@phdthesis{Hesse2006,
  author    = {Hesse, Britta Dorothea},
  title     = {Modulation des renalen organischen Anionentransporters hOAT1 durch EGF},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18901},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Eine der Hauptaufgaben der Niere besteht in der Ausscheidung k{\"o}rpereigener und k{\"o}rperfremder Abfallstoffe und Stoffwechselmetabolite. Eine Reihe dieser Substanzen geh{\"o}rt zur Gruppe der organischen Anionen, diese werden mit Hilfe eines eigenen Transportsystems aus dem Blut durch die Nierenepithelzelle in den Urin transportiert. Eines der wichtigsten Transportproteine dieses Ausscheidungssystems ist der organische Anionentransporter hOAT1 der basolateralen Zellmembran. Es ist bekannt, dass die an der Stoffausscheidung beteiligten Transportproteine modulatorischen Einfl{\"u}ssen unterliegen k{\"o}nnen. K{\"u}rzlich fanden sich an OK (opossum kidney)-Zellen Hinweise, dass der Wachstumsfaktor EGF das Transportsystem f{\"u}r organische Anionen stimulieren kann, ohne dass die genaue Identit{\"a}t der beteiligten Transportproteine aufgekl{\"a}rt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der akute, modulatorische Einfluß des Wachstumsfaktors EGF auf ein definiertes menschliches Transportprotein f{\"u}r organische Anionen, den hOAT1, untersucht. Die menschliche Nierenepithelzelllinie IHKE1 wurde zu diesem Zweck mit dem hOAT1-Transportprotein stabil transfiziert. Die Versuchsergebnisse zeigten eine hohe basolaterale Transportaktivit{\"a}t der transfizierten Zellen f{\"u}r organische Anionen, und nach einer zehnmin{\"u}tigen Vorinkubation mit EGF eine deutliche Stimulation der basolateralen Aufnahmeaktivit{\"a}t. Durch EGF wird also in menschlichen Nierenepithelien der organische Anionentransport akut {\"u}ber das hOAT1-Protein in der basolateralen Zellmembran stimuliert. Es konnte gezeigt werden, dass die intrazellul{\"a}re Signaltransduktion dieses stimulierenden Effektes durch die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt wird. In der Absicht, mehr Aufschluss {\"u}ber die Mechanismen der intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion vom EGF-Rezeptor an den hOAT1 zu gewinnen, etablierten wir das System aus EGF-Rezeptor HER1 und Anionentransporter hOAT1 f{\"u}r weitere Versuche in der CHO-Zelllinie. In CHO-HER1-Zellen f{\"u}hrte eine Vorinkubation mit EGF zu einer Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, und CHO-hOAT1-Zellen zeigten im Gegensatz zum CHO-Wildtyp eine deutliche Transportaktivit{\"a}t f{\"u}r Fluorescein. In ko-transfizierten CHO-HER1-hOAT1-Zellen konnte in IHKE1-hOAT1-Zellen ein modulatorischer Effekt des Wachstumsfaktors auf die Aktivit{\"a}t des Anionentransporters nachgewiesen werden. EGF bewirkte jedoch hier keine Stimulation, sondern eine (ebenfalls {\"u}ber die Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2 vermittelte) Hemmung des hOAT1-Transportproteins. EGF wirkt also in den unpolaren CHO-Zellen genau gegens{\"a}tzlich auf das hOAT1-Transportprotein wie an der basolateralen Membran der polaren, epithelialen IHKE1-Zellen, in beiden F{\"a}llen wird jedoch die Wirkung {\"u}ber die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt. Wie reagieren nun in polaren IHKE1-Zellen hOAT1-Proteine, die sich nicht in der basolateralen Membran befinden? Zur Kl{\"a}rung dieser Frage nutzten wir den Umstand, dass der hOAT1 in transfizierten IHKE1-hOAT1-Zellen stark {\"u}berexprimiert wird, und untersuchten die Wirkung von EGF auf die apikale Fluoresceinaufnahme. Im Transportversuch zeigte sich in IHKE1-hOAT1-Zellen ohne EGF eine gegen{\"u}ber dem Wildtyp signifikante Fluoresceinaufnahme an der apikalen Membran. Auf eine Vorinkubation mit EGF reagierten IHKE1-hOAT1-Zellen mit einer Hemmung dieser apikalen Fluoresceinaufnahme. Die hOAT1-Transportproteine in der apikalen Membran der IHKE1-hOAT1-Zellen reagierten somit genauso auf EGF wie Transportproteine in unpolaren CHO-Zellen: In beiden Versuchsaufbauen fand sich eine Hemmung der Fluoresceinaufnahme. In CHO-Zellen wurde diese Hemmung vermittelt {\"u}ber eine Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, in IHKE1-Zellen jedoch erfolgte die Hemmung unabh{\"a}ngig davon. Ein stimulierender Effekt von EGF auf den hOAT1, den die Ergebnisse an OK-Zellen nahegelegt hatten, fand sich nur an der basolateralen Membran von IHKE1-hOAT1-Zellen. Ob die unterschiedliche Wirkung von EGF auf hOAT1-Transportproteine in der basolateralen und der apikalen Nierenepithelmembran eine physiologische Bedeutung hat, l{\"a}sst sich nur vermuten. Denkbar w{\"a}re jedoch, dass durch gleichzeitige Stimulation der basolateralen Aufnahme und Hemmung des R{\"u}cktransportes durch die apikale Membran eine ausreichende Sekretion organischer Anionen {\"u}ber EGF vermittelt auch bei entz{\"u}ndlicher Sch{\"a}digung des Nierencortex oder im Falle einer Isch{\"a}mie gew{\"a}hrleistet bleibt.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kroiss2006,
  author    = {Kroiß, Matthias},
  title     = {Die subzellul{\"a}re Verteilung des Regulatorproteins RS1 in Nierenepithelzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20712},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Diese Arbeit bedient sich der Immunfluoreszenzmikroskopie, um die intrazellul{\"a}re Lokalisation des mit der Plasmamembran assoziierten Regulatorproteins RS1 und eines seiner Zielproteine, des Natrium-D-Glucose-Kotransporters SGLT1, in Zellkulturmodellen des Nierenepithels (LLC-PK1- und HEK293-Zellen) zu untersuchen. Zwei polyklonale Antik{\"o}rper gegen das RS1-Protein des Schweins (pRS1) wurden daf{\"u}r erzeugt. In Untersuchungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fand sich pRS1 an der Plasmamembran, im Zellkern, intrazellul{\"a}r an Vesikeln sowie an einem perinukle{\"a}ren Kompartiment. Die Lokalisation des Proteins im Kern von LLC-PK1-Zellen nahm mit zunehmender Differenzierung der Zellen ab, pRS1 wurde in differenzierten Zellen lediglich im perinukle{\"a}ren Kompartiment gefunden. Dieses wurde in Kolokalisationsstudien als trans-Golgi-Netzwerk (TGN) identifiziert und dort eine Kolokalisation von pRS1 mit Clathrin und Dynamin nachgewiesen. Durch Behandlung der Zellen mit Brefeldin A wurde der Verlust von pRS1 vom TGN induziert. SGLT1 wurde {\"u}berwiegend in Endosomen nachgewiesen, die entlang von Microtubuli organisiert waren. Auch im trans-Golgi-Netzwerk wurde die Anwesenheit von SGLT1 gezeigt. pSGLT1 kolokalisierte dort mit Dynamin aber nicht mit Clathrin. Es wurde demonstriert, dass experimentelle Hemmung der Proteasoms die Menge an pRS1 drastisch erh{\"o}ht und gegenl{\"a}ufig die des Natrium-D-Glucose-Kotransporter (pSGLT1) abnimmt. Die gewonnenen Daten wurden in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, das die gezeigten Ergebnisse mit fr{\"u}her gewonnenen funktionellen Experimente zu einem schl{\"u}ssigen Konzept zusammenf{\"u}hrt.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Theiss2005,
  author    = {Theiß, Stephanie},
  title     = {Identifizierung und Charakterisierung des vakuolaren ABC-Transporters Mlt1p und der Phospholipase B Plb5p von Candida albicans},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12905},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Die opportunistische Hefe Candida albicans ist in der Lage durch ein koordiniertes Zusammenspiel bestimmter zellul{\"a}rer Eigenschaften sich unterschiedlichen Umweltbedingungen anzupassen und unterschiedliche Nischen innerhalb des menschlichen Wirts zu kolonisieren. Die Sekretion hydrolytischer Enzyme, wie Proteinasen und Phospholipasen, stellt eine wichtige Eigenschaft des Pilzes dar, die als wesentlicher Faktor f{\"u}r die Aufrechterhaltung der Pathogenit{\"a}t von C. albicans angesehen wird. Ein Schwerpunkt der hier vorliegenden Studie ist die funktionale Charakterisierung des caPLB5-Gens, eines neuen Mitglieds der insgesamt 5 Mitglieder umfassenden Phospholipase-B-Genfamilie. Im Gegensatz zu den gut untersuchten sekretorischen PLBs caPlb1p and caPlb2p scheint das caPlb5-Protein GPI-verankert und letztlich zellwandgebunden zu sein. Mittels Northernexpressions-Studien ließen sich in verschiedenen C.-albicans-St{\"a}mmen und unterschiedlichen Wachstumsbedingungen caPLB5-spezifische Transkripte nachweisen. W{\"a}hrend des Hefe-Hyphe-Wechsels in Lee's Medium zeigte sich interessanterweise eine differentielle Regulation der Gene caPLB5, caPLB1 and caPLB2. Durch Sequenzanalyse einzelner caPLB5-Allele konnte die Anwesenheit zweier unterschiedlicher Allele in C. albicans bei verschiedenen St{\"a}mmen nachgewiesen werden. Die gezielte Geninaktivierung beider Allele in zwei verschiedenen St{\"a}mmen resultierte in einer attenuierten Virulenz, was sich im Mausmodell f{\"u}r systemische Infektion anhand des Kolonisationsgrads des Wirtsgewebes messen ließ. Die Ph{\"a}notypen sowohl der Nullmutanten als auch der caPLB5-Revertanten belegen, dass die Phospholipase B caPlb5p f{\"u}r die vollst{\"a}ndige Virulenz des Pathogens ben{\"o}tigt wird und dabei eine Rolle bei der in vivo Organbesiedlung spielt. Diese Arbeit pr{\"a}sentiert zudem die Isolierung und Charakterisierung des ATP-Binding-Cassette-(ABC)-Transporter-Gens caMLT1 aus C. albicans. CaMlt1p z{\"a}hlt zur MRP/CFTR-Unterfamilie ATP-bindender Transportproteine, eine Proteinkategorie, die in diesem Pilz bislang noch nicht beschrieben wurde. Energiebetriebene Transportproteine der ABC-Superfamilie schleusen eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate aktiv durch biologische Membranen und erf{\"u}llen dabei wichtige Funktionen im zellul{\"a}ren Metabolismus und in der Entgiftung. Das caMlt1-Protein zeigt hohe sequenzielle und strukturelle {\"A}hnlichkeiten zu den vakuolaren Efflux-Pumpen Ycf1p und Bpt1p von S. cerevisiae. Durch genomische Markierung mit dem gr{\"u}n fluoreszierenden GFP-Protein konnte caMlt1p in der vakuolaren Membran lokalisiert werden. Northernblothybridisierungen belegten die Induzierbarkeit der Gentranskripte durch die metabolischen Gifte Cadmium und CDNB, beides Substrate der scYcf1-Pumpe. Obwohl diese Untersuchungen darauf hindeuten, dass caMlt1p ein Ortholog von scYcf1p sein k{\"o}nnte, zeigte sich bei dem Komplementationsversuch einer scycf1-negativen S.-cerevisiae-Mutante mit einer caMLT1-Genkopie keine Reversion des sensitiven Ph{\"a}notyps gegen{\"u}ber Cadmium oder CDNB. Auch wiesen die in dieser Arbeit konstruierten, camlt1-negativen Mutanten in C. albicans, die zur Identifizierung potentieller caMlt1p-Substrate eingesetzt wurden, keinen hypersensitiven Ph{\"a}notyp gegen{\"u}ber CdCl2, CDNB oder irgendeiner anderen getesteten inhibitorischen Substanz auf. CaMlt1p ist demzufolge kein funktionales Homolog von scYcf1p. Als vakuolar lokalisiertes Protein weist caMLT1 ein f{\"u}r diese Proteingruppe typisches Transkriptionsprofil auf. Die mRNA-Expression erfolgt dabei wachstumsphasenabh{\"a}ngig mit der h{\"o}chsten Geninduktion w{\"a}hrend des Diauxic-Shifts, wenn ein Mangel an Glucose (und anderen N{\"a}hrstoffen) im Medium entsteht. Eine generierte camlt1-Nullmutante war interessanterweise in einem murinen Peritonitismodell in ihrer F{\"a}higkeit die Leber zu invadieren drastisch reduziert. Durch Reintegration einer funktionalen caMLT1-Genkopie konnte der Virulenzdefekt aufgehoben werden. CaMlt1p scheint in die F{\"a}higkeit von C. albicans involviert zu sein an intestinale Organe adh{\"a}rieren und Gewebebarrieren penetrieren zu k{\"o}nnen, m{\"o}glicherweise durch Einbindung des Transporters in Stressantwort- und Detoxifikationsmechanismen. Beide Gene, caMLT1 und caPLB5, wurden auf zweierlei Weise inaktiviert: mittels einer klassischen Mutagenesemethode f{\"u}r C. albicans (dem URA3-Blaster-System im Ura--auxotrophen Stamm CAI4) und durch Entwicklung eines neuen dominanten Selektionssysstems. Die dominante Selektion basiert dabei auf der genomischen Insertion einer Einzelkopie eines mutierten caIMH3-Allels (MPAR), das Transformanten Resistenz gegen{\"u}ber Mycophenols{\"a}ure (MPA) verleiht. Dieses System erm{\"o}glicht die genetische Manipulation von C. albicans Wildtypst{\"a}mmen, wodurch die m{\"u}hselige Konstruktion auxotropher und oft avirulenter St{\"a}mme nicht mehr n{\"o}tig ist.},
  subject      = {Candida albicans},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Geiger2004,
  author    = {Geiger, Dietmar},
  title     = {Biophysikalische Untersuchung von Phloem-lokalisierten Carriern und Kaliumkan{\"a}len und deren Interaktion im Modellsystem der Xenopus Oozyte},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13108},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Das Phloem stellt ein Netzwerk zur Assimilat- und N{\"a}hrstofftranslokation sowie zur elektrischen Kommunikation innerhalb der Pflanze dar. In apoplastisch beladenden Pflanzen werden die funktionellen Eigenschaften des Phloems im Wesentlichen vom Zusammenspiel eines Transportmoduls, bestehend aus Carriern, Kaliumkan{\"a}len und Protonen-ATPasen, bestimmt. Ausgangspunkt f{\"u}r die biophysikalische Charakterisierung dieses Phloem-Transportmoduls waren Arbeiten zum Saccharosetransport in der Arabidopsis akt2/3-1 Mutante. Das AKT2/3 Gen kodiert f{\"u}r einen Phloem-spezifischen Kaliumkanal vom Shaker-Typ. Die Tatsache, dass der Saccharosegehalt im Phloem dieser Mutante um 50\% im Vergleich zum Wildtyp reduziert war, ließ eine enge Kopplung von Kalium- und Zuckerfl{\"u}ssen vermuten. Um diesen Ph{\"a}notyp aufkl{\"a}ren zu k{\"o}nnen und ein Modell f{\"u}r die Beladungsprozesse an der Phloemmembran zu entwickeln, wurde das heterologe Expressionssystem der Xenopus Oozyten gew{\"a}hlt. So konnte in Coexpressionsstudien die Interaktion von Phloem-lokalisierten Kaliumkan{\"a}len und Transportern sowie die Kopplung des Kalium- und Zuckertransports mit Hilfe biophysikalischer Methoden untersucht werden.},
  subject      = {Phloem},
  language  = {de}
}