@phdthesis{Herrmann2023,
  author    = {Herrmann, Ruth Magdalena},
  title     = {Molekular- und zellbiologische Untersuchung zur Rolle des kanonischen Wnt-Signalwegs bei der Entwicklung von \(Echinococcus\) \(multilocularis\)},
  doi       = {10.25972/OPUS-27193},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-271937},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Die alveol{\"a}re Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-K{\"o}rperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncosp{\"a}ren-Larve zun{\"a}chst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikul{\"a}res, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und f{\"u}hrt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP K{\"o}rperachse evolutionsgeschichtlich konserviert {\"u}ber den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis {\"u}ber molekular- und zellbiologische Studien n{\"a}her beleuchtet. Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Prim{\"a}rzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. {\"U}ber RNA-Sequenzierung wurde zun{\"a}chst gezeigt, dass in Prim{\"a}rzellkulturen sowohl Markergene f{\"u}r posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch f{\"u}r Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und f{\"u}hrte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot' Ph{\"a}notyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Ph{\"a}notyp f{\"u}r E. multilocularis-Prim{\"a}rzellen. Prim{\"a}rzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte F{\"a}higkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine {\"U}berproliferation von germinativen Zellen. Zus{\"a}tzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, w{\"a}hrend Anterior- und Protoskolexmarker deutlich {\"u}berexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten f{\"u}r eine Reihe ausgew{\"a}hlter Markergene f{\"u}r posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und f{\"u}r anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten F{\"a}llen zeigte sich durch {\"A}nderung der Polarit{\"a}t eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, w{\"a}hrend Anteriormarker deutlich erh{\"o}ht exprimiert wurden. {\"A}hnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, f{\"u}hrt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt. Neben Markergenen f{\"u}r die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche f{\"u}r die medio-laterale (ML)-K{\"o}rperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der K{\"o}rper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, {\"a}hnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarit{\"a}t zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollst{\"a}ndig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der K{\"o}rperachsen w{\"a}hrend der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP K{\"o}rperachse auch eine solche der ML Achse beitr{\"a}gt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und k{\"o}nnten in Zukunft in {\"a}hnlicher Weise f{\"u}r eine zielgerichtete Therapie von AE dienen.},
  subject      = {Fuchsbandwurm},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Herz2015,
  author    = {Herz, Michaela},
  title     = {Molecular characterization of the serotonin and cAMP-signalling pathways in Echinococcus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-139249},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Alveolar and cystic echinococcosis, caused by Echinococcus multilocularis and Echinococcus granulosus respectively, are severe zoonotic diseases with limited treatment options. The sole curative treatment is the surgical removal of the complete parasite material. Due to late diagnosis, chemotherapeutic treatment often is the only treatment option. Treatment is based on benzimidazoles, which merely act parasitostatic and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs are urgently needed. Evolutionarily conserved signalling pathways are known to be involved in hostparasite cross-communication, parasite development and survival. Moreover, they represent potential targets for chemotherapeutic drugs. In this context the roles of the serotonin- and cAMP-signalling pathways in Echinococcus were studied. Genes encoding serotonin receptors, a serotonin transporter and enzymes involved in serotonin biosynthesis could be identified in the E. multilocularis and E. granulosus genomes indicating that these parasites are capable of synthesizing and perceiving serotonin signals. Also the influence of exogenous serotonin on parasite development was studied. Serotonin significantly increased metacestode vesicle formation from primary cells and re-differentiation of protoscoleces. Inhibition of serotonin transport with citalopram significantly reduced metacestode vesicle formation from primary cells and caused death of protoscoleces and metacestodes. Furthermore, it could be shown that serotonin increased phosphorylation of protein kinase A substrates. Taken together, these results show that serotonin and serotonin transport are essential for Echinococcus development and survival. Consequently, components of the serotonin pathway represent potential drug targets. In this work the cAMP-signalling pathway was researched with focus on G-protein coupled receptors and adenylate cyclases. 76 G-protein coupled receptors, including members of all major families were identified in the E. multilocularis genome. Four genes homologous to adenylate cyclase IX were identified in the E. multilocularis genome and three in the E. granulosus genome. While glucagon caused no significant effects, the adenylate cyclase activator forskolin and the adenylate cyclase inhibitor 2', 5' didesoxyadenosine influenced metacestode vesicle formation from primary cells, re-differentiation of protoscoleces and survival of metacestodes. It was further shown that forskolin increases phosphorylation of protein kinase A substrates, indicating that forskolin activates the cAMP-pathway also in cestodes. These results indicate that the cAMP signalling pathway plays an important role in Echinococcus development and survival. To complement this work, the influence of different media and additives on E. granulosus protoscoleces was investigated. Anaerobic conditions and the presence of FBS prolonged protoscolex survival while different media influenced protoscolex activation and development. Taken together, this work provided important insights into developmental processes in Echinococcus and potential drug targets for echinococcosis chemotherapy.},
  subject      = {Serotonin},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schubert2015,
  author    = {Schubert, Andreas},
  title     = {Protein kinases as targets for the development of novel drugs against alveolar echinococcosis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-113694},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {The metacestode larval stage of the fox tapeworm Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), one of the most lethal zoonosis of the northern hemisphere. The development of metacestode vesicles by asexual multiplication and the almost unrestricted infiltrative growth within the host organs is ensured from a population of undifferentiated, proliferative cells, so-called germinative cells. AE treatment options include surgery, if possible, as well as Benzimidazole-based chemotherapy (BZ). Given that the cellular targets of BZs, the -tubulins, are highly conserved between cestodes and humans, the chemotherapy is associated with considerable side-effects. Therefore, BZ can only be applied in parasitostatic doses and has to be given lifelong. Furthermore, the current anti-AE chemotherapy is ineffective in eliminating the germinative cell population of the parasite, which leads to remission of parasite growth as soon as therapy is discontinued. This work focuses on protein kinases involved in the proliferation and development of the parasite with the intention of developing novel anti-AE therapies. Polo-like kinases (Plks) are important regulators of the eukaryotic cell cycle and are involved in the regulation and formation of the mitotic spindles during the M-phase of the cell cycle. Plks have already been shown to be associated with deregulated cellular growth in human cancers and have been investigated as novel drug targets in the flatworm parasite Schistosoma mansoni. In the first part of this work, the characterisation of a novel and druggable parasite enzyme, EmPlk1, which is homologous to the polo-like kinase 1 (Plk1) of humans and S. mansoni (SmPlk1), is presented. Through in situ hybridisation, it could be demonstrated that emplk1 is specifically expressed in the Echinococcus germinative cells. Upon heterologous expression in the Xenopus oocyte system, EmPlk1 induced germinal vesicle breakdown, thus indicating that it is an active kinase. Furthermore, BI 2536, a compound originally designed to inhibit the human ortholog of EmPlk1, inhibited the EmPlk1 activity at a concentration of 25 nM. In vitro treatment of parasite vesicles with similar concentrations of BI 2536 led to the elimination of the germinative cells from Echinococcus larvae, thus preventing the growth and further development of the parasite. In in vitro cultivation systems for parasite primary cells, BI 2536 effectively inhibited the formation of new metacestode vesicles from germinative cells. Thus, BI 2536 has profound anti-parasitic activities in vitro at concentrations well within the range of plasma levels measured after the administration of safe dosages to patients (50 nM after 24 h). This implies that EmPlk1 is a promising new drug target for the development of novel anti-AE drugs that would specifically affect the parasite's stem cell population, namely the only parasite cells capable of proliferation. In addition to the chemotherapeutic aspects of this work, the inhibitor BI 2536 could be further used to study the function of stem cells in this model organism, utilising a method of injection of parasite stem cells into metacestode vesicles, for instance, as has been developed in this work. In the second part of this work, a novel receptor tyrosine kinase, the Venus flytrap kinase receptor (EmVKR) of E. multilocularis has been characterised. Members of this class of single-pass transmembrane receptors have recently been discovered in the related trematode S. mansoni and are associated with the growth and differentiation of sporocyst germinal cells and ovocytes. The ortholog receptor in EmVKR is characterised by an unusual domain composition of an extracellular Venus flytrap module (VFT), which shows significant similarity to GABA receptors, such as the GABAB receptor (γ-amino butyric acid type B) and is linked through a single transmembrane domain to an intracellular tyrosine kinase domain with similarities to the kinase domains of human insulin receptors. Based upon the size (5112bp) of emvkr and nucleotide sequence specificities, efforts have been made to isolate the gene from cell culture samples to study the ligand for the activation of this receptor type in Xenopus oocytes. To date, this type of receptor has only been described in invertebrates, thus making it an attractive target for drug screening. In a first trial, the ATP competitive inhibitor AG 1024 was tested in our in vitro cell culture. In conclusion, the EmVKR represents a novel receptor tyrosine kinase in E. multilocularis. Further efforts have to be made to identify the activating ligand of the receptor and its cellular function, which might strengthen the case for EmVKR as a potential drug target. The successful depletion of stem cells in the metacestode vesicle by the Plk1 inhibitor BI 2536 gives rise to optimising the chemical component for EmPlk1 as a new potential drug target. Furthermore, this inhibitor opens a new cell culture technique with high potential to study the cellular behaviour and influencing factors of stem cells in vitro.},
  subject      = {Chemotherapie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Nono2012,
  author    = {Nono, Justin},
  title     = {Immunomodulation through Excretory/Secretory Products of the parasitic Helminth Echinococcus multilocularis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85449},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die Alveol{\"a}re Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Zoonose, die durch das Metazestoden-Larvenstadium des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis ausgel{\"o}st wird. Nach Eintritt des Parasiten in den Zwischenwirt wird zun{\"a}chst eine potentiell anti-parasitische, Th1-dominierte Immunantwort ausgel{\"o}st, welche anschließend in der chronischen Phase graduell durch eine permissive, Th2-dominierte Antwort ersetzt wird. Als Ergebnis einer zugrunde liegenden Immunmodulation durch den Parasiten k{\"o}nnen Echinococcus-Larven f{\"u}r Jahre bis Jahrzehnte im Wirt persistieren und verhalten sich {\"a}hnlich einem perfekt transplantierten Organ. {\"U}ber die molekulare Basis der Immunmodulation durch den Parasiten ist derzeit wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden geeignete Kultursysteme f{\"u}r verschiedene E. multilocularis Larvenstadien verwendet, um den Einfluss exkretorisch/sekretorischer Metaboliten (E/S-Produkte) auf Wirts-Immuneffektor-Zellen zu studieren. E/S-Produkte kultivierter Larven, die die fr{\"u}he (Prim{\"a}rzellen) und chronische (Metazestode) Phase der Infektion repr{\"a}sentieren induzierten Apoptose und tolerogene Eigenschaften in Dendritischen Zellen (DC) des Wirts, w{\"a}hrend solche von Kontroll-Larven (Protoskolizes) keine derartigen Effekte zeigten. Dies zeigt, dass die fr{\"u}hen infekti{\"o}sen Stadien von E. multilocularis in DC ein tolerierendes Milieu erzeugen, welches sehr wahrscheinlich die initiale Etablierung des Parasiten in einer Phase beg{\"u}nstigt, in der er h{\"o}chst sensitiv gegen{\"u}ber Wirtsangriffen ist. Interessanterweise f{\"o}rderten E/S-Produkte des Metazestoden in vitro die Konversion von CD4+ T-Zellen in Foxp3+, regulatorische T-Zellen (Treg) w{\"a}hrend E/S-Produkte von Prim{\"a}rzellen oder Protoskolizes dies nicht vermochten. Da Foxp3+ Tregs generell als immunosuppressorisch bekannt sind, deuten diese Daten an, dass der Metazestode aktiv eine Induktion von Tregs herbeif{\"u}hrt, um eine permissive Immunsuppression w{\"a}hrend einer Infektion zu erreichen. Eine substantielle Zunahme von Anzahl und Frequenz Foxp3+ Tregs konnte zudem in Peritoneal-Exsudaten von M{\"a}uuen nach intraperitonealer Injektion von Parasitengewebe gemessen werden, was anzeigt, dass eine Expansion von Foxp3+ Tregs auch w{\"a}hrend der in vivo Infektion von Bedeutung ist. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit ein Activin-Orthologes des Parasiten, EmACT, identifiziert werden, weleches vom Metazestoden sekretiert wird und {\"a}hnlich wie humanes Activin in der Lage ist, eine TGF-β-abh{\"a}ngige Expansion von Tregs in vitro zu induzieren. Dies zeigt an, dass E. multilocularis evolutionsgeschichtlich konservierte Zytokine nutzt, um aktiv die Wirts-Immunantwort zu beeinflussen. Zusammenfassend deuten die gewonnenen Daten auf eine wichtige Rolle Foxp3+ Tregs, welche u.a. durch EmACT induziert werden, im immunologischen geschehen der AE hin. Ein weiterer Parasiten-Faktor, EmTIP, mit signifikanten Homologien zum T-cell Immunomodulatory Protein (TIP) des Menschen wurde in dieser Arbeit n{\"a}her charakterisiert. EmTIP konnte in der E/S-Fraktion von Prim{\"a}rzellen nachgewiesen werden und induzierte die Freisetzung von IFN-γ in CD4+ T-Helferzellen. Durch Zugabe von anti-EmTIP-Antik{\"o}rpern konnte zudem die Entwicklung des Parasiten zum Metazestoden in vitro gehemmt werden. EmTIP d{\"u}rfte daher einerseits bei der fr{\"u}hen Parasiten-Entwicklung im Zwischenwirt eine Rolle spielen und k{\"o}nnte im Zuge dessen auch die Auspr{\"a}gung der fr{\"u}hen, Th-1-dominierten Immunantwort w{\"a}hrend der AE beg{\"u}nstigen. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei E. multilocularis E/S-Faktoren identifiziert, EmACT und EmTIP, die ein hohes immunmodulatorisches Potential besitzen. Die hier vorgestellten Daten liefern neue, fundamentale Einsichten in die molekularen Mechanismen der Parasiten-induzierten Immunmodulation bei der AE und sind hoch relevant f{\"u}r die Entwicklung anti-parasitischer Immuntherapien.},
  subject      = {Immunmodulation},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Hemer2012,
  author    = {Hemer, Sarah},
  title     = {Molecular characterization of evolutionarily conserved signaling systems of Echinococcus multilocularis and their utilization for the development of novel drugs against Echinococosis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74007},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Alveolar echinococcosis (AE), a severe and life-threatening disease is caused by the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis. Currently, the options of chemotherapeutic treatment are very limited and are based on benzimidazole compounds, which act merely parasitostatic in vivo and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs and targets are urgently needed. In the present work the role of two evolutionarily conserved signalling pathways in E. multilocularis, namely the insulin signalling cascade and Abl kinases, has been studied in regard to host-parasite interaction and the possible use in anti-AE chemotherapy.},
  subject      = {Fuchsbandwurm},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Konrad2007,
  author    = {Konrad, Christian},
  title     = {Molecular analysis of insulin signaling mechanisms in Echinococcus multilocularis and their role in the host-parasite interaction in the alveolar echinococcosis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22636},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {The insulin receptor ortholog EmIR of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis displays significant structural homology to the human insulin receptor (HIR) and has been suggested to be involved in insulin sensing mechanisms of the parasite's metacestode larval stage. In the present work, the effects of host insulin on Echinococcus metacestode vesicles and the proposed interaction between EmIR and mammalian insulin have been studied using biochemical and cell-biological approaches. Human insulin, exogenously added to in vitro cultivated parasite larvae, (i) significantly stimulated parasite survival and growth, (ii) induced DNA de novo synthesis in Echinococcus, (iii) affected overall protein phosphorylation in the parasite, and (iv) specifically induced the phosphorylation of the parasite's Erk-like MAP kinase orthologue EmMPK1. These results clearly indicated that Echinococcus metacestode vesicles are able to sense exogenous host insulin which induces a mitogenic response. To investigate whether EmIR mediates these effects, anti-EmIR antibodies were produced and utilized in biochemical assays and immunohistochemical analyses. EmIR was shown to be expressed in the germinal layer of the parasite both on the surface of glycogen storing cells and undifferentiated germinal cells. Upon addition of exogenous insulin to metacestode vesicles, the phosphorylation of EmIR was significantly induced, an effect which was suppressed in the presence of specific inhibitors of insulin receptor-like tyrosine kinases. Furthermore, upon expression of EmIR/HIR receptor chimera containing the extracellular ligand binding domain of EmIR in HEK 293 cells, a specific autophosphorylation of the chimera could be induced through the addition of exogenous insulin. These results indicated the capability of EmIR to sense and to transmit host insulin signals to the Echinococcus signaling machinery. The importance of insulin signaling mechanisms for parasite survival and growth were underscored by in vitro cultivation experiments in which the addition of an inhibitor of insulin receptor tyrosine kinases led to vesicle degradation and death. Based on the above outlined molecular data on the interaction between EmIR and mammalian insulin, the parasite's insulin receptor orthologue most probably mediates the insulin effects on parasite growth and is, therefore, a potential candidate factor for host-parasite communication via evolutionary conserved pathways. In a final set of experiments, signaling mechanisms that act downstream of EmIR have been analyzed. These studies revealed significant differences between insulin signaling in Echinococcus and the related cestode parasite Taenia solium. These differences could be associated with differences in the organo-tropism of both species.},
  subject      = {Fuchsbandwurm},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Spiliotis2006,
  author    = {Spiliotis, Markus},
  title     = {Untersuchungen zur in vitro Kultivierung und Charakterisierung von MAP-Kinase-Kaskade-Komponenten des Fuchsbandwurmes Echinococcus multilocularis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19385},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Es wird angenommen, dass die invasiven Stadien parasit{\"a}rer Helminthen zur Organfindung und zur Weiterentwicklung auf die Sensierung spezifischer Wirts-Signale angewiesen sind, wobei die molekulare Natur dieser Signale bislang weitgehend ungekl{\"a}rt ist. Vorangegangene Untersuchungen am Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis, dem Erreger der alveol{\"a}ren Echinokokkose, hatten bereits ergeben, dass dessen Metacestoden-Larvenstadium zur Weiterentwicklung kleine, l{\"o}sliche Wirtsmolek{\"u}le ben{\"o}tigt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein axenisches (Wirtszell-freies) Kultursystem f{\"u}r das Metacestoden-Stadium entwickelt, mittels dessen sich diese Fragestellungen in vitro angehen lassen. Mit Hilfe dieses Kultursystems konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die drei Wirts-Hormone/Zytokine, Insulin, epidermal growth factor (EGF) und bone morphogeneic protein 2 (BMP2), einen Einfluss auf die Proliferation und die Differenzierung von E. multilocularis haben. W{\"a}hrend f{\"u}r Insulin und EGF Wachstums-stimulierende Effekte gezeigt werden konnten, f{\"o}rderte BMP2 die Differenzierung des Metacestoden zum n{\"a}chsten Larvenstadium, dem Protoscolex. In Modellorganismen wie S{\"a}ugern, Drosophila und Caenorhabditis elegans verlaufen die durch Insulin- und EGF-{\"a}hnlichen Zytokine induzierten Signalmechanismen {\"u}ber die sogenannte mitogen activated protein (MAP)-Kinase-Kaskade. Um zu untersuchen, ob die externe Zugabe von Wirts-Insulin bzw. -EGF in einer Stimulierung der MAPK-Kaskade des Parasiten f{\"u}hrt, wurden in dieser Arbeit zun{\"a}chst die Komponenten dieses Signalweges bei E. multilocularis auf molekulargenetischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die Arbeiten umfassten Studien zu kleinen GTPasen des Parasiten (EmRas, EmRap1, EmRap2, EmRal), zu einem Orthologen der Kinase Raf (EmRaf), sowie Orthologen der Kinasen MEK (EmMKK) und ERK (EmERK). Es konnte gezeigt werden, dass diese Faktoren in E. multilocularis Teil einer MAP-Kinase-Kaskade sind. Zudem wurde nachgewiesen, dass diese Faktoren stromabw{\"a}rts eines EGF-Rezeptor-Orthologen (EmER) des Parasiten fungieren, welches ebenfalls in der vorliegenden Arbeit analysiert wurde. Damit wurden die Voraussetzungen geschaffen, den Einfluss exogen zugegebenen Insulins bzw. EGFs auf die Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade im Parasiten zu untersuchen. Erste Analysen zeigten bereits, dass die zentrale Komponente dieser Kaskade, EmERK, durch die genannten Wirts-Zytokine aktiviert wird. Dies legt nahe, dass Wirt-Parasit-Kommunikationsmechanismen {\"u}ber evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen der alveol{\"a}ren Echinokokkose spielen. Aufbauend auf dem axenischen Kultursystem ist es in dieser Arbeit auch erstmals gelungen, Prim{\"a}rzellkulturen f{\"u}r E. multilocularis anzulegen und die Parasitenzellen zur in vitro Neubildung von Metacestoden-Vesikeln anzuregen. Erste Experimente zur genetischen Manipulation dieser Prim{\"a}rzellen konnten erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden. Aufbauend auf der hier vorgestellten Methodik sollte es in k{\"u}nftigen Untersuchungen m{\"o}glich sein, stabil transfizierte Echinococcus-Zellen zu generieren und diese zur Herstellung vollst{\"a}ndig transgener Parasiten-Stadien zu nutzen. Dies w{\"u}rde die zur Untersuchung der E. multilocularis-Entwicklung und der Wirt-Parasit-Interaktionsmechanismen bei einer Infektion zur Verf{\"u}gung stehenden Methoden entscheidend erweitern und k{\"o}nnte u.a. zur weiteren biochemischen Analyse der in dieser Arbeit dargestellten Signalmechanismen des Parasiten herangezogen werden.},
  subject      = {Fuchsbandwurm},
  language  = {de}
}
@phdthesis{ZavalaGongora2005,
  author    = {Zavala G{\´o}ngora, Ricardo},
  title     = {Isolierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von TGF-Beta-Signaltransduktionskomponenten des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17755},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgel{\"o}sten Erkrankung der alveol{\"a}ren Echinokokkose sind bislang ungekl{\"a}rt. Zudem liegen keine Daten {\"u}ber Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die f{\"u}r die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden k{\"o}nnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits fr{\"u}hzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorg{\"a}ngen ist das TGF\&\#946;/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGF\&\#946; (transforming growth factor \&\#946;) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberfl{\"a}chenst{\"a}ndigen Rezeptoren der TGF\&\#946;-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellul{\"a}ren Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorg{\"a}ngen tierischer Organismen k{\"o}nnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation w{\"a}hrend Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGF\&\#946; und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGF\&\#946;/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgef{\"u}hrt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGF\&\#946;/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazellul{\"a}re Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGF\&\#946; activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals f{\"u}r einen parasit{\"a}ren Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGF\&\#946; wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGF\&\#946;- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 w{\"a}re durch weitere Untersuchungen zu kl{\"a}ren. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGF\&\#946;/BMP-Signalsystemen des Parasiten und S{\"a}ugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin {\"a}ußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden k{\"o}nnen. Dar{\"u}ber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen k{\"o}nnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Dom{\"a}ne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGF\&\#946;/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellul{\"a}ren Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang f{\"u}r Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis aus{\"u}bt, k{\"o}nnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 - Interaktion von entscheidender Bedeutung f{\"u}r die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveol{\"a}ren Echinokokkose sein.},
  subject      = {Fuchsbandwurm},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Jensen2002,
  author    = {Jensen, Katharina},
  title     = {Untersuchungen zum mRNA Trans-Spleißen bei den humanparasitischen Cestoden Echinococcus multilocularis und Echinococcus granulosus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5842},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {SL-Trans-Spleißen ist ein Mechanismus zur Transkriptprozessierung, welcher bisher bei kinetoplastiden Protozoen, Trematoden und Nematoden beschrieben wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals das Gen f{\"u}r einen Spliced Leader (SL) aus den Cestoden E. multilocularis und E. granulosus charakterisiert. Ausgangspunkt waren Studien zur Genregulation des E. multilocularis Gens elp, welches f{\"u}r einen Faktor der ERM-Familie kodiert. Es konnte gezeigt werden, daß elp {\"u}ber mindestens zwei unterschiedliche Transkripte kodiert wird. F{\"u}r eines dieser Transkripte konnte gezeigt werden, daß ein 32 Nukleotide langes, nicht-proteinkodierendes Exon {\"u}ber konservatives Spleißen mit dem startmethionin-kodierenden Exon II der elp-mRNA fusioniert wird. Der entsprechende Transkriptionsstartpunkt und zugeh{\"o}rige Promotorstrukturen konnten auf dem E. multilocularis Chromosom identifiziert werden. Ein zweites Transkript enthielt anstelle des 32 nt Exon I von elp ein alternatives 36 nt langes Exon am 5'-Ende, welches nicht Teil des genomischen elp Lokus ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß dieses 36 nt lange Exon einen Spliced Leader (SL) von E. multilocularis darstellt. Eine Analyse von E. multilocularis cDNA-Bibliotheken ergab, daß sich das 36 nt Exon nicht nur am 5'-Ende der elp-mRNA befindet, sondern in identischer Form auch am 5'-Ende von mindestens elf anderen mRNAs von E. multilocularis. Das zugeh{\"o}rige SL-RNA-Gen konnte isoliert und vollst{\"a}ndig charakterisiert werden. Es befand sich auf einem 1513 bp langen Fragment, welches auf dem E. multilocularis Genom als mehrfacher Repeat angeordnet ist. Auf DNA-Sequenzebene konnte gezeigt werden, daß dieses Gen signifikante Homologien zu bereits bekannten SL-RNA-Sequenzen von Trematoden und Turbellaria nicht jedoch zu solchen von Nematoden und kinetoplastiden Protozoen aufweist. Die Sekund{\"a}rstruktur der kodierten SL-RNA besitzt zudem strukturelle Charakteristika, die f{\"u}r SL-RNAs anderer Organismen bereits bekannt sind. Zusammengenommen lassen diese Daten den Schluß zu, daß es sich bei dem 36 nt langen Exon in der Tat um einen SL von E. multilocularis handelt. Die f{\"u}r E. multilocularis identifizierten trans-gespleißten mRNAs kodieren f{\"u}r Faktoren, welche an einer Reihe unterschiedlicher Prozesse in der Zelle beteiligt sind. Signifikante Unterschiede in den Spektren der trans-gespleißten Faktoren bei Echinococcus und anderen Plathelminthen k{\"o}nnen als Hinweis gewertet werden, daß keine generelle Korrelation besteht zwischen Trans-Spleißen einer bestimmten mRNA und der biologischen Funktion des Faktors. Ein zum SL-Gen von E. multilocularis hoch homologes Gen konnte zudem auf chromosomaler DNA des Hundebandwurms E. granulosus identifiziert werden. Trans-Spleißen wird demnach nicht nur vom Fuchsbandwurm, sondern auch vom Hundebandwurm zur Genexpression genutzt. Im Falle von elp besteht die ungew{\"o}hnliche Situation, daß ein identisches Protein zwei verschiedene Transkripte kodiert von denen eines konventionell und das andere trans-gespleißt wird. Der Regulationsmechanismus dieses alternativen Cis/Trans-Spleißens wurde in dieser Arbeit untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, daß den zwei elp Transkripten auch zwei unterschiedliche Prim{\"a}rtranskripte zugrunde liegen. Die dabei erlangten Daten stehen in Einklang mit dem gegenw{\"a}rtigen Modell, daß alternatives Cis/Trans-Spleißen an einer Splice Akzeptorstelle ausschließlich vom Vorhandensein einer stromaufw{\"a}rts gelegenen Splice Donorstelle abh{\"a}ngt. Weitere Studien haben gezeigt, daß die Expression der trans-oder cis-gespleißten elp-mRNA weder stadien- noch isolat-oder zytospezifische ist. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit erstmals umfassende Daten zum Mechanismus des Trans-Spleißens bei einem Cestoden erlangt werden, was sich f{\"u}r weitere molekularbiologische Untersuchungen an diesem Organismus hervorragend ausnutzen l{\"a}ßt. In einer abschließenden Studie wurde versucht einen weiteren ERM-homologen Faktor, der eventuell auch {\"u}ber alternatives Cis/Trans-Spleißen exprimiert wird, {\"u}ber PCR mit degenerativen Primern zu identifizieren. Es konnte jedoch neben elp kein anderer homologer Faktor bestimmt werden. Dieses Ergebnis entspricht den bereits bei anderen niederen Eukaryonten durchgef{\"u}hrten Untersuchungen.},
  language  = {de}
}