@phdthesis{Guhling2006,
  author    = {Guhling, Ortwin},
  title     = {Biosynthese kutikul{\"a}rer Triterpenoide : Klonierung und Charakterisierung von Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis und Lycopersicon esculentum},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21796},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekund{\"a}rmetabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikul{\"a}re Wachsbestandteile im prim{\"a}ren Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die Grenzfl{\"a}cheneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekulargenetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend untersucht. Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenph{\"a}notypen in Erscheinung: Der Glossy-Ph{\"a}notyp ist frei von epikutikul{\"a}ren Wachskristallen, wohingegen die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Ph{\"a}notyps von fadenf{\"o}rmigen epikutikul{\"a}ren Wachskristallen bedeckt sind. Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen des Glossy-Ph{\"a}notyps mit etwa 12,5 µg/cm^2 kutikul{\"a}rem Wachs bedeckt sind, die Zusammensetzung des kutikul{\"a}ren Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen Verbindungen dominiert. Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Ph{\"a}notyp weisen mit 51,9 µg/cm^2 dagegen eine weit h{\"o}here Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56\% der Gesamtwachsmenge dominiert wird. Um die Akkumulation von Lupeol im Laufe der fr{\"u}hen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Ph{\"a}notyps zu dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen durchgef{\"u}hrt. Es zeigte sich, dass Lupeol bereits in einer fr{\"u}hen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm^2 und Tag zu; dies entspricht einer t{\"a}glichen Lupeol-Zunahme von 0,013 ng/Zelle zwischen Tag 11 und Tag 18. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation von einer starken Zunahme der fadenf{\"o}rmigen Wachskristalle in der fr{\"u}hen Hypokotylentwicklung begleitet wird. Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten war es von zentraler Bedeutung, die f{\"u}r die Biosynthese des kutikul{\"a}ren Lupeols verantwortliche Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterolsynthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Die auf den Glaucous-Ph{\"a}notyp beschr{\"a}nkte sprossachsenspezifische Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der fr{\"u}hen Entwicklungsphase mit einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Ph{\"a}notyps {\"u}berein. Damit handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die f{\"u}r die Bildung kutikul{\"a}rer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Die Untersuchungen an R. communis zeigen, dass die Biosynthese von kutikul{\"a}ren Triterpenen {\"u}ber die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen bewerkstelligt wird. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 nur relativ geringe Sequenz{\"a}hnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach \&\#946;-Amyrin und best{\"a}tigte damit die Bedeutung des dem Phenylalanin in Amyrinsynthasen korrespondierenden Tryptophans f{\"u}r die katalytische Funktionalit{\"a}t dieser Enzyme. Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon esculentum wurde der erste wichtige Schritt f{\"u}r ein tieferes Verst{\"a}ndnis der Biosynthese kutikul{\"a}rer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als \&\#946;-Amyrinsynthase charakterisiert werden. Im Gegensatz zur Stammkutikula des Glaucous-Ph{\"a}notyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate nicht nur ein, sondern mit \&\#945;-, \&\#946;- und \&\#948;-Amyrin gleich drei Triterpene in gr{\"o}ßeren Mengen eingelagert. Der Nachweis einer tats{\"a}chlichen Relevanz der klonierten OSCs f{\"u}r die Biosynthese dieser kutikul{\"a}ren Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression dieser Gene erbracht werden.},
  subject      = {Rizinus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Tsai2003,
  author    = {Tsai, Chyn-Bey},
  title     = {Molecular cloning and characterization of nitrate reductase from Ricinus communis L. heterologously expressed in Pichia pastoris},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5544},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Zusammenfassung Hintergrund: In einer vorhergehenden Studie wurde gezeigt, dass die Nitratreduktase (NR, EC 1.6.6.1) aus Bl{\"a}ttern von Ricinus communis L. im Vergleich zu NRs der meisten anderen h{\"o}heren Pflanzen durch verschiedene Faktoren unterschiedlich reguliert wird. Die Aktivit{\"a}t ist ungew{\"o}hnlich Mg2+-sensitiv, zeigt ein ver{\"a}ndertes pH-Profil und ist nur gering ATP-abh{\"a}ngig inaktivierbar. Das Ziel dieser Arbeit war, die abweichenden Eigenschaften von Ricinus NR, aus molekularer und physiologischer Sicht detaillierter aufzukl{\"a}ren. Zu diesem Zweck wurde das NR Gen von R. communis geklont, heterolog exprimiert und charakterisiert. Ergebnisse: Die abgeleitete Proteinsequenz zeigte, dass Ricinus NR hohe {\"A}hnlichkeit mit anderem NRs teilte, abgesehen von der N-terminalen Region. In der N-terminalen Region besitzt die Ricinus NR eine s{\"a}urehaltige Sequenz, die nur in den h{\"o}heren Pflanzen konserviert ist. In der Moco-bindenden Region waren einige in 17 Pflanzen NRs konservierte Aminos{\"a}urepositionen ver{\"a}ndert. Zu diesen Positionen geh{\"o}rten His103, Gln123, Val266 und Ala284, die Asparagin, Arginin, Aspartat und Prolin in den anderen Pflanzen ersetzten. Auch an der Dimerisierungs- und Hinge 1-Region, zeigte die Ricinus NR eine ver{\"a}nderte Aminos{\"a}uresequenz. Anstatt Isoleucin und Glycin, besaß die Ricinus NR an den Stellen 460 und 498 Asparagin und Alanin. Durch ein Arg an der Stelle 482 kommt es zu einer zus{\"a}tzliche Trypsinschnittstelle innerhalb des 481KRHK484-Motivs (die meisten NR besitzen hier KPHK). Zus{\"a}tzlich enth{\"a}lt die Ricinus NR eine Serinphosphorylierungsstelle (Ser-526) innerhalb des m{\"o}glichen 14-3-3 Bindemotivs 523KSVS*TP528, was eine allgemeine Eigenschaft von Nitratreduktasen ist. Im C-Terminus von Ricinus NR best{\"a}tigte die Sequenz 886CGPPP890, dass die Ricinus NR ein NADH-spezifisches Enzym ist. Die Ricinus NR und Arabidopsis NR2 (AtNR2) wurden in Pichia pastoris funktionell exprimiert und die Eigenschaften miteinander verglichen. Die rekombinante Ricinus NR (RcNR) selbst wurde nicht durch die Inkubation mit MgATP inhibiert, ebenso AtNR2. Da der Hefeextrakt vermutlich die Faktoren zur Regulierung der NR nicht enth{\"a}lt, wurden entsalzte Blattextrakte von Arabidopsis (ADL), Spinat (SDL) und Ricinus (RDL) zugesetzt, die Kinasen und 14-3-3 Proteine enthielten. Damit keine endogenen NRs sich im Extrakt befinden wurden die Bl{\"a}tter vor Extraktion 4 Tage im Dunkeln gehalten. In Bezug auf die Inhibierung der NR durch ATP wurde festgestellt, dass die RcNR gegen{\"u}ber einer solchen Inhibierung unempfindlich ist, AtNR2 dagegen in jedem Fall durch ATP inaktiviert wird. Bei Kombination von RcNR mit NR-freien Extrakten aus Pflanzen zeigte sich die erh{\"o}hte Mg2+-Sensitivit{\"a}t nur, wenn man RcNR mit RDL inkubierte, nicht aber wenn man RcNR mit SDL oder ADL inkubierte. Es liegt auf der Hand, dass ein oder einige Faktoren in RDL vorkommen, die mit RcNR interagieren und seine hohe Mg2+-Sensitivit{\"a}t hervorrufen. Außerdem, ergab eine Inkubation von AtNR2 mit unterschiedlichen NR-freien Blattextrakten eine bedeutende Aktivierung der Enzymaktivit{\"a}ten, sowohl in Anwesenheit von Mg2+ als auch EDTA. Dies wurde jedoch nicht f{\"u}r die RcNR festgestellt. Nach Verwendung von Ammoniumsulfat zur Fraktionierung des RDL, fand man zus{\"a}tzlich heraus, dass ungef{\"a}hr 0,2 mg des Proteins der Fraktion die mit 0-35\% Ammoniumsulfat gef{\"a}llt wurde ausreichten die maximale Hemmung des RcNR hervorzurufen. Schlussfolgerungen: Die Unempfindlichkeit gegen{\"u}ber ATP erscheint eine angeborene Eigenschaft von Ricinus NR, w{\"a}hrend die hohe Mg2+-Sensitivit{\"a}t von einem oder einigen Faktoren in den Bl{\"a}ttern von Ricinus abh{\"a}ngt. Diese(r) bis jetzt unbekannte Faktor(en) war Hitze-sensitiv und konnte durch Ammoniumsulfat ausgef{\"a}llt werden. Er scheint spezifisch auf die rekombinante Ricinus-NR einzuwirken, und liefert eine Mg2+-Sensitivit{\"a}t vergleichbar dem authentischen Blattenzym. Außerdem gibt es vermutlich auch positiv regulierende Faktor(en) f{\"u}r die Nitratreduktase aus Bl{\"a}ttern h{\"o}herer Pflanzen.},
  subject      = {Rizinus},
  language  = {en}
}