZNS-Infektion durch Manipulation peripherer Treg beeinflusst werden kann. Außerdem wurde ein IFN-y-ELISPOT-Assay etabliert, der CD8+ zytotoxische T-Zellen (CTL) identifiziert, die spezifisch f{\"u}r die MV-H{\"a}magglutinin-Epitope MV-H22-30 (RIVINREHL) bzw. MVH446-454 (SNHNNVYWL) sind. In Bezug auf das erstgenannte Epitop wurde desweiteren eine Pentamer-F{\"a}rbung etabliert, um CTLs mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu identifizieren, die H-2Db-gekoppelte MV-H22-30-Epitope erkennen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass sich trotz eines hohen Anteils Masern-spezifischer CTLs und nur sehr wenigen Treg im Gehirn eine persistierende ZNSInfektion ausbildet. Periphere Treg wurden w{\"a}hrend der persistierenden Phase der ZNS-Infektion expandiert bzw. depletiert und die Konsequenzen f{\"u}r die Virus-spezifische Immunantwort sowie das Ausmaß der persistierenden Infektion wurden analysiert. Die Expansion von Treg mit Hilfe des superagonistischen anti-Maus CD28 Antik{\"o}rpers D665 verursachte eine transiente Immunsuppression, die die Virus-Replikation sowie -Ausbreitung im Gehirn verst{\"a}rkte. Im Gegensatz dazu f{\"u}hrte die Depletion von Treg in DEREG-M{\"a}usen mittels Diphtherietoxin zu einem erh{\"o}hten Anteil Virus-spezifischer CTLs im Gehirn sowie zu einer Reduktion der persistierenden ZNS-Infektion. Diese Daten zeigen, dass Treg die F{\"a}higkeit besitzen, die Persistenz von MV im Gehirn zu kontrollieren und somit m{\"o}glicherweise Teil eines Therapiekonzeptes gegen ZNS-Infektionen mit dem Masernvirus sein k{\"o}nnen. Fr{\"u}here Studien unserer Arbeitsgruppe haben außerdem gezeigt, dass das durch IFN-y induzierbare Enzym Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) antivirale Aktivit{\"a}ten gegen MV aufweist. Dies wurde in dieser Doktorarbeit in vivo in unserem Mausmodell anhand von IDOk.o.-Tieren best{\"a}tigt, die nach i.c. Infektion nicht nur eine erh{\"o}hte Mortalit{\"a}tsrate aufwiesen sondern auch in den {\"u}berlebenden Tieren eine verst{\"a}rkte persistierende ZNS-Infektion zeigten.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Zinke2012, author = {Zinke, Michael Benedikt}, title = {Hemmung der Masernvirusreplikation durch RNA-Interferenz}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83933}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Die subakut sklerosierende Panenzephalitis ist eine demyelinisierende Erkrankung des ZNS. {\"A}tiologisch liegt eine persistierende Infektion von Masernviren der Neuronen bzw. Gliazellen zugrunde. Bis heute gibt es keine spezifische Therapie und lediglich symptomatische Therapiemaßnahmen werden in deren Behandlung angewandt. Obwohl sich w{\"a}hrend des Krankheitsverlaufes eine ausgepr{\"a}gte Immunantwort des nat{\"u}rlichen als auch adaptiven Immunsystems des Wirtes abspielt f{\"u}hrt die Erkrankung unweigerlich zum Tode der Betroffenen. Eine Therapiem{\"o}glichkeit diesbez{\"u}glich k{\"o}nnten die Effekte der RNAi darstellen. Um geeignete Sequenzen f{\"u}r einen m{\"o}glichen Genknockdown einzelner MV-Gene herauszufiltern, wurde ein plasmid-basierendes Testsystem entwickelt, das die mRNA des Fluoreszenzproteins DsRed2 zusammen mit mRNA-Sequenzen einzelner MV-Gene exprimiert. Gegen diese MV-Gene wiederum wurden verschiedene shRNAs ausgew{\"a}hlt, welche mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems exprimiert werden. Als Expressionsindikator findet in diesem lentiviralen Vektorsystem simultan die Expression von eGFP als statt. Die Auswertung dieses Dual-Color-Systems erfolgte im Folgenden mittels FACS-Analysen. Die wirksamsten siRNA-Sequenzen, ausgew{\"a}hlt durch eine hohe Abnahme der Rotfluoreszenz in den untersuchten Zellen, wurden f{\"u}r weitere Versuche selektiert. Die auf diese Weise ausgew{\"a}hlten shRNA-Sequenzen wurden in einem weiteren Schritt durch die Generierung lentiviraler Partikel in persistierend infizierten NT2-Zellen (piNT2), die das Fluoreszenzprotein HcRed als Infektionsindikator exprimieren, transduziert. Weitere durchflusszytometrische Messungen zeigten eine {\"a}ußerst hohe Reduktion viraler Replikation innerhalb von 7 Tagen bis unterhalb der Detektionsgrenze sofern die shRNAs gegen die Expression der MV-Proteine N, P und L gerichtet waren. Die Anzahl der virus-negativen Zellen blieb im Folgenden bis zu 3 Wochen nach stattgehabter Transduktion konstant, sofern das fusion-inhibiting-peptide den Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die transduzierten piNT2-Zellen, welche keine Expression von HcRed zeigten wurden auf Zellrasen bestehend aus Vero-Zellen aufgetragen und f{\"u}hrten im zeitlichen Verlauf zu keiner Fusion bzw. Synzytienbildung. Dieser Zusammenhang legt nahe, dass die transduzierten piNT2-Zellen die F{\"a}higkeit einer Expression viraler Proteine verloren haben und eine „Heilung" stattfinden kann, wenn die virale Proteinbiosynthese durch eine permanente Expression von siRNAs, wie beispielsweise durch lentivirale Vektorsysteme, gehemmt wird.}, subject = {RNS-Interferenz}, language = {de} } @phdthesis{Gassert2011, author = {Gassert, Evelyn}, title = {Die Bedeutung von Ceramiden f{\"u}r die Reorganisation des Zytoskeletts in T-Zellen, die Ausbildung einer immunologischen Synapse und die T-Zell-Aktivierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65123}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Ceramide sind biologisch aktive Sphingolipide, die verschiedene zellul{\"a}re Signalwege regulieren, meist im Zusammenhang mit der Induktion von Apoptose oder der Regulation des Zellzyklus. Dar{\"u}ber hinaus wurde in der Literatur beschrieben, dass Ceramide die Zytoskelettdynamik unterschiedlicher Zelltypen beeinflussen, die Bedeutung von Ceramiden f{\"u}r die Funktion von T-Zellen wurde allerdings bisher wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die exogene Akkumulation von Ceramiden ebenso wie die Generierung von Ceramiden durch bSMase die Adh{\"a}renz von T-Zellen an FN bzw. ICAM-1 beeintr{\"a}chtigt. Des Weiteren konnte eine verminderte T-Zell-Polarisierung auf FN sowie eine reduzierte Chemotaxis und Motilit{\"a}t ceramidmodifizierter T-Zellen in Antwort auf SDF-1 nachgewiesen werden. In {\"U}bereinstimmung mit der Unf{\"a}higkeit ceramidmodifizierter Zellen morphologisch zu polarisieren wird ferner die Relokalisation von Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}len und intrazellul{\"a}rer Proteine durch die Akkumulation von Ceramiden gest{\"o}rt. {\"U}berdies konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide mit dem Aktivierungsstatus von Akt und ERM-Proteinen interferieren, da eine verminderte stimulationsabh{\"a}ngige Phosphorylierung von Akt und ERM-Proteinen in ceramidmodifizierten Zellen nachgewiesen wurde. Ein wesentlicher Schritt im Verlauf der T-Zell-Aktivierung ist die Ausbildung einer immunologischen Synapse mit dendritischen Zellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass, obwohl ceramidreiche Membrandom{\"a}nen von der Kontaktstelle ausgeschlossen werden, Konjugatfrequenz und Architektur der IS durch die Induktion von Ceramiden nicht beeinflusst werden, da eine normale Verteilung von CD3 und des MTOC beobachtet wurde. Allerdings wird die Funktionalit{\"a}t der Konjugate durch die Induktion von Ceramiden beeintr{\"a}chtigt. Ceramidmodifizierte Zellen waren nur eingeschr{\"a}nkt in der Lage Orai1 und Stim1 zur Kontaktfl{\"a}che mit DCs zu translozieren. In {\"U}bereinstimmung mit diesen Befunden wurde auch ein verminderter Calcium-Einstrom sowie eine verminderte Proliferation infolge der Akkumulation von Ceramiden detektiert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide wesentliche Prozesse im Verlauf der T-Zell-Aktivierung beeinflussen, so dass die pathogeninduzierte Generierung von Ceramiden einen m{\"o}glichen Mechanismus darstellt, die Funktion von T-Zellen zu beeintr{\"a}chtigen.}, subject = {Ceramide}, language = {de} } @phdthesis{Boussaad2011, author = {Boussaad, Ibrahim}, title = {Interaktion des Masernvirus mit humanen h{\"a}matopoetischen Stamm- und Vorl{\"a}uferzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-64462}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die MV-induzierte Immunsuppression ist unter anderem durch eine Leukopenie gekennzeichnet und so wurde in der vorliegenden Studie die Frage nach den Auswirkungen einer Interaktion des MV mit Knochenmarkszellen adressiert. Humane HSC, multipotente und oligopotente h{\"a}matopoetische Vorl{\"a}uferzellen (HPC) k{\"o}nnen, im Gegensatz zu murinen, nicht anhand des SLAM-codes unterschieden werden. W{\"a}hrend CD244 auf allen HS/PC exprimiert wird, markieren CD150 und CD48 eher humane HPC als HSC. Trotz vorhandener CD150+-HPC beschr{\"a}nkt sich die Infektion mit wildtypischen MV nicht auf diese Subpopulation, sondern erfolgt, wie bei CD150- Stromazellen, unabh{\"a}ngig von diesem Rezeptor. Dar{\"u}ber hinaus wurde gezeigt, dass die MV-Exposition von HS/PC in vitro weder deren Proliferation noch die F{\"a}higkeit zur Koloniebildung st{\"o}rt. Dass sich eine MV-Infektion in Kokulturen von HS/PC mit Stromazellen vom jeweils einen auf den anderen Zelltypen {\"u}bertr{\"a}gt, k{\"o}nnte als m{\"o}glicher Mechanismus zur Ausbreitung und Etablierung einer Infektion im Knochenmark angesehen werden. Obwohl in vitro keine Inhibition der Expansion von HS/PC beobachtet wurde, st{\"o}rt eine vorangegangene MV-Exposition die Kurzzeitrekonstitution bestrahlter NOD/SCID-M{\"a}use massiv. Diese Inhibition der H{\"a}matopoese ist jedoch transient und hat keine Auswirkungen auf die Langzeitrekonstitution. Da weder die Migration der transplantierten HS/PC zum Knochenmark gest{\"o}rt ist noch die Knochenmarkszellen der Maus permissiv f{\"u}r eine MV-Infektion sind, ist die beobachtete Inhibition auf einen direkten Einfluss der MV-Exposition auf die HS/PC zur{\"u}ckzuf{\"u}hren.}, subject = {Blutstammzelle}, language = {de} } @phdthesis{TranVan2010, author = {Tran-Van, Hieu}, title = {Semaphorin receptors in the immunological synapse: regulation and measles virus-driven modulation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53926}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {J{\"a}hrlich gehen ca. 164000 Todesf{\"a}lle (WHO, 2008) auf eine Infektion mit Masernviren (MV) zur{\"u}ck. Die Hauptursache f{\"u}r den t{\"o}dlichen Verlauf der Krankheit ist die MV-induzierte Immunsuppression, deren zugrunde liegende Mechanismen noch nicht v{\"o}llig aufgekl{\"a}rt sind. Es gibt Hinweise darauf, dass MV einerseits die Funktionalit{\"a}t von T-Zellen beeintr{\"a}chtigt, indem es die Aktindynamik behindert, und andererseits dendritische Zellen (DC) infiziert, was dazu f{\"u}hrt, dass sie T-Zellen nicht mehr vollst{\"a}ndig aktivieren k{\"o}nnen. W{\"a}hrend der Entwicklung bzw. des Wachstums von Neuronen kommt es zum Kollaps wachsender Dendriten, wenn Semaphorine (insbesondere SEMA3A) an den Rezeptor Plexin-A1 (plexA1) und seinem Korezeptor Neuropilin-1 (NP-1) binden. Dieser Kollaps wird durch interferenz mit der Aktindynamik verursacht. In dieser Studie wurde die Funktion dieser drei Molek{\"u}le in Immunzellen bzw. ihre Rolle in der MV-induzierten Immunsuppression untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass plexA1 eine wichtige Komponente der humanen immunologischen Synapse (IS) ist. Nach CD3/CD28-Ligation kommt es zur transienten Translokation zur T-Zelloberfl{\"a}che und zur Akkumulation an der Kontaktfl{\"a}che zwischen T-Zelle und DC bzw. α-CD3/CD28 beschichteten Mikropartikeln. Wird die plexA1-Expression inhibiert (RNAi) oder die plexA1-Funktion gest{\"o}rt (exogenes Blockieren oder Expression einer dominant negativen Mutante), ist die T-Zellexpansion reduziert. Nach MV-Exposition ist die Translokation von plexA1 und NP-1, ebenfalls einem wichtigen Bestandteil der immunologischen Synapse, zur Kontaktfl{\"a}che auf T-Zellseite gest{\"o}rt. Des Weiteren behindert eine MV-Infektion den plexA1/NP-1-Metabolismus in reifenden DC und f{\"u}hrt zus{\"a}tzlich zu einer fr{\"u}hen und starken Aussch{\"u}ttung von SEMA3A durch DC, insbesondere in Gegenwart allogener T-Zellen. Durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen wurde gezeigt, dass SEMA3A einen transienten Verlust aktinbasierter Zellforts{\"a}tze bei T-Zellen zur Folge hat. Zus{\"a}tzlich reduziert SEMA3A das chemotaktische Migrationsverhalten von DC und T Zell und die Frequenz ihrer Konjugat-Bildung. Zusammenfassend stellt sich die Situation so dar, dass MV die Semaphorinrezeptorfunktion zum einen dadurch beeintr{\"a}chtigt, dass es die Rekrutierung der Rezeptoren zur IS verhindert und zum anderen zur verfr{\"u}hten Aussch{\"u}ttung des kollapsinduzierenden Liganden SEMA3A f{\"u}hrt. Beide Ph{\"a}nomene k{\"o}nnten einen wichtigen Beitrag zur MV-induzierten Immunsuppression leisten.}, subject = {Masernvirus}, language = {en} } @phdthesis{Hummel2010, author = {Hummel, Horst-Dieter}, title = {Herstellung und Evaluation genetisch ver{\"a}nderter Masernviren zur spezifischen Infektion und Elimination prim{\"a}rer maligner Plasmazellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51393}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Das Multiple Myelom ist trotz deutlicher Fortschritte in der Therapie meist eine unheilbare Erkrankung, so dass der Erforschung neuer therapeutischer Optionen mit dem Ziel, eine m{\"o}glichst langfristige krankheitsfreie Zeit f{\"u}r den betroffenen Patienten zu erreichen, eine wichtige Bedeutung zukommt. Hierbei erweist sich der Ansatz, maligne Plasmazellen spezifisch mit onkolytischen Viren zu infizieren und zu eliminieren, als zunehmend vielversprechend. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues rekombinantes Masernvirus kloniert, das selektiv prim{\"a}re MM-Zellen infiziert und abt{\"o}tet. Diese F{\"a}higkeit basiert auf der Verwendung eines mutierten H-Proteins, das nicht mehr mit den nat{\"u}rlichen Rezeptoren CD46 oder CD150 interagiert und das zus{\"a}tzlich mit einem single chain Antik{\"o}rper (scFvWue) verkn{\"u}pft ist, der MM-Zellen spezifisch bindet. Unter Verwendung eines etablierten Rescuesystems aus cDNA konnten in vitro replikationskompetente Virionen von MV-Wue erstellt werden. Diese vorgenommenen Ver{\"a}nderungen beeinflussten die F{\"a}higkeit zur effizienten Replikation und Produktion infekti{\"o}ser Viren in vitro nicht. Zur funktionellen Testung des neuen rekombinanten Virus MV-Wue wurde die Spezifit{\"a}t des Virus f{\"u}r prim{\"a}re maligne Plasmazellen in Infektionsexperimenten gezeigt sowie der Mechanismus der Ablation als Apoptose definiert.}, subject = {Multiples Myelom}, language = {de} } @phdthesis{Salditt2010, author = {Salditt, Andreas}, title = {Bedeutung des ESCRT-Systems f{\"u}r die Partikelfreisetzung von Masernviren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48317}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die Matrix-Proteine von Vertretern der Ordnung Mononegavirales sind essentiell f{\"u}r sp{\"a}te Schritte im viralen Lebenszyklus, insbesondere der Knospung und Partikelmorphogenese. Die Abschn{\"u}rung und Freisetzung umh{\"u}llter RNA-Viren ist dabei abh{\"a}ngig von dem Transport des viralen Matrix-Proteins und seiner Interaktion mit Wirtsproteinen wie dem ESCRT-System (endosomal sorting complex required for transport), welches in die Sortierung zellul{\"a}rer Proteine involviert ist. Im Verlauf der Masernvirus (MV)-Infektion interagiert das M-Protein einerseits mit dem viralen Nukleoproteinkomplex und andererseits mit den viralen Glykoproteinen an der Oberfl{\"a}che. Die Bedeutung des MV-M-Proteins f{\"u}r die Partikelproduktion und sein intrazellul{\"a}rer Transport wurden bislang kaum untersucht. Bisher ist nur bekannt, dass das M-Protein oligomerisiert, teilweise monoubiquitiniert vorliegt und in Zellen, wenn alleine exprimiert, die Produktion von Virus-like-particle (VLP) vermittelt (Pohl et al., 2007). In dieser Studie wird gezeigt, dass das MV-M-Protein {\"a}hnlich wie das VP40-Protein des Ebolavirus (EBOV) mit Lipid Rafts und TEMs (tetraspanin enriched microdomain) assoziiert ist, wobei aber das M-Protein weniger effizient an der Plasmamembran akkumuliert. Beide Proteine unterscheiden sich nicht wesentlich in ihrer Assoziation mit Kompartimentmarkern. Interessant ist jedoch, dass das VP40-Protein und das M-Protein an der Plasmamembran mit dem Adaptor Protein-3 (AP-3) kolokalisieren. Die Kolokalisation des M-Proteins mit AP-3 wird aber nur in infizierten Zellen und nicht in Zellen, in denen das M-Protein allein exprimiert wird, beobachtet. Im Gegensatz zum VP40-Protein, welches die ESCRT-Komponenten {\"u}ber seine N-terminale L-Dom{\"a}ne rekrutiert und diese f{\"u}r die Partikelproduktion benutzt, geschieht dies beim M-Protein ESCRT-unabh{\"a}ngig, da die Mutation der Motive, die {\"A}hnlichkeiten zu den bekannten L-Dom{\"a}nen zeigen, keine Auswirkungen auf die VLP-Produktion haben. Zudem rekrutierte das M-Protein weder Tsg101, Aip-1 oder Vps4 an die Plasmamembran, noch wird die VLP- oder die Virusproduktion durch dominant negatives Vps4 inhibiert. Der Transfer der VP40 L-Dom{\"a}ne in das MV-M-Protein hatte weder einen Einfluss auf die Assoziation mit Tetraspaninen noch auf die ESCRT-Abh{\"a}ngigkeit der VLP-Produktion. Damit wurde gezeigt, dass die VLP-Freisetzung des MV-M-Proteins ESCRT-unabh{\"a}ngig ist. Die Freisetzung erfolgt beim MV durch einen grunds{\"a}tzlich anderen Weg, der noch untersucht werden muss.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Dittmar2008, author = {Dittmar, Sandra}, title = {Masernvirus-induzierte Blockade der transendothelialen Migration von Leukozyten und infektionsvermittelte Virusausbreitung durch Endothelzellschichten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35050}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Neben dem bekannten Tropismus des Masernvirus f{\"u}r CD150-positive aktivierte Zellen des Immunsystems, spielt der Endothelzelltropismus f{\"u}r die akute Masernviruserkrankung einschließlich ihren nachfolgenden Komplikationen eine wichtige pathogene Rolle. Die Infektion der Endothelzellen steht in Zusammenhang mit dem Auftreten des MV-Exanthems. Es ist auch m{\"o}glich, dass die „Akute Enzephalitits" und der Viruseintritt ins zentrale Nervensystem wie im Falle der subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) durch Endothelzellinfektion vermittelt wird. Ziel der Arbeit war herauszufinden, wie und ob das MV Endothelzellbarrieren {\"u}berwinden kann mittels Transport infizierter Leukozyten oder durch Infektion von EZs mit basolateraler Virusfreisetzung. Es wurde untersucht, ob die F{\"a}higkeit von prim{\"a}ren humanen T- Zellen durch polarisierte Zellschichten von „human brain microvascular endothelial cells" (HBMECs) zu wandern durch die Infektion beeinflusst wird. Die F{\"a}higkeit von infizierten Lymphozyten durch die Poren der Filter zu wandern war teilweise beeintr{\"a}chtigt, jedoch war das Ergebnis statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu war die F{\"a}higkeit der Zellen durch Endothelzellbarrieren zu wandern drastisch reduziert. Nach Infektion adh{\"a}rierten die Leukozyten st{\"a}rker auf den Endothelzellen. Bei dieser Adh{\"a}sion von PBMCs an Endothelzellen kam es trotz Infektion zur Ausbildung von sogenannten „transmigratory cups" oder docking- Strukturen. Dieser enge Zell-Zell-Kontakt hatte zur Folge, dass die MV-Infektion vom Lymphozyten auf die Endothelzelle {\"u}bertragen wurde. Die MV-H{\"u}llproteine wurden auf der apikalen und basolateralen Seite infizierter Endothelzellen exprimiert wie anhand von Aufnahmen mit dem konfokalen Mikroskop am Beispiel des H-Proteins gezeigt werden konnte. Titrationen ergaben, dass das Virus auf beiden Seiten der Zellen freigesetzt wurde. Desweiteren wurde best{\"a}tigt, dass auch f{\"u}r polarisierte Endothelzellen die auf Tyrosin basierenden Transportsignale verantwortlich sind f{\"u}r die basolaterale Virusfreisetzung. Die Daten unterst{\"u}tzen die Hypothese, dass das Virus mit Hilfe der Infektion und der bipolaren Virusfreisetzung {\"u}ber Endothelzellbarrieren}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Andres2006, author = {Andres, Oliver}, title = {Interaktion von Masernviren mit vaskul{\"a}ren Endothelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25650}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verf{\"u}gbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesf{\"a}llen j{\"a}hrlich geh{\"o}ren sie zu den gef{\"a}hrlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter {\"u}berhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekund{\"a}re bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, geh{\"a}uft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfekti{\"o}sen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) f{\"u}hren. Besonders gef{\"u}rchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorg{\"a}nge sind dabei noch nicht g{\"a}nzlich verstanden. Vaskul{\"a}re Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen f{\"u}r das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpr{\"a}paraten wurden in infizierten und stark entz{\"u}ndlich ver{\"a}nderten Arealen immer wieder infizierte Gef{\"a}ßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gef{\"a}ßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusst{\"a}mmen mit humanen Gef{\"a}ßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis f{\"u}r die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierf{\"u}r wurde mit prim{\"a}ren Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskul{\"a}ren Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gew{\"a}hlt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusst{\"a}mme den nat{\"u}rlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage f{\"u}r die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermolek{\"u}le hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberfl{\"a}chenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zellul{\"a}re Rezeptoren f{\"u}r das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellul{\"a}ren Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusst{\"a}mme WTFb, W{\"u}4797 und W{\"u}5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen k{\"o}nnen. Weitere Analysen zeigten f{\"u}r Edm und W{\"u}4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antik{\"o}rper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen beg{\"u}nstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-\&\#945; und -\&\#947; schienen das Infektionsausmaß abzuschw{\"a}chen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur f{\"u}r den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber f{\"u}r die virulenten Masernvirusst{\"a}mme WTFb, W{\"u}4797 und W{\"u}5679 als zellul{\"a}rer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabh{\"a}ngige Infektion humaner vaskul{\"a}rer Endothelzellen mit Masernviruswildtypst{\"a}mmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellul{\"a}ren Rezeptor oder einen von einem zellul{\"a}ren Rezeptor unabh{\"a}ngigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gef{\"a}ßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind.}, subject = {Masern}, language = {de} } @phdthesis{Reuter2006, author = {Reuter, Thorsten}, title = {Untersuchung der Anwendbarkeit von siRNA als antivirales Agens zur Inhibition der Replikation von Masernviren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18766}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Im Gegensatz zu genetisch modifizierten Viren erm{\"o}glicht der Einsatz von siRNA zur RNA Interferenz (RNAi) die post-transkriptionelle Inhibition der Gen-Expression zur Analyse von Infektionen mit v{\"o}llig identischen Viren. Mittels RNase-III hergestellter siRNA wurde die Expression der sechs Masernvirus Gene unterbunden. Ist die siRNA gegen das Nukleokapsid (N)-, das Phospho (P)- oder gegen das Large (L)- Protein gerichtet, kommt es zur effektiven Einschr{\"a}nkung der Replikation und der generellen Gen-Expression. Diese drei Proteine sind f{\"u}r Transkription und Replikation essentiell, da die Genprodukte dieser drei Proteine die RNA-abh{\"a}ngige RNA Polymerase und den Ribonukleoproteinkomplex (RNP) bilden. SiRNA gegen das Fusionsprotein (F) und das H{\"a}magglutinin (H) schr{\"a}nken das Ausmaß der Zell-Zell Fusion ein. Interessanterweise f{\"u}hrt die Inhibition der Expression des Matrix-Proteins (M) nicht nur zu einer Verst{\"a}rkung der fusogenen Aktivit{\"a}t, sondern erh{\"o}ht gleichzeitig die Expression der {\"u}brigen viralen mRNA und genomischer RNA um den Faktor 2-2,5, so dass das Verh{\"a}ltnis mRNA:Genom konstant bleibt. Dieser Befund l{\"a}sst darauf schließen, dass M als negativer Regulator der viralen Polymeraseaktivit{\"a}t wirkt, und sowohl die Produktion von mRNA wie auch die Genom- Replikation in gleichem Maß beeinflusst. Anschließend wurden synthetische siRNAs gegen die L-mRNA gesucht. Effektive Sequenzen wurden dann, in Form einer shRNA Expressionskassette, in einen lentiviralen Vektor einkloniert. Damit sollen dann lentivirale Partikel hergestellt werden, mit denen Zellen infiziert werden k{\"o}nnen, so dass diese Zellen dann stabil siRNA exprimieren. Dieser Teil der Arbeit war zum Zeitpunkt der Niederschrift noch nicht beendet.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Mueller2006, author = {M{\"u}ller, Nora}, title = {Masern Virus Interferenz mit T-Zell-Aktivierung : Einfluß auf Zytoskelettdynamik, Mobilit{\"a}t und Interaktion mit Dendritischen Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17953}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Der Kontakt humaner T-Zellen mit dem MV Glykoproteinkomplex interferiert mit der CD3/CD28 stimulierten Aktivierung von PI3/Akt-Kinase Signalwegen. Damit verbunden ist der ineffiziente Transport PH-Dom{\"a}nen-enthaltender Proteine in Membran-rafts, wie der Akt-Kinase und Vav, den Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rho GTPasen. Es konnte gezeigt werden, dass infolge des MV-Kontaktes die CD3/CD28 stimulierte Aktivit{\"a}t der Rho GTPasen Cdc42 und Rac1 inhibiert ist. Dagegen war in MV-behandelten Zellen eine leichte RhoA Aktivierung festzustellen. Rho GTPasen spielen eine kritische Rolle in der Regulation von Zytoskelettorganisation von T-Lymphozyten. {\"U}bereinstimmend damit wurde gezeigt, dass der Kontakt mit MV die CD3/CD28 costimulierte Aktivierung und Polymerisation des F-Aktins inhibiert. Damit verbunden ist die reduzierte F{\"a}higkeit MV-behandelter T-Zellen auf Fibronektin- und mit CD3/CD28 Antik{\"o}rpern-beschichteten Objekttr{\"a}gern zu polarisieren. Die Ausbildung F-Aktin-getriebener morphologischer Ver{\"a}nderungen, wie Filopodien, Lamellipodien und Uropodien, ist drastisch reduziert. Rasterelektronenmikroskopische Auf-nahmen zeigten in nicht-stimulierten und CD3/CD28 costimulierten MV-behandelten T-Zellen einen nahezu kompletten Verlust an Mikrovilli und Lamellipodien. Die Bindung von MV induziert die Dephosphorylierung des F-Aktin-bindenden Proteins Cofilin und der ERM-Proteine. Es konnte demonstriert werden, dass der MV-Kontakt die Ausbildung einer reifen immunologischen Synapse st{\"o}rt. Trotz der morphologischen Ver{\"a}nderungen konjugieren MV-behandelte T-Zellen mit DCs. Die Anzahl MV-behandelter T-Zellen, die mit DCs inter-agieren, ist vergleichbar mit der mock-behandelter T-Zellen. Allerdings zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion der DC/T-Zell-Kontaktzone, dass in MV-behandelten T-Zellen die zentrale Akkumulation und Clusterbildung des CD3-Molek{\"u}ls gest{\"o}rt ist und keine monozentrische Synapse ausbildet wird. Desweiteren erfolgt die Relokalisation des MTOC in T-Zellen in Richtung der DC unvollst{\"a}ndig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der MV Glykoproteinkomplex mit essentiellen Schritten einer erfolgreichen T-Zell-Aktivierung w{\"a}hrend der APC/T-Zell-Interaktion interferiert.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Abt2006, author = {Abt, Marion}, title = {Interaktion von Masernviren mit Dendritischen Zellen : Untersuchungen zur Rezeptorbenutzung, Regulation der Chemotaxis und T-Zellkommunikation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19706}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von MV auf die Expression und Nutzung verschiedener Rezeptoren auf Dendritischen Zellen (DC) untersucht. Dazu wurden DC in vitro aus Monozyten gewonnen und mit IL- 4 und GM-CSF ausdifferenziert. In der Arbeit wurden das Wildtypvirus WTF und der Vakzinestamm ED eingesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Expression der Chemokinrezeptoren 5 (CCR5) und 7 (CCR7) auf MV-infizierten DC-Kulturen sowie das Migrationsverhalten der DC untersucht. Die Expression von CCR5 ist abh{\"a}ngig vom Reifungszustand der DC. W{\"a}hrend unreife DC CCR5 exprimieren, verringert sich die Expression im Zuge der Ausreifung, w{\"a}hrend die Expression von CCR7 induziert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die MV-Infektion einer DC-Kultur die Expression von CCR5 nicht beeinflusst, obwohl die Expression anderer charakteristischer Reifungsmarker erh{\"o}ht wird. Weiterhin konnte die Expression von CCR7 durch eine Infektion der DC-Kulturen mit MV nicht induziert werden. Die Ergebnisse der durchgef{\"u}hrten durchflusszytometrischen Analysen zur Rezeptorexpression wurden in Chemotaxis-Assays eingehender untersucht. DC aus MV-infizierten Kulturen zeigten trotz anhaltender CCR5-Expression nur eine geringe Migration in Richtung des CCR5-Liganden CCL-3. Aufgrund der fehlenden CCR7- Expression konnte erwartungsgem{\"a}ß keine Migration der eingesetzten DC gegen{\"u}ber dem CCR7-Liganden CCL-19 beobachtet werden. Weiterhin konnten Unterschiede im induzierten Chemokinmuster in MV-infizierten DCKulturen im Vergleich zu LPS-ausgereiften oder mit einer Mockpr{\"a}paration behandelten DC nachgewiesen werden. Kurz nach der Infektion konnte in MVinfizierten DC-Kulturen eine reduzierte Menge CXCL-8 und CCL-20 sowohl auf mRNA Ebene als auch auf Proteinebene detektiert werden. In weiteren Experimenten konnte eine verminderte Migration von T-Zellen auf Zusammenfassung 152 Zellkultur{\"u}berst{\"a}nde aus infizierten DC-Kulturen im Vergleich zu {\"U}berst{\"a}nden aus LPS-behandelten DC-Kulturen festgestellt werden. Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit konnte MV als Ligand f{\"u}r das DCspezifische Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}l DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule (ICAM)-3 grabbing non-integrin) identifiziert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass beide verwendeten Virusst{\"a}mme an DC-SIGN binden k{\"o}nnen, DC-SIGN jedoch keinen Eintrittsrezeptor f{\"u}r MV darstellt. Weitere Analysen zeigten, dass DC-SIGN die Infektion, besonders bei geringen Viruskonzentrationen, verst{\"a}rkt. In erster Linie zeigt die MV-Infektion unreifer DC die Bedeutung von DC-SIGN als Bindungsrezeptor f{\"u}r MV. Die hohe Expression von DC-SIGN auf unreifen DC erm{\"o}glicht eine effiziente effektive Infektion dieser Zellen. Auf reifen DC ist der Einfluss von DC-SIGN auf die Effektivit{\"a}t der Infektion der DC deutlich verringert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die Kontaktzeiten zwischen DC und TZellen in dreidimensionalen Kollagenmatrices untersucht. Dabei wurde eine in etwa doppelt so lange Kontaktzeit zwischen MV-infizierten DC und durch Oxidative Mitogenese ver{\"a}nderten T-Zellen gegen{\"u}ber LPS-behandelten DC bzw. MV-infizierten und nicht-modifizierten T-Zellen festgestellt. In den parallel durchgef{\"u}hrten Proliferationstests wurde eine reduzierte Proliferation der TZellen beobachtet, die mit MV-infizierten DC kokultiviert wurden. Im Gegensatz zu den k{\"u}rzeren Kontakten zwischen LPS-behandelten DC und modifizierten TZellen waren die Kontakte zwischen MV-infizierten DC und modifizierten TZellen nicht-stimulatorisch.}, subject = {Dendritische Zelle}, language = {de} } @phdthesis{Lehmann2006, author = {Lehmann, Christine}, title = {Die Bedeutung des Masernvirus Matrix-Proteins f{\"u}r die Virusfreisetzung und zelltypabh{\"a}ngige Unterschiede seines intrazellul{\"a}ren Transports}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22107}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Die Morphogenese von Viruspartikeln und deren Freisetzung aus infizierten Zellen sind sp{\"a}te Schritte im viralen Lebenszyklus. Matrix-Proteine (M) negativstr{\"a}ngiger RNA-Viren und Retroviren, bei denen es sich um periphere Membran-assoziierte Proteine handelt, spielen f{\"u}r diese Prozesse eine besonders wichtige Rolle. Im Verlauf der Masernvirus (MV)-Infektion interagiert das M-Protein mit dem viralen Nukleoproteinkomplex im Innern der Viruspartikel einerseits und mit den viralen Glykoproteinen auf der Oberfl{\"a}che andererseits. Die Bedeutung des MV M-Proteins f{\"u}r die Partikelproduktion und sein intrazellul{\"a}rer Transport wurden bislang wenig untersucht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das MV M-Protein in h{\"o}hermolekularen Komplexe oligomerisiert und transient mono-ubiquitiniert vorliegt. Beide biochemischen Eigenschaften des M-Proteins sind wahrscheinlich f{\"u}r die Partikelentstehung von Bedeutung, wie durch Studien an M-Protein-Orthologen anderer Viren bereits belegt wurde. Das MV M-Protein assoziierte mit Membranen und speziellen Membranmikrodom{\"a}nen, sogenannten Detergenz-resistenten Membranfraktionen (DRMs), und vermittelte nach transienter Expression in Fibroblasten die Produktion Virus-{\"a}hnlicher Partikel (virus-like particles, VLPs). Es ist beschrieben, dass umh{\"u}llte Viren pr{\"a}ferenziell aus DRMs freigesetzt werden. Die Koexpression des MV-Glykoproteins F erh{\"o}hte den Anteil mit DRM-assoziierten M-Proteins um ein Vierfaches, steigerte jedoch, wie auch das H-Protein, die Effizienz der VLP-Freisetzung nicht. {\"U}berraschenderweise waren beide jedoch selbst in der Lage VLPs zu induzieren. Die Effizienz der VLP-Produktion war gering und entsprach der der Viruspartikelfreisetzung. Dendritische Zellen (DCs) sind f{\"u}r MV semipermissiv. Obwohl alle viralen Proteine synthetisiert werden, wird kein infekti{\"o}ses Virus freigesetzt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die intrazellul{\"a}re Lokalisation der M-, H- und N-Proteine dramatisch von der in der produktiv infizierbaren Fibroblastenzelllinie HeLa abweicht. W{\"a}hrend in infizierten HeLa-Zellen das M-Protein mit Lamp-1-positiven sp{\"a}ten Endosomen kolokalisierte, akkumulierten in DCs alle untersuchten viralen Proteine in einem sp{\"a}t endosomalen Kompartiment, das das Tetraspanin CD81, aber nicht Lamp-1, enthielt und m{\"o}glicherweise an der MHC-Klasse-II-abh{\"a}ngigen Antigenpr{\"a}sentation beteiligt ist.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Obojes2005, author = {Obojes, Karola}, title = {Untersuchung der Infizierbarkeit von Endothelzellen mit Masernviren und des Interferon-induzierten antiviral wirksamen Mechanismus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14936}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Das Masernvirus (MV) geh{\"o}rt zu den negativ-str{\"a}ngigen RNA-Viren der Familie der Paramyxoviridae und verursacht beim Menschen akute und subakute Enzephalitiden. Es wurde beschrieben, dass sich MV-RNA in den Endothelzellen von SSPE (subakute sklerosierende Panenzephalitis)-Gehirnen nachweisen l{\"a}sst (Cosby \& Brankin, 1995). In dieser Arbeit konnte ich eine CD46- und CD150-unabh{\"a}ngige Infektion von Endothelzellen durch Wildtyp-MV nachweisen. Ferner wurde beschrieben, dass das Typ II-Interferon (IFN-g) im Serum von Patienten mit akuten Masern und nach einer Masernimpfung erh{\"o}ht ist (Okada et al., 2001; Ovsyannikova et al., 2003) und dieses Zytokin l{\"a}sst sich auch in Gehirnl{\"a}sionen von SSPE-Patienten detektieren (Nagano et al., 1994). Basierend auf diesen Erkenntnissen, konnte ich eine durch das Enzym Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) vermittelte antivirale Aktivit{\"a}t von IFN-g gegen MV nachweisen. Endothelzellen (EZ) sind bei der akuten Masernerkrankung oder nachfolgenden Komplikationen, die auf einer persistierenden Infektion basieren, wichtige Zielzellen. CD46 und CD150 (signalling lymphocytic activation molecule, SLAM) wurden als zellul{\"a}re Rezeptoren f{\"u}r MV beschrieben (D{\"o}rig et al., 1993; Naniche et al., 1993; Tatsuo et al., 2000). Es konnte gezeigt werden, dass humane EZ aus dem Gehirn und aus der Nabelschnurvene (HBMECs und HUVECs) zwar CD46, aber auf RNA- und auf Proteinebene kein SLAM exprimieren. Diese Zellen konnten jedoch mit den Wildtyp-MV, die CD46 nicht als Rezeptor benutzen, infiziert werden. Diese Untersuchungen deuten auf die Pr{\"a}senz eines zus{\"a}tzlichen Rezeptors f{\"u}r die Aufnahme und Verbreitung von MV in humanen EZ hin. Der antivirale Effekt von Interferonen spielt bei der MV-Vermehrung eine entscheidende Rolle und variiert jedoch in Abh{\"a}ngigkeit von der Wirtszelle (Schnorr et al., 1993). Im Gegensatz zu den attenuierten MV-Impfst{\"a}mmen k{\"o}nnen Wildtyp-MV den antiviralen Effekt von Typ I-IFN blockieren, indem sie die Induktion von IFNa/b hemmen und die Sensivit{\"a}t gegen{\"u}ber dem antiviralen Effekt vermindern. Dabei spielen die V- und C-Proteine des MV eine Rolle (Naniche et al., 2000; Patterson et al., 2000; Shaffer et al., 2003), die mit zellul{\"a}ren STAT-Proteinen und IRF-9 interagieren (Palosaari et al., 2003; Takeuchi et al., 2003; Yokota et al., 2003). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IFN-g die Replikation aller MV-St{\"a}mme vorwiegend in Endo- und Epithelzellen hemmen kann und, dass diese durch IFN-g induzierte, antivirale Aktivit{\"a}t mit der Induktion der Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) korreliert. IDO ist ein Enzym, welches in Anwesenheit von Sauerstoff den Abbau von Tryptophan zu Kynurenin katalysiert (Hirata et al., 1975) und haupts{\"a}chlich antiparasit{\"a}re, antibakterielle und antivirale (Bodaghi et al., 1999; Adams et al., 2004) Effekte vermittelt. Im Zusammenhang mit Masern wurde beschrieben, dass die Tryptophan Katabolite in SSPE-Patienten erh{\"o}ht sind (Kurup \& Kurup, 2002). Die Daten in dieser Arbeit zeigen, dass die durch IFN-g-induzierte antivirale Aktivit{\"a}t durch Zugabe von L-Tryptophan nahezu aufgehoben werden kann und daher IDO im Zuge der anti-MV Aktivit{\"a}t eine entscheidende Rolle spielt.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Erlenhoefer2003, author = {Erlenh{\"o}fer, Christian}, title = {Identifizierung von SLAM (CD150) als zellul{\"a}ren Rezeptor f{\"u}r Masernviren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6225}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Das Masernvirus (MV) interagiert mit zellul{\"a}ren Rezeptoren auf der Oberfl{\"a}che von peripheren Blut-Lymphozyten (PBL), die Virus -Bindung und -Aufnahme vermitteln. Wir konnten einen monoklonalen Antik{\"o}rper mAK 5C6 selektieren, der gegen die Zelloberfl{\"a}che von B95a Zellen gerichtet ist, die mit MV gut infizierbar sind. Der Antik{\"o}rper 5C6 inhibiert sowohl die Bindung, als auch die Infektion mit MV Wildtyp- und Vakzine-St{\"a}mmen. Ich verwendete eine retrovirale Genbank als Quelle f{\"u}r humane Milz mRNA und Proteine, um ein Screening nach Rezeptoren mit Antik{\"o}rpern durchzuf{\"u}hren. Mit Hilfe des Antik{\"o}rpers 5C6 wurde, unter Verwendung von Magnetbeats und FACS-Sortierung, ein erfolgreiches Screening Rezeptor-exprimierender Zellen durchgef{\"u}hrt. Das von mAK 5C6 erkannte Molek{\"u}l konnte kloniert und als signaling lymphocytic activation molecule (SLAM; CD150) identifiziert werden. Zur Untersuchung der Rezeptorbenutzung verschiedener MV-St{\"a}mme wurden CHO-Zellen, die entwe-der rekombinantes CD46 oder SLAM exprimierten, mit 28 Masernvirusst{\"a}mmen infiziert. Unter den getesteten Viren befanden sich sowohl Vakzine-St{\"a}mme, Wildtyp-St{\"a}mme mit verschiedener Pass-agierung und rekombinante Viren. Dabei konnte gezeigt werden, dass SLAM ein Rezeptor f{\"u}r MV ist, der sowohl Virusaufnahme und Synzytienbildung f{\"u}r alle getesteten Masernvirusst{\"a}mme vermittelt. Vor allem Vakzine- und laboradaptierte-St{\"a}mme, aber auch eine kleine Fraktion der getesteten Wild-typst{\"a}mme, konnten sowohl CD46 als auch SLAM verwenden. Durch Verwendung rekombinanter Viren konnte ich zeigen, dass der einzelne Aminos{\"a}ureaustausch im H{\"a}magglutinin (H) Protein an Position 481 Asn/Tyr (H481NY) determiniert, ob das Virus CD46 verwendet. Der Aminos{\"a}ureaus-tausch hat keinen Effekt auf die Verwendung von SLAM als Rezeptor was andeutet, dass die Bin-dungsstelle von SLAM und CD46 unterschiedlich ist. Wie bereits f{\"u}r CD46 beschrieben, konnte eine schnelle Rezeptormodulation sowohl auf infizierten als auch uninfizierten Zellen nach Kontakt der MV-Glykoproteine mit SLAM, festgestellt werden. Dabei zeigte sich eine kontaktvermittelte Downregulation nach Vermischung SLAM-positiver Zellen mit per-sistent infizierten BJAB Zellen oder UV-inaktiviertem Virus. SLAM wird schnell von der Zelloberfl{\"a}che SLAM exprimierender Zelllinien, wie CHO-SLAM, B95a, BJAB, sowie von peripheren Blutlymphozyten (PBL) herunterreguliert. Zusammgefasst: mit SLAM (CD150) wurde ein neuer zellul{\"a}rer Rezeptor f{\"u}r alle Masernvirusst{\"a}mme identifiziert.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Bieback2002, author = {Bieback, Karen}, title = {Die Rolle definierter Subpopulationen humaner peripherer Blutzellen f{\"u}r die Masernvirus-induzierte Immunsuppression und Immunaktivierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3787}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Eine Masernvirus- (MV) Infektion induziert eine effiziente virus-spezifische Immunantwort. Aber parallel erfolgt eine generelle Suppression immunologischer Funktionen, die sekund{\"a}re Infektionen erm{\"o}glichen und verst{\"a}rken kann. Eine Lymphopenie und die ex vivo beobachtete stark verminderte proliferative Antwort peripherer Lymphozyten auf polyklonale oder antigenspezifische Aktivierung gilt als zentraler Befund f{\"u}r diese Immunsuppression. Bislang konnte in vitro keine Interferenz mit dem von den MV-Glykoproteinen generierten negativen Proliferationssignal nachgewiesen werden. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Befunde zeigen jedoch, daß der MV induzierte Proliferationsarrest unter bestimmten Bedingungen in IPP/IL-2 (Isopentenylpyrophosphat und Interleukin-2) stimulierten gd T Zellen aufgehoben werden kann. Die Sensitivit{\"a}t der gd T Zellen gegen{\"u}ber dem von den MV-Glykoproteinen vermittelten Signal gleicht der der konventionellen T Zellen. Dennoch reicht der Kontakt zu Monozyten und mit dem MV Vakzinestamm Edmonston (ED)-infizierten B Zellen oder dendritischen Zellen (DC) aus, eine ungehemmte Expansion der g9d2 T Zellen zu induzieren. Durch eine Interaktion mit ED-infizierten B Zellen und DC reagieren Monozyten wahrscheinlich mit einer Regulation stimulatorischer oder inhibitorischer Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}le, die bei dem Kontakt mit gd T Zellen einen additiven Stimulus liefert, der das negative Proliferationssignal von MV neutralisiert. Auch Funktionen antigenpr{\"a}sentierender Zellen (APC) scheinen differentiell durch MV-St{\"a}mme regulierbar zu sein. Die Erkennung von molekularen Mustern von Pathogenen {\"u}ber die Toll-{\"a}hnlichen Rezeptoren (TLR) ist eine wichtiger Schritt bei der Aktivierung einer Immunantwort durch APCs. Nachdem die F{\"a}higkeit, mikrobieller Produkte APC {\"u}ber TLRs zu aktivieren, dokumentiert ist, sind nur zwei virale Proteine bekannt, die mit TLR4 interagieren. Mithilfe transgener Reporterzellen konnte demonstriert werden, daß MV-Wildtypst{\"a}mme, nicht aber Vakzinest{\"a}mme humanes und murines TLR2, wahrscheinlich mit CD14 als Korezeptor, und nicht TLR4, aktivieren. Die TLR2 agonistische Eigenschaft konnte dem MV-Wildtyp H{\"a}magglutininprotein (H) zugeordnet werden. Der Austausch einer einzigen Aminos{\"a}ure im WTF-H, Asparagin zu Tyrosin an der Positon 481, welche in an CD46 adaptierten Vakzinest{\"a}mmen zu finden ist, reichte f{\"u}r den Verlust TLR agonistischer Aktivit{\"a}t aus. Auch in humanen Monozyten konnten Viren, die das authentische WTF-H Protein enthielten, die Expression TLR responsiver Gene wie IL-6 induzieren. Gleichzeitig verursachte die Aktivierung der Monozyten durch die TLR Agonisten, einschließlich der Wildtyp MV, die Expression des allgemeinen MV Rezeptors CD150, der von ruhenden Monozyten nicht exprimiert wird. Die Spezifit{\"a}t der WTF-H und TLR2 Interaktion konnte durch blockierende Antik{\"o}rper und TLR2-/- M{\"a}use, die kein IL-6 nach Stimulation mit WTF freisetzen, gezeigt werden. Die F{\"a}higkeit von MV-Wildtypst{\"a}mmen TLR2 zu aktivieren, k{\"o}nnte wesentlich zu der Immunaktivierung, aber auch zur Ausbreitung und Pathogenese der Infektion beitragen und die Attenuierung von Vakzinest{\"a}mmen erkl{\"a}ren. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit Hinweise auf eine MV-stammspezifische Aktivierung angeborener Immunantworten, welche die adaptive Immunit{\"a}t modulieren k{\"o}nnen.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Pfeuffer2002, author = {Pfeuffer, Joanna}, title = {Untersuchung der Masernvirus-induzierten Immunsuppression im Baumwollrattenmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4808}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Die Infektion mit MV Wildtypvirus f{\"u}hrt zu einer starken Immunsuppression und Sekund{\"a}rinfektionen, die bei der Immunisierung mit einem attenuierten Vakzinestamm nicht auftreten. In vitro Studien zeigen, dass sowohl MV Wildtyp- als auch Impfstamminfizierte Zellen die Mitogen-induzierte Proliferation von humanen Blutlymphozyten inhibieren. Zur Best{\"a}tigung dieser Befunde im Baumwollrattenmodell wurde gezeigt, dass in vitro MV-infizierte Zellen die Proliferation der naiven Milzzellen hemmen und keine Unterschiede zwischen Wildtypen und Impfst{\"a}mmen bestehen. Im Gegensatz dazu wurden nach intranasaler Infektion von Baumwollratten Unterschiede hinsichtlich der Proliferationsinhibition, Virusreplikation und Ausbreitung zwischen Wildtypvirus WTF und Impfstamm Edm gefunden. Nach intranasaler Infektion mit 105 TCID50 WTF war am Tag 4 die Proliferation bis zu 40\% inhibiert. Bis zu 20 Tagen nach Infektion mit WTF wurde eine Proliferationsinhibition gemessen und das Virus in den drainierenden Lymphknoten bis Tag 4 nachgewiesen. Die intranasale Infektion mit Dosen von 103 TCID50 WTF bzw. mit 2-4x106 TCID50 Edm konnten im gleichem Maße die T-Zell- Proliferation hemmen. Somit war eine 1000fach niedrigere Dosis an WTF ausreichend, die gleiche hemmende Wirkung zu erzielen. Der gleiche Effekt wurde bei weiteren Wildtypst{\"a}mmen (Bilthoven, ICB) und Impfst{\"a}mmen gefunden. Eine Ursache f{\"u}r den unterschiedlich immunsuppressiven Effekt zwischen Wildtypen und Impfst{\"a}mmen k{\"o}nnte die unterschiedliche Rezeptornutzung sein. Wildtypviren benutzen CD150 als Rezeptor und Impfst{\"a}mme sowohl CD150 als auch CD46. Die Impfst{\"a}mme wurden urspr{\"u}nglich von Edm Wildtyp durch Passagierung auf Fibroblasten-Zellinien attenuiert und adaptierten an die CD46-Rezeptornutzung. Durch die dabei erfolgte Adaptation an CD46 wurde der Virus attenuiert. Dieses Ph{\"a}nomen konnte auch nach Passagierung eines Wildtypvirus auf verschiedenen Zelllinien gezeigt werden. Der auf lymphoiden Zellen passagierte Wildtyp WTFb und der auf Fibroblasten-Zellen WTFv passagierte haben unterschiedliches immunsuppressives Potential. Interessanterweise zeigte Edm-Wildtyp nach 9 Passagen auf Fibroblasten- Zellinien einen attenuierten Ph{\"a}notyp im Baumwollrattenmodell. Allerdings revertierte dieser Virus bereits nach 3 Passagen in der Baumwollratte zu einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus. Die Untersuchung der rekombinanten Viren Edm (WTF H), Edm (WTF F) und Edm (WTF H+F) zeigte, dass Impfst{\"a}mme, welche das Oberfl{\"a}chenprotein H von WTF anstelle des H-Proteins von Edm tragen, proliferationshemmend sind und sich im Organismus ausbreiten. Das F-Protein von Edm oder WTF hatte keinen Einfluß auf Immunsuppression und Virusausbreitung, Die R{\"u}ckmutation in dem WTF H-Protein an der Aminos{\"a}ure-Position 481 von Aspargin zu Tyrosin (N481Y) ver{\"a}nderte die Rezeptornutzung von CD46 auf CD150 und den Ph{\"a}notyp von einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus zu einem nichtimmunsuppressiven, nicht-ausbreitenden Virus. Da die Aminos{\"a}ureposition 481 einen starken Einfluß auf die Benutzung von CD46 oder CD150 aus{\"u}bt, scheint somit das HProtein von WTF die immunsuppressive Wirkung und Virusausbreitung maßgeblich zu beeinflussen. Wie beim Menschen konnten in der Baumwollratte MV-infizierte Makrophagen nachgewiesen werden. Durch die Infektion mit einem GFP-MV wurde die Virusreplikation nachgewiesen, das Virus wurde aus Makrophagen r{\"u}ckisoliert und durch Kokultivierung mit Indikatorzellen die Auspr{\"a}gung des zytopathischen Effektes fluoreszenzmikroskopisch beobachtet. Weitere Untersuchungen zeigten Unterschiede zwischen WTF und Edm-infizierten Makrophagen hinsichtlich der Proliferationsinhibition von Milzzellen. Der direkte Kontakt von Wildtyp WTFinfizierten Makrophagen hemmte die T-Zell-Proliferation. Dagegen wurde durch Edminfizierte Makrophagen keine T-Zell-Proliferationinhibition ausgel{\"o}st. Erkl{\"a}ren l{\"a}ßt sich das m{\"o}glicherweise mit dem unterschiedlichen Sekretionsprofil verschiedener Interleukine von WTF und Edm-infizierten Makrophagen, da bei WTF-infizierten Makrophagen eine Unterdr{\"u}ckung der Produktion von IL-12 gefunden wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die im Menschen beobachteten Unterschiede hinsichtlich Virusausbreitung und Immunsuppression zwischen Wildtypenund Impfst{\"a}mmen mit den Befunden in der Baumwollratte {\"u}bereinstimmen. Außerdem konnte festgestellt werden, dass die Interaktion von MV H-Protein und den Rezeptoren mit der Immunsuppression und Virusausbreitung korreliert. Die Unterdr{\"u}ckung der Sekretion von IL-12 in Makrophagen aus der Baumwollratte k{\"o}nnte die Hypothese unterst{\"u}tzen, dass die Immunsuppression w{\"a}hrend der MV-Infektion durch eine fehlgeleitete Th2-Antwort beg{\"u}nstig wird.}, subject = {Baumwollratte}, language = {de} } @phdthesis{Moeller2002, author = {M{\"o}ller, Kerstin}, title = {Die Bedeutung von Mutationen im H{\"a}magglutinin des Masernvirus f{\"u}r Neurovirulenz und Antik{\"o}rpererkennung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-852}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Masernvirus (MV) ist ein negativ-str{\"a}ngiges RNA-Virus, das im Menschen und im Nagermodell zu akuten und subakuten Enzephalitiden f{\"u}hren kann. Es wurde beschrieben, dass bestimmte Antik{\"o}rperescape-Mutanten des MV neurovirulent, andere nicht neurovirulent sind (Liebert et al., 1994). Mit Hilfe von rekombinanten Masernviren, konnte ich diejenigen Aminos{\"a}uren charakterisieren, die einerseits f{\"u}r die Bindung monoklonaler, neutralisierender anti-MV-H-Antik{\"o}rper (K29, K71, Nc32 und L77) und andererseits f{\"u}r die Neurovirulenz verantwortlich sind. Bei den rekombinanten MV wurde das von Duprex et al. (1999) als Neurovirulenz vermittelnd beschriebene H-Gen des nagerhirnadaptierten neurovirulenten CAM/RB-Stammes in das Grundger{\"u}st des nicht neurovirulenten Edtag (molekularer Klon des Vakzinestammes Edm) kloniert. {\"U}ber gerichtete Mutagenese wurden die jeweiligen Mutationen in dieses CAM/RB H-Gen eingef{\"u}gt. Mittels der FACS-Analyse konnten die Aminos{\"a}ure{\"a}nderungen identifiziert werden, die f{\"u}r die Bindung der jeweiligen Antik{\"o}rper verantwortlich sind. Sie befinden sich nach einem Strukturmodell der H-Proteine (Langedijk et al., 1997) im Membran-distalen Teil, den so genannten Propellern. Im Einzelnen sind folgende Aminos{\"a}ure{\"a}nderungen im H{\"a}magglutinin-Protein f{\"u}r den Escape verantwortlich: L77 - 377 Arg -> Gln und 378 Met -> Lys; Nc32 - 388 Gly -> Ser; K71 - 492 Glu -> Lys und 550 Ser -> Pro; K29 - 535 Glu -> Gly. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die beiden Aminos{\"a}urever{\"a}nderungen an den Positionen 195 und 200 gemeinsam f{\"u}r die Neurovirulenz verantwortlich sind und nicht assoziiert sind mit den Mutationen f{\"u}r den Antik{\"o}rperescape. Der Aminos{\"a}ureaustausch an Position 200 bei neurovirulenten Viren f{\"u}hrt zum Verlust einer benutzten Glykosylierungsstelle. Diese Mutation ist jedoch nicht alleine f{\"u}r das unterschiedliche Neurovirulenzverhalten der Viren verantwortlich, sondern es muss gleichzeitig der Austausch an Position 195 vorhanden sein, der eine positive Ladung im H-Molek{\"u}l entfernt. Diese beiden Mutationen sind nach dem Strukturmodell nach Langedijk im Stamm2-Bereich angesiedelt. Sind im H-Protein an Stelle 195 und 200 die Aminos{\"a}uren Gly und Ser vorhanden, so findet im Gehirn neugeborener Lewis-Ratten eine verst{\"a}rkte Virusvermehrung und Ausbreitung statt, die die akute Enzephalitis mit Expression typischer proinflammatorischer Zytokine zur Folge hat. Werden an Stelle 195 und 200 die Aminos{\"a}uren Arg und Asn exprimiert, so ist der Verlauf der Infektion inapparent. In dieser Arbeit wurde auch ein Zellkultursystem gemischter Hirnzellen neugeborener Lewis-Ratten etabliert, das die Unterschiede der Virusausbreitung in vivo reflektiert und mit dem weitere Untersuchungen zum Mechanismus der Neurovirulenz durchgef{\"u}hrt werden k{\"o}nnten. Anhand der durchgef{\"u}hrten Untersuchungen mit Ratten des CD46 transgenen Lewis-Modells konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit des Rezeptors CD46 das Virulenzverhalten der getesteten Viren nicht beeinflusst. Weder mit dem Vakzinestamm Edm noch mit einem nicht an Nager adaptierten Wildtypstamm, konnte nach intracerebraler Injektion eine akute Enzephalitis induziert werden. Die Untersuchungen zeigen, dass die Neurovirulenz des an Nager-adaptierte MV-Stammes CAM/RB essentiell von den Aminos{\"a}uren Gly und Ser an Position 195 und 200 im H-Protein abh{\"a}ngt und nicht durch die transgene Expression zellul{\"a}rer Rezeptoren f{\"u}r MV vermittelt werden kann.}, subject = {Mutation}, language = {de} } @phdthesis{Klagge2001, author = {Klagge, Ingo M.}, title = {Interaktion von Masernviren mit humanen Dendritischen Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180982}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Das Masernvirus ist ein Mitglied der Familie der Paramyxoviridae. Obwohl eine wirksame attenuierte Lebendvakzine erh{\"a}ltlich ist, bleiben Masern eine bedeutende virale Infektionserkrankung, die j{\"a}hrlich ca. eine Millionen Opfer fordert. Trotz einer w{\"a}hrend der Infektion induzierten protektiven und MV-spezifischen Immunantwort, ruft MV eine generelle Immunsuppression hervor, die zu einer St{\"o}rung der zellul{\"a}ren Immunantwort f{\"u}hrt. Diese Immunsuppression beg{\"u}nstigt bakterielle und virale Superinfektionen, was vor allem in unterentwickelten L{\"a}ndern begleitet von mangelhafter {\"a}rztlicher Versorgung und Untern{\"a}hrung zu einem fatalen Ausgang einer MV-Infektion f{\"u}hrt. Die molekularen Grundlagen der MV-assoziierten Immunsuppression sind noch nicht ausreichend verstanden. Dendritische Zellen (DC) gelten als ein Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort. Sie sind entscheidend an der Ausl{\"o}sung einer prim{\"a}ren, adaptiven T-Zellantwort beteiligt und k{\"o}nnten im Falle einer MV-Infektion somit sowohl eine Rolle in der Induktion der protektiven Immunantwort als auch in der Etablierung der MV-assoziierten Immunsuppression spielen. Tats{\"a}chlich sind DC, die in vitro aus humanen Monozyten des peripheren Bluts (MoDC) generiert wurden, durch MV-St{\"a}mme infizierbar. Dabei zeigten sogenannte Wildtypst{\"a}mme im Vergleich mit Vakzinest{\"a}mmen eine schnellere Inektionskinetik einhergehend mit einem st{\"a}rkeren zytopathischen Effekt (CPE) in den MoDC-Kulturen. Zudem konnte festgestellt werden, dass eine Infektion der MoDC-Kulturen zu einer Aktivierung und Ausreifung der Zellen f{\"u}hrte, wobei es zur Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen kam. Neben Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a) konnte Typ I-Interferon (IFN) nachgewiesen werden, das die Expression des kostimulatorischen Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}ls CD86 induzierte. MV-Infektionen beeinflussten zudem die Sekretion von Interleukin 12 (IL-12), das als ein Schl{\"u}sselzytokin f{\"u}r die Polarisierung von T-Zellantworten angesehen wird. Infektionen mit einem prototypischen MV-Vakzinestamm (ED-B) f{\"u}hrten unter allen Stimulationsbedingungen zu einer Hemmung oder deutlichen Reduktion der sezernierten Mengen IL-12. Eine Infektion mit dem Wildtypstamm WTF hingegen induzierte bereits ohne weitere Stimulation der MoDC IL-12 und verst{\"a}rkte die Sekretion an IL-12 nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS). Trotz der zu beobachtenden Aktivierung der MoDC nach Infektion mit MV zeigten diese MoDC-Kulturen in einem funktionellen Test, einer allogenen mixed leukocyte reaction (MLR), keine Stimulation der T-Zellproliferation. Es zeigte sich, dass das Ausbleiben der T-Zellproliferation mit der Zahl an MV-infizierten MoDC korrelierte. MV-infizierte MoDC-Kulturen hemmten zudem die Proliferation von T-Zellkulturen, die mit Phytoh{\"a}magglutinin (PHA) oder mit Staphylococcusenterotoxin A (SEA) aktiviert worden waren. Diese dominant hemmende Wirkung MV-infizierter MoDC-Kulturen unterblieb, wenn rekombinante MV eingesetzt wurden, denen die MV-spezifischen Glykoproteine H und F fehlten.}, subject = {Dendritische Zelle}, language = {de} } @phdthesis{Schlereth2000, author = {Schlereth, Bernd}, title = {Entwicklung alternativer Vakizinierungsstrategien gegen Masernvirusinfektionen im Tiermodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1982}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Trotz der Existenz einer Lebendvakzine gegen Masernvirusinfektionen erkranken j{\"a}hrlich 30-40 Millionen Menschen an Masern und mehr als 1 Million versterben daran. Besonders Kleinkinder besitzen innerhalb des ersten Lebensjahres ein hohes Risiko an Masern zu erkranken und der Anteil an schweren Krankheitsverl{\"a}ufen mit letalem Ausgang ist in dieser Altersgruppe besonders hoch. Aus diesem Grund w{\"a}re es sehr wichtig, wenn man S{\"a}uglinge bereits in den ersten Lebensmonaten erfolgreich immunisieren k{\"o}nnte. Da eine Immunisierung mit dem derzeitigen MV-Impfstoff in den ersten Lebensmonaten durch maternale MV-spezifische Antik{\"o}rper inhibiert wird, hat die WHO dazu aufgerufen neuartige Impfstoffe zu entwickeln, die in Gegenwart maternaler Antik{\"o}rper effektiv sind. Zur Entwicklung und Erprobung von alternativen Impfstoffen in Gegenwart maternaler Antik{\"o}rper konnte bislang nur das Affenmodell benutzt werden, welches durch das geringe Angebot an Tieren und aus praktischen Gr{\"u}nden nur beschr{\"a}nkt einsetzbar ist. In der hier vorgestellten Dissertation wurde gezeigt, daß Baumwollratten (Sigmodon hispidus) alternativ zum Affen ein hervorragendes Tiermodell sind, um die Immunogenit{\"a}t potentieller Impfstoffvektoren und ihre Effektivit{\"a}t in Gegenwart maternaler Antik{\"o}rper zu testen. Baumwollratten sind das einzige Nagetiermodell, in dem das Masernvirus wie beim Menschen im Respirationstrakt replizieren und auch in der Peripherie nachgewiesen werden kann. Nach Immunisierung mit MV-Impfst{\"a}mmen entwickeln Baumwollratten wie der Mensch eine MV-spezifische Immunantwort und sind gegen eine anschließende Infektion mit MV-Wildtypst{\"a}mmen gesch{\"u}tzt. Um zu {\"u}berpr{\"u}fen, ob maternale Antik{\"o}rper wie bei S{\"a}uglingen auch bei Baumwollratten die Vakzine-induzierte Serokonversion inhibieren, wurden zwei Modellsysteme f{\"u}r maternale Antik{\"o}rper entwickelt. MV-immune Weibchen {\"u}bertragen MV-spezifische maternale Antik{\"o}rper auf ihre Jungtiere und stellen ein Modell f{\"u}r nat{\"u}rliche maternale Antik{\"o}rper dar. Im zweiten Modell k{\"o}nnen nach Injektion eines humanen MV-spezifischen Serums in Baumwollratten maternale Antik{\"o}rper simuliert werden. Die Vakzine-induzierte Serokonversion wurde sowohl durch nat{\"u}rliche maternale Antik{\"o}rper, als auch durch passiv transferierte humane MV-spezifische Antik{\"o}rper inhibiert. Die Verwendung eines heterologen Serums als Modell f{\"u}r maternale Antik{\"o}rper bietet drei Vorteile: die Gabe von Humanserum ist gut reproduzierbar, humane MV-spezifische Antik{\"o}rper werden schneller abgebaut, als nat{\"u}rliche maternale Antik{\"o}rper und passiv transferierte ("maternale") Antik{\"o}rper k{\"o}nnen im ELISA von aktiv induzierten Antik{\"o}rpern unterschieden werden. Mit Hilfe der DNS-Immunisierung konnte gezeigt werden, daß das MV-H{\"a}magglutinin, das Fusionsprotein und das Nukleokapsidprotein (MV-Hauptantigene) in der Baumwollratte MV-spezifische Antik{\"o}rper und eine MV-spezifische T-Zellantwort induzieren. Aber nur die beiden Glykoproteine F und H konnten im Gegensatz zum Nukleokapsidprotein MV-neutralisierende Antik{\"o}rper induzieren und gegen eine Infektion des Respirationstraktes sch{\"u}tzen. In Gegenwart maternaler Antik{\"o}rper f{\"u}hrte diese Form der Immunisierung nicht zu einer Vakzine-induzierten Serokonversion und zu Protektion. Um in Gegenwart maternaler Antik{\"o}rper MV-neutralisierende Antik{\"o}rper und Schutz gegen eine Infektion mit MV zu induzieren, wurde ein rekombinantes vesikul{\"a}res Stomatitis Virus (VSV-H) verwendet, welches das MV-H{\"a}magglutinin (Hauptantigen f{\"u}r MV-neutralisierende Antik{\"o}rper) in der H{\"u}lle von VSV exprimierte. Eine alternative MV-Vakzine muß die beiden MV-Glykoproteine (H{\"a}magglutinin- und Fusionsprotein) enthalten, da sie sonst die atypischen Masern (eine schwere Verlaufsform der akuten Masern) in immunisierten Individuen nach Infektion mit dem Wildtypvirus induzieren kann. Da VSV das Fusionsprotein nicht stabil exprimiert, kann VSV nicht als Impfvektor bei Patienten eingesetzt werden. Im Baumwollrattensystem ließen sich mit diesem Vektorsystem jedoch wichtige Untersuchungen zur Immunisierung in Gegenwart maternaler Antik{\"o}rper duchf{\"u}hren. Das MV-H{\"a}magglutinin ist als zus{\"a}tzliches Protein ("passenger protein") in die H{\"u}llmembran von VSV inkorporiert und hat keine funktionelle Bedeutung f{\"u}r die virale Replikation. In vitro konnte gezeigt werden, daß VSV-H im Gegensatz zu MV durch MV-spezifische Antik{\"o}rper nicht neutralisiert werden kann. Eine Immunisierung mit VSV-H induzierte sehr schnell hohe Titer an MV-neutralisierenden Antik{\"o}rpern, die h{\"o}her waren als nach Immunisierung mit MV. In vivo konnte best{\"a}tigt werden, das VSV-H durch maternale Antik{\"o}rper nicht neutralisiert wird und auch in Gegenwart maternaler Antik{\"o}rper MV-neutralisierende Antik{\"o}rper und Schutz gegen eine respiratorische MV-Infektion induziert. Hierbei ist die Stimulation des mukosalen Immunsystems sehr wichtig, da VSV-H nur nach intranasaler und nicht nach intraperitonealer Immunisierung maternale Antik{\"o}rper umgehen kann. Die Replikationsf{\"a}higkeit von VSV-H ist ebenfalls essentiell, da Immunisierungsversuche mit UV-inaktiviertem VSV-H bzw. mit VSV-H Deletionsmutanten, die eine stark verminderte Replikationsf{\"a}higkeit aufweisen, nicht zu Vakzine-induzierter Serokonversion und zu Schutz in Gegenwart maternaler Antik{\"o}rper f{\"u}hrten. An alternative Vektorsysteme muß deshalb die Forderung gestellt werden, daß sie das Schleimhaut-assoziierte Immunsystem stimulieren, Masernvirusproteine als akzessorische Proteine exprimieren und eine gewisse Restvirulenz aufweisen. F{\"u}r die Untersuchung derartiger Vakzine-Kandidaten auf die Induktion der Serokonversion in Gegenwart maternaler Antik{\"o}rper und Schutz gegen MV Infektion ist das Baumwollrattenmodell hervorragend geeignet.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @article{SchneiderSchauliesLiebertBaczkoetal.1988, author = {Schneider-Schaulies, Sibylle and Liebert, U. G. and Baczko, K. and ter Meulen, Volker}, title = {Molecular Biological Analyses of Measles Virus Gene Expression in the CNS of Acutely and Persistently Infected Rat Brain Cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34104}, year = {1988}, abstract = {No abstract available}, subject = {Masernvirus}, language = {en} } @article{LiebertSchneiderSchauliesterMeulen1988, author = {Liebert, U. G. and Schneider-Schaulies, Sibylle and ter Meulen, V.}, title = {Measles Virus infections of the central nervous system (CNS) of rats}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34087}, year = {1988}, abstract = {No abstract available}, subject = {Masernvirus}, language = {en} } @phdthesis{SchneiderSchaulies1988, author = {Schneider-Schaulies, Sibylle}, title = {Molekularbiologische Charakterisierung der Masernvirusreplikation in zentralen Nervensystem von Lewis- und BN-Ratten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78465}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {1988}, abstract = {Einleitung: Das Masernvirus (MV) ist ein hochkontagi{\"o}ser, primatenpathogener Erreger, der f{\"u}r die bekannte Masernerkrankung verantwortlich ist...}, subject = {Medizin}, language = {de} }