@phdthesis{Klein2005,
  author    = {Klein, J{\"o}rg},
  title     = {Verwendung von Gene-Targeting-Techniken zur Etablierung neuer Mauslinien mit Mutationen in B-Zell-Signalwegen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13615},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Das Hauptthema der hier vorliegenden Arbeit befaßt sich mit dem B-Zell spezifischen Oberfl{\"a}chenprotein CD22, einem Mitglied der Siglec (Sialins{\"a}ure bindende Ig{\"a}hnliche Lektine) Proteinfamilie. Dieses Transmembranprotein besitzt sieben extrazellul{\"a}re Immunoglobulin-{\"a}hnliche Dom{\"a}nen und kann {\"u}ber die {\"a}ußerste V-set Dom{\"a}ne seine Liganden: \&\#945;2,6 verkn{\"u}pfte Sialins{\"a}uren binden. CD22 hat eine Transmembrandom{\"a}ne und eine cytoplasmatische Dom{\"a}ne mit sechs potentiellen Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen drei eine ITIM-Sequenz (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) aufweisen. CD22 defiziente M{\"a}use zeigten eindeutig, daß das Siglec CD22 ein negativer Regulator des BCR-Signals ist. Durch BCR-Kreuzvernetzung wird CD22 tyrosinphosphoryliert, die inhibitorische Tyrosinphosphatase SHP-1 gebunden, aktiviert, und ist nun in der Lage das BCR Ca2+ Signal zu inhibieren. Um die Rolle der CD22Ligandenbindungsdom{\"a}ne, in vivo zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit eine CD22 knock -in Maus erzeugt werden (CD22R130E Maus), in der die Ligandenbindungsdom{\"a}ne von CD22 durch eine Punktmutation funktionell ausgeschaltet ist. In der hieraus resultierenden Mauslinie sollte dann die BZellentwicklung, Signaltransduktion und der Immunstatus analysiert werden. Der Vergleich des Ph{\"a}notyps der CD22R130E Maus und der CD22 defizienten Maus sollte dann zeigen, wie die Adh{\"a}sions- und Signalleitungseigenschaften von CD22 zusammenh{\"a}ngen. Der „Targeting" Vektor f{\"u}r die „Gene Targeting" Experimente wurde von der Arbeitsgruppe Dr. Anton van der Merwe (von Christina Piperi) angefertigt. Urspr{\"u}nglich wurde ein „Targeting" Vektor aus genomischer C57BL/6-DNA verwendet, um den genetischen Hintergrund der CD22-defizienten Maus beizubehalten. Dieser Vektor wurde von mir f{\"u}r ES-Zell Transfektionen in der C57Bl/6 ES-Zellline verwendet. Aus den Gene Targeting Experimenten mit der C57Bl/6-III ES-Zelllinie konnten zwei ES-Zellklone isoliert werden, die eine korrekte homologe Integration des Targetvektors trugen. Aus einem Blastozysteninjektions- Experiment mit einem Cre-deletierten C57BL/6-III Subklon wurden sechs hochchim{\"a}re M{\"a}use erhalten, mit denen allerdings keine Keimbahntransmission erzielt werden konnte. Nach Problemen mit Keimbahntransmission von Klonen aus der C57BL/6-III ESZelllinie, wurden noch die BALB/c und die E14Tg2a ES-Zelllinie f{\"u}r neue Gene Targeting Experimente verwendet. Die Experimente mit der BALB/c ES-Zelllinie ergaben keine ES-Zellklone mit korrekter homologer Integration, dies beruhte wahrscheinlich auf dem nicht isogenen Hintergrund. Alle folgenden Experimente mit der E14Tg2a ES-Zelllinie (genetischer Hintergrund: 129/ola) wurden mit dem verl{\"a}ngerten R130E-Targetvektor (Targetvektor 2), der mit 129/ola DNA um 2,3 Kb in 5'-Richtung verl{\"a}ngert wurde, um den isogenetischen Anteil des Targetvektors zu erh{\"o}hen, durchgef{\"u}hrt. Aus diesen Experimenten resultierten wiederum zwei ESZellklone, deren korrekte homologen Rekombination durch Southern Blot best{\"a}tigt werden konnten. Bei den darauffolgenden Blastozysten-Injektionsexperimenten mit diesen zwei E14Tg2a Klonen konnten f{\"u}nf chim{\"a}re Tiere gewonnen werden. Ein 80 \%ig chim{\"a}res M{\"a}nnchen erzeugte eine hohe Anzahl von Nachkommen mit Keimbahntransmission. Bei der Analyse dieser Tiere trat das Resultat zutage, daß alle diese Tiere mit Keimbahntransmission einen wildtypischen Genotyp besaßen. Ein weiteres Mitglied der Siglecproteinfamilie, das murine SiglecG (ein Ortholog zu humanem Siglec10), wurde in dieser Arbeit untersucht. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Paul Crocker sollte eine SiglecG knock out Maus hergestellt werden. Die Strategie f{\"u}r die Gene Targeting Experimente f{\"u}r einen SiglecG knock out basierten auf der Verwendung der BalbI ES-Zelllinie (aus BALB/c M{\"a}usen), da hiermit sehr gute Erfahrungen vorlagen, was die Stabilit{\"a}t ihrer Pluripotenz und des Keimbahntransmissionspotenzials angeht. Daher wurde im Labor von Paul Crocker (von Sheena Kerr) ein Kontroll- und ein Targetvektor kloniert, mit dem große Teile der ersten und zweiten Ig-Dom{\"a}ne von SiglecG ausgeschaltet werden sollte. Mit diesem Vektor f{\"u}hrte ich mehrere ES-Zell Transfektionsexperimente durch. Innerhalb der Zeitspanne meiner Doktorarbeit konnten keine ES-Zellklone mit einem korrekten homologen Integrationsereignis gewonnen werden. Mittels der urspr{\"u}nglichen Strategie konnte die mir nachfolgende Doktorandin jedoch ES-Zell Klone isolieren, nach Blastozysteninjektion Keimbahntransmission erzielen und somit eine SiglecGdefiziente Maus generieren. Eine andere Zusammenarbeit kam mit Dr. Burkhard Kneitz (Physiologisches Chemie I, Biozentrum, Universit{\"a}t W{\"u}rzburg) zustande. Seine Intention war es, die Rolle des TGF-\&\#946; Signalmediators SMAD2 auf B-Zellebene n{\"a}her zu untersuchen. Von Erwin B{\"o}ttinger bekamen wir eine Mauslinie, in der das Smad2-Gen gefloxt ist, die mit der CD19-Cre Maus gekreuzt wurde. So wurde eine B-Zell spezifische SMAD2 knock out Maus (bSmad2-/-) erzeugt. Meine Aufgabe bestand darin, die B-Zellkompartmente und die Immunantworten der B-Zell spezifischen Smad2-defizienten Maus zu analysieren. Faßt man alle gewonnenen Daten aus den hier generierten B-Zell spezifischen Smad2 knock out Tieren zusammen, so kann man zu dem klaren Ergebnis kommen, daß der TGF-\&\#946; Signalmediator Smad2 eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von TGF-\&\#946; Signalen in das Zellinnere von B-Zellen spielt. Hierbei zeigten sich klare Ver{\"a}nderungen, im Vergleich zu Kontrolltieren, eine Erh{\"o}hung der Zellzahl in den Peyerschen Plaques (PP), und der B1-Zellen im Peritoneum. Die IgA-Immunantwort war in bSmad-/- Tieren stark erniedrigt. Der f{\"u}r TGF-\&\#946; beschriebene Effekt der Proliferationshemmung von aktivierten B-Zellen war bei aktivierten B-Zellen der bSmad2-/- M{\"a}use hingegen nicht beeintr{\"a}chtigt.},
  subject      = {B-Lymphozyt},
  language  = {de}
}