@phdthesis{Hartkamp2001, author = {Hartkamp, J{\"o}rg}, title = {Regulation von MAPK Signalwegen durch die Sein/Threonin Kinase MLK3}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-312}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {MAPK Kaskaden spielen eine Schl{\"u}sselrolle bei der {\"U}bertragung und der Umwandlung von extrazellul{\"a}ren Reizen in intrazellul{\"a}re Signale und regulieren dadurch unterschiedliche Prozesse wie Differenzierung, Zellproliferation oder Stress Antworten. 'Mixed Lineage Kinasen' (MLKs) bilden eine Familie von Serin/Threonin Proteinkinasen mit mehreren Protein/Protein Interaktionsdom{\"a}nen (SH3, Cdc42 Rac interactive binding sequence/CRIB, Leuzin Zipper), die am engsten mit der Familie der MAPKK Kinasen verwandt ist. In der voliegenden Arbeit zeigen wir, dass MLK3 Cdc42/Rac induzierte JNK/SAPK Aktivit{\"a}t vermittelt, welches zu einer anschließenden Phosphorylierung und verst{\"a}rkter transkriptioneller Aktivit{\"a}t des zur AP-1 Familie geh{\"o}renden immediate early Gens c-Jun f{\"u}hrt. Zus{\"a}tzlich phosphoryliert MLK3 die dualspezifischen Kinasen MEK1/2 direkt in vitro und in vivo an den f{\"u}r die Aktivierung wichtigen Serinen 217/221. Wohingegen dies nur zu einer ERK Aktivierung in {\"U}berexpressionssystemen f{\"u}hrte, demonstrieren die Analysen {\"u}berzeugend, dass endogenes MEK1/2, welches von MLK3 phosphoryliert worden ist, nicht in der Lage ist, diese Aktivit{\"a}t auf das physiologische Substrat ERK1/2 in vitro wie auch in vivo zu {\"u}bertragen. Wir postulieren daher, dass MLK3 vermittelte MEK1/2 Phosphorylierung die dualspezifischen Kinasen von ERK1/2 Aktivierung entkoppelt. Zus{\"a}tzlich zeigen wir, dass {\"U}berexpression von Wild Typ MLK3 zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten und Wachstum in Soft Agar f{\"u}hrt. In {\"U}bereinstimmung mit den anderen Analysen ist MEK1/2 stark phosphoryliert jedoch von ERK1/2 Aktivierung in MLK3 transformierten Zellen entkoppelt. Weiterhin kooperiert MLK3 mit aktivierter MEK1 in Foci Bildung, was zeigt, dass MLK3 andere Signalwege als ERK1/2 in der Zelltransformation benutzt. Vielmehr ist in MLK3 transformierten Fibroblasten Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Aktivierung und Expression des immediate early Gens junB partiell blockiert. Unsere Analysen zeigen zum ersten Mal f{\"u}r eine MAPKK Kinase, dass sie MAPK Signalwege unterschiedlich reguliert. W{\"a}hrend MLK3 auf der einen Seite JNK/SAPK aktiviert, entkoppelt es MEK1/2 induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 Aktivierung und blockiert sogar Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Ativierung partiell.}, subject = {MAP-Kinase}, language = {de} } @phdthesis{Otto2001, author = {Otto, Ines Maria}, title = {Klonierung und funktionelle Analyse des Aktinreorganisators p150-Spir}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1178402}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK), ein Mitglied der Familie der MAP-Kinasen (Mi-togen Activated Protein Kinases), wirkt als signal{\"u}bertragender Effektor, der den klei-nen GTPasen der Rho-Familie Rac und Cdc42 nachgeschaltet ist. Rho-GTPasen spielen eine Schl{\"u}sselrolle in der Regulation von zellul{\"a}ren Aktinstrukturen und steuern Prozesse in der Zelle, die {\"A}nderungen der Aktinstruktur erfordern, wie z.B. {\"A}nderungen der Zellmorphologie, Zellmigration, Wachstum und Differenzierung. Genetische Studien an der Fruchtfliege Drosophila melanogaster konnten eine Rolle des Drosophila-JNK-Homologs DJNK(basket) in der Regulation von Zellbewegungen und Zellmorphologie{\"a}nderungen w{\"a}hrend der Drosophila-Embryogenese zeigen. Inhibierung der Funktion von DJNK auf allen Stufen der DJNK-Signaltransduktions-kaskade f{\"u}hrt zum sogenannten dorsal closure-Ph{\"a}notyp der Embryonen mit fehlender Zellstreckung und fehlender Migration dorsaler Epithelzellen. Der molekulare Mechanismus, mit dessen Hilfe Rho-GTPasen Aktinstrukturen regu-lieren und wie JNK Einfluss auf Zellmorphologie und Zellbewegung nimmt, ist bisher nicht bekannt. Die Identifizierung neuer, mit JNK interagierender Proteine k{\"o}nnte zum besseren Verst{\"a}ndnis der Funktion und Regulation von JNK f{\"u}hren. In dieser Arbeit wurde ein Yeast-Two-Hybrid-Screen mit dem Drosophila-Homolog DJNK/basket durchgef{\"u}hrt, der zur Entdeckung des Drosophila-Proteins p150-Spir als Interaktionspartner von DJNK f{\"u}hrte. Der C-terminus des p150-Spir-Proteins enth{\"a}lt eine JNK-Interaktionsdom{\"a}ne, ein DEJL-Motiv (Docking Site for Erk and JNK, LxL) und wird von aktivierten JNK-Proteinkinasen phosphoryliert. p150-Spir ist ein Multi-Dom{\"a}nen-Protein, das in seiner aminoterminalen H{\"a}lfte eine Aufeinanderfolge von vier WH2-Dom{\"a}nen (Wiskott Aldrich Homology Domain 2) enth{\"a}lt. WH2-Dom{\"a}nen binden monomeres Aktin, Proteine mit WH2 Dom{\"a}nen, wie z.B. WASP oder WAVE sind Aktinreorganisatoren. Die transiente {\"U}berexpression von p150-Spir in NIH3T3-Mausfibroblasten f{\"u}hrt ebenfalls zu einer Aktinreorganisation. Eine weitere Dom{\"a}ne in p150-Spir ist eine modifizierte FYVE-Zinkfinger-Struktur (mFYVE) im zentralen Bereich des Proteins, die f{\"u}r die subzellul{\"a}re Lokalisation von p150-Spir von Bedeutung ist. Mutationen, welche die Zinkfingerstruktur zerst{\"o}ren, f{\"u}hren bei {\"U}berexpression in NIH3T3-Zellen zu einer zytoplasmatischen Lokalisation der mutierten p150-Spir-Proteine, w{\"a}hrend Wildtyp-p150-Spir perinukle{\"a}r akkumuliert. Spir-Proteine sind evolution{\"a}r hoch konserviert. Es konnten Spir-{\"a}hnliche Sequenzen auf den humanen Chromosomen 16 und 18, in der Maus und in der Seescheide Ciona savignyi gefunden werden. Der h{\"o}chste Grad an Konservierung besteht im Bereich der funktionellen Proteindom{\"a}nen. Ein in allen Spir-Proteinen ent-haltenes, als Spir-Box bezeichnetes hoch konserviertes Sequenzmotiv befindet sich unmittelbar vor dem mFYVE-Zinkfinger. Die Spir-Box zeigt Strukturverwandschaft zur Rab-GTPase-Bindungsregion in Rabphilin 3A, einem Protein, das ebenfalls eine FYVE-Dom{\"a}ne besitzt. Rab-GTPasen sind wie FYVE-Dom{\"a}nenproteine in die Regulation zellul{\"a}rer Vesikeltransportprozesse involviert. Das Vorhandensein beider Do-m{\"a}nen in p150-Spir deutet auf eine Rolle des Proteins in zellul{\"a}ren Transportprozes-sen hin. Ein denkbares Modell w{\"a}re, daß p150-Spir unter der Kontrolle von JNK-Signalen zellul{\"a}re Aktinstrukturen reguliert, die f{\"u}r Transportprozessse in der Zelle von Bedeutung sind; p150-Spir fungiert damit m{\"o}glicherweise als direktes Bindeglied zwischen MAPK-Signaltransduktionskaskaden und dem Aktinzytoskelett.}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @phdthesis{Schmidt2001, author = {Schmidt, Marc}, title = {Die Rolle mitogener und stressinduzierter MAPK-Signalwege in der Regulation von keratinozyt{\"a}ren Wachstums- und Differenzierungsvorg{\"a}ngen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2013}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellul{\"a}ren Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozyt{\"a}ren Wachstums- und Differenzierungsvorg{\"a}ngen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erh{\"o}hung der extrazellul{\"a}ren Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, w{\"a}hrend keine ver{\"a}nderte Aktivit{\"a}t der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Ver{\"a}nderungen der intrazellul{\"a}ren Calciumkonzentration moduliert werden. W{\"a}hrend die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabh{\"a}ngig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv f{\"u}r MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in fr{\"u}hen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abh{\"a}ngigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabh{\"a}ngig exprimiert und translozieren sowohl nach Erh{\"o}hung der intrazellul{\"a}ren Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch ver{\"a}nderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschr{\"a}nkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumor{\"o}ser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verst{\"a}ndnis der regulatorischen Mechanismen leisten k{\"o}nnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Hom{\"o}ostase erh{\"a}lt.}, subject = {Keratinozyt}, language = {de} }