@phdthesis{Bieber2013,
  author    = {Bieber, Michael},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung zweier Lipid Transfer Proteine in der Arabidopsis thaliana Pathogenantwort},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-97682},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Die Multigenfamilie der Lipid Transfer Proteine (LTP) stellt eine Gruppe von kleinen Proteinen dar, welche in allen h{\"o}heren Landpflanzen vorkommen. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana werden 92 Proteine zur Klasse der LTPs gez{\"a}hlt. Die Benennung der Proteinfamilie basiert auf dem beobachteten in vitro Transfer von Lipiden zwischen zwei Membranen. Alle LTPs weisen ein konserviertes, 8 Cysteine beinhaltendes Motiv und eine hydrophobe Tasche auf, welche f{\"u}r die Bindung hydrophober Molek{\"u}le verantwortlich ist. Aufgrund ihrer Signalsequenz werden LTPs {\"u}ber den sekretorischen Weg in den extrazellul{\"a}ren Raum geschleust. F{\"u}r einige pflanzliche LTPs konnte eine derartige Sekretion bereits nachgewiesen werden. F{\"u}r andere LTPs wird eine Funktion in der Kutinbildung, der Embryogenese oder der pflanzlichen Immunantwort gegen Phytopathogene postuliert. Letzteres wurde f{\"u}r DIR1 (DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1) und AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1) nachgewiesen, w{\"a}hrend von LTPIV.4 (At4g55450) nur bekannt ist, dass die Expression spezifisch in Antwort auf Pathogene induziert ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Funktion von LTPIV.4 und AZI1 in Bezug auf die pflanzliche Pathogenantwort in Arabidopsis thaliana untersucht. Anhand von GFP-Fusionsproteinen konnte f{\"u}r LTPIV.4 und AZI1 eine Endoplasmatische Retikulum-Lokalisierung detektiert werden. Auch eine gewebespezifische Promotoraktivit{\"a}t von LTPIV.4 an den Leitgeweben und in jungen sich entwickelnden Bl{\"a}ttern konnte identifiziert werden. Diese Erkenntnisse lassen darauf schließen, dass LTPIV.4 m{\"o}glicherweise an der Signaltransduktion am/im Leitgewebe mitverantwortlich ist. Im Fokus dieser Arbeit stand die spezifische Einordnung von LTPIV.4 in der Ausbildung der lokalen bzw. systemischen Immunantwort von Arabidopsis thaliana. Anhand einer Infektion von Wildtyppflanzen und LTPIV.4 Mutanten mit zwei verschiedenen Pseudomonasst{\"a}mmen konnte eine LTPIV.4-abh{\"a}ngige Steigerung der pflanzlichen Resistenz gegen die biotrophen Bakterien nachgewiesen werden. In der Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia hingegen zeigte sich keine LTPIV.4 Abh{\"a}ngigkeit. Da die Hormone Salicyls{\"a}ure (SA) und Jasmons{\"a}ure (JA) in der Ausbildung der pflanzlichen Abwehr gegen verschiedene Pathogene wichtig sind, wurden die Hormonlevel von SA und JA in ltpIV.4, 35S::LTPIV.4 sowie in Wildtyppflanzen analysiert. Die untersuchten Phytohormongehalte zeigten eine LTPIV.4 unabh{\"a}ngige, schnelle Akkumulation von SA nach der Infektion mit virulenten (vir) Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm) und eine sp{\"a}tere Erh{\"o}hung der JA-Gehalte. Es konnte somit kein regulatorischer Effekt von LTPIV.4 auf die SA- sowie die JA-Gehalte detektiert werden. Die Expression von SAG13 (SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 13) und OXI1 (OXIDATIVE SIGNAL-INDUCIBLE 1), welche eine Funktion im programmierten Zelltod (PCD) haben beziehungsweise durch oxidativen Stress induziert werden, war hingegen erh{\"o}ht in konstitutiv LTPIV.4 exprimierenden Pflanzen, verglichen mit dem Wildtyp von LTPIV.4. Als ein weiterer Ansatzpunkt f{\"u}r die funktionelle Charakterisierung von LTPIV.4 wurde die in vitro Identifizierung m{\"o}glicher Substrate mittels Lipid-Protein-Interaktionsanalysen, sowie einer unspezifischen Metabolomanalyse herangezogen. Bei den Interaktionsanalysen konnten Phosphatids{\"a}uren (PA), Phosphatidylglycerine (PG), Monogalactosyldiacylglycerole (MGDG) und auch Digalactosyldiacylglycerole (DGDG) als Interaktionspartner von LTPIV.4 identifiziert werden. Die Metabolomanalyse zeigte einen quantitativen Unterschied zwischen Wildtyp/35S::LTPIV.4 und ltpIV.4 bei einigen MGDG, DGDG und PG Spezies. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten l{\"a}sst sich somit schließen, dass LTPIV.4 nach Pathogen/Schaden-assoziierte molekulare Muster- (PAMP/ DAMP-) Erkennung, z.B. von Psm, SA-abh{\"a}ngig vermehrt gebildet wird. Da die konstitutive Expression von LTPIV.4 sowohl zu erh{\"o}hter OXI1 und SAG13 Expression als auch zu erh{\"o}hter Resistenz gegen{\"u}ber Psm f{\"u}hrt, l{\"a}sst sich ein Modell aufstellen, in dem LTPIV.4 als positiver Regulator des PCD die Pathogenresistenz von Arabidopsis erh{\"o}ht. Der zugrunde liegende Mechanismus ist unbekannt. Die Bindung von PAs, PGs, MGDGs und DGDGs an LTPIV.4 in vitro k{\"o}nnte darauf hindeuten, dass auch in vivo hydrophobe Molek{\"u}le gebunden und m{\"o}glicherweise transportiert werden und dies ein Teil der Pathogenantwort ist. Es w{\"a}re z.B. denkbar, dass eine m{\"o}gliche Translokation von LTPIV.4 {\"u}ber das ER in das Zytoplasma oder den apoplastischen Raum erfolgt. Dort interagiert LTPIV.4 mit durch ROS gebildeten, oxidierten Lipiden oder DAMPs und l{\"o}st entweder symplastisch durch eine Interaktion in der Infizierten Zelle oder in intakten Nachbarzellen durch eine weitere Signaltransduktionskaskade den PCD sowie eine erh{\"o}hte ROS Bildung aus, oder das LTP interagiert spezifisch mit oxidierten Lipiden oder DAMPs von abgestorbenen Nachbarzellen, und l{\"o}st eine intrazellul{\"a}re Signalkaskade mit Initiierung des PCD sowie erh{\"o}hter ROS-Bildung aus. AZI1 wurde als zweites LTP in dieser Arbeit einbezogen. Ausgehend von der Beobachtung, dass die konstitutive Expression von AZI1 die Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogene Botrytis cinerea erh{\"o}ht, sollte in der vorliegenden Arbeit detailiert untersucht werden, ob AZI1 eine Rolle in der Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogen Sclerotinia sclerotiorum spielt. Die azi1-1 Mutante zeigte hierbei jedoch eine erh{\"o}hte Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia sclerotiorum. Da bisher keine Unterschiede in der Genexpression von spezifischen Markergenen in WT und azi1-1 Pflanzen nach Sklerotiniainfektion festgestellt werden konnte und es auch f{\"u}r LTPs bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Kutikulasynthese spielen, w{\"a}re eine Hypothese, dass die unterschiedlichen Infektionsph{\"a}notypen mit Sclerotinia und Botrytis auf eine strukturelle Ver{\"a}nderung der Kutikulabeschaffenheit zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Weiterhin konnte f{\"u}r AZI1 eine m{\"o}gliche Rolle in der Verwundungsantwort detektiert werden, da sowohl die AZI1 Genexpression, als auch die erhaltenen basal signifikant erh{\"o}hten 12-oxo-Phytodiens{\"a}ure (OPDA)-Gehalte auf eine negativ regulatorische Rolle von AZI1 in der Verwundungs-abh{\"a}ngigen JA-Signaltransduktion hindeuten.},
  subject      = {Lipid-Carrier-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bonfig2008,
  author    = {Bonfig, Katharina Barbara},
  title     = {Untersuchungen zur Rolle des Kohlenhydratmetabolismus w{\"a}hrend Pflanze-Pathogen-Interaktionen und der Keimlingsentwicklung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-32488},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Invertasen sind Schl{\"u}sselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben m{\"o}glicherweise auch w{\"a}hrend einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zun{\"a}chst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten r{\"a}umliche und zeitliche Ver{\"a}nderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ {\"a}hnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet f{\"u}r die sensitive, nicht-invasive Pathogenfr{\"u}herkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-{\"U}berg{\"a}ngen und die Aktivit{\"a}t von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivit{\"a}t vakuol{\"a}rer Invertasen stieg vor{\"u}bergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, w{\"a}hrend sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivit{\"a}t extrazellul{\"a}rer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienst{\"a}mme von P. syringae, die das gr{\"u}n fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zun{\"a}chst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In {\"U}bereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Bl{\"a}ttern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollst{\"a}ndig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivit{\"a}t durch Messung der Invertaseaktivit{\"a}t in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollst{\"a}ndig reprimiert war. In funktionellen Ans{\"a}tzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression {\"a}nderte die Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivit{\"a}t in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Bl{\"a}ttern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erh{\"o}hte Sensitivit{\"a}t der Pflanzen gegen{\"u}ber der Infektion, eine st{\"a}rkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erh{\"o}htes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivit{\"a}t nach zus{\"a}tzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivit{\"a}t nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erh{\"o}hte die Spiegel an Salicyls{\"a}ure unabh{\"a}ngig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicyls{\"a}ure-vermittelten Abwehrweges bei zus{\"a}tzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erh{\"o}ht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr f{\"u}r die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivit{\"a}t der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivit{\"a}t dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekr{\"a}ftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte f{\"u}r A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplement{\"a}ren Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivit{\"a}t f{\"u}r eine normale Keimlingsentwicklung.},
  subject      = {Invertase},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Glenz2019,
  author    = {Glenz, Ren{\´e}},
  title     = {Die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion},
  doi       = {10.25972/OPUS-18790},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-187903},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Sphingobasen bilden das Grundger{\"u}st und die Ausgangsbausteine f{\"u}r die Biosynthese von Sphingolipiden. W{\"a}hrend komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmolek{\"u}le bei zellul{\"a}ren Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenst{\"u}cken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgekl{\"a}rt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege f{\"u}r einen antagonistischen Effekt und m{\"o}gliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. F{\"u}r eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, f{\"u}hren zum Teil zu spontanem PCD und ver{\"a}nderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-ausl{\"o}senden Bedingungen erh{\"o}ht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache f{\"u}r den dadurch ausgel{\"o}sten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, f{\"u}hrt zu Zelltod. In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der {\"U}berpr{\"u}fung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitf{\"a}higkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen best{\"a}tigt wurde. Dar{\"u}ber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. F{\"u}r LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgel{\"o}st wurde. F{\"u}r LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert. In weiteren Ans{\"a}tzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich ver{\"a}nderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Ph{\"a}notyp der Mutanten gegen{\"u}ber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivit{\"a}t der verschiedenen Linien gegen{\"u}ber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, w{\"a}hrend hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erh{\"o}hten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber FB1 festgestellt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgef{\"u}hrten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege f{\"u}r die Zelltod-f{\"o}rdernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verst{\"a}ndnis der Sphingobasen-Hom{\"o}ostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei.},
  subject      = {Sphingolipide},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Grun2006,
  author    = {Grun, Christoph},
  title     = {Untersuchung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine in Arabidopsis thaliana in der kompatiblen und der inkompatiblen Interaktion mit Pseudomonas syringae},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20804},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {1. OH-FS wurden in vitro hergestellt, um als Standardsubstanzen zur gaschromato-graphischen Identifizierung von OH-FS in Pflanzenmaterial eingesetzt zu werden. 2. F{\"u}r die Untersuchung der Oxylipin-Gehalte in A. thaliana wurden der virulente Pst-Stamm DC3000 sowie der avirulente Stamm avrRPM1 verwendet, um die kompatible Interaktion mit der inkompatiblen Interaktion vergleichen zu k{\"o}nnen. Die Konzentrationen der Oxylipine sowie SA wurden innerhalb einer Versuchsdauer von 60 h verfolgt. Dabei wurden PPF1 sowie 12- und 16-OH-FS, als Vertreter der nicht-enzymatisch entstandenen Oxylipine, 9- und 13-OH-FS, sowohl als enzymatisch als auch nicht-enzymatisch entstandene Oxylipine, sowie JA und deren Vorstufe OPDA als enzymatisch gebildete Phytohormone untersucht. Es wurden monophasische Konzentrationsanstiege, bei allen untersuchten Substanzen, in der kompatiblen Interaktion ermittelt, wohingegen die Konzentrationsanstiege in der inkompatiblen Interaktion biphasisch waren. In beiden Interaktionen wurden nach 48 bis 60 h Konzentrationsmaxima der freien sowie der veresterten OH-FS und PPF1 nachgewiesen, ein fr{\"u}her Konzentrationsanstieg nach 5 bis 10 h konnte ausschließlich in der inkompatiblen Interaktion ermittelt werden. Die gleichzeitige Akkumulation von 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS und PPF1 deutet auf eine parallel ablaufende Oxylipin-Synthese durch enzymatische, Photo-oxidative und {\"u}ber freie Radikale vermittelte Prozesse hin. Die Akkumulation veresterter OH-FS und PPF1 erfolgte in beiden Interaktionen 5 bis 12 h fr{\"u}her als die Konzentrationsanstiege der freien OH-FS und PPF1. Die Ergebnisse best{\"a}tigen die Hypothese, dass nicht-enzymatische Oxylipine in Membranen gebildet werden k{\"o}nnen und anschließend vermutlich durch eine Lipase frei gesetzt werden. In der inkompatiblen Interaktion konnte ein erstes fr{\"u}hes Konzentrationsmaximum von JA und OPDA nach 5 h beobachtet werden, w{\"a}hrend sp{\"a}te Maxima in beiden Interaktionen nach 24 bis 36 h erfolgten. Somit akkumulierten die OH-FS und PPF1 in der inkompatiblen Interaktion zeitgleich mit den Jasmonaten nach 5 h. 3. Bei einer K{\"a}lteexposition von A. thaliana bei 4°C {\"u}ber 2 h wurde jeweils ein 3,3-facher Konzentrationsanstieg der freien und der veresterten enzymatisch gebildeten 13-OH-FS nachgewiesen. Dar{\"u}berhinaus wurde ein 4,6-facher Anstieg der enzymatisch entstandenen 9-OH-FS ermittelt. Die nicht-enzymatisch gebildeten 12- und 16-OH-FS zeigten dagegen keine signifikanten Konzentrationsanstiege {\"u}ber die basalen Konzentrationen hinaus. Die angewendeten Stressbedingungen bewirken demnach ausschließlich eine enzymatische Bildung von OH-FS in A. thaliana. 4. Zur Untersuchung der OH-FS-Synthese in der inkompatiblen Interaktion in Abh{\"a}ngigkeit von der bei der Pflanzenanzucht eingesetzten Lichtst{\"a}rke wurden A. thaliana bei Licht und in Dunkelheit mit Pst avrRPM1 infiziert. Nach 10 h wurde eine 1,1- bis 3,7-fach st{\"a}rkere Bildung der freien sowie eine 2,0- bis 3,4-fach st{\"a}rkere Akkumulation der veresterten 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS bei den Pflanzen ermittelt, die bei Licht angezogen wurden. Die Lichtintensit{\"a}t, der Pflanzen w{\"a}hrend der Infektion mit Pst ausgesetzt sind, hat demnach große Bedeutung f{\"u}r die Entstehung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter OH-FS. Ein 4,9-facher Anstieg veresterter 15-OH-FS, ein Marker f{\"u}r eine photooxidative OH-FS-Entstehung, auch bei Dunkelheit widersprach der Hypothese, dass 15-OH-FS ohne Lichteinwirkung nicht gebildet werden k{\"o}nnen und deutet auf eine bisher unbekannte Licht-unabh{\"a}ngige Entstehung von 1O2 bzw. von 15-OH-FS hin. 5. Die Bestimmung von OH-FS in Bl{\"a}ttern und Wurzeln von unbehandelten A. thaliana-Pflanzen ergab eine 13- bis 31-fach h{\"o}here Konzentration veresterter 9-, 10-, 12-, 13- und 16-OH-FS in den Bl{\"a}ttern. Dar{\"u}berhinaus wurde eine 111-fach h{\"o}here Konzentration von veresterten 15-OH-FS in Bl{\"a}ttern im Vergleich zu Wurzeln nachgewiesen. 15-OH-FS wurden als selektiver Marker f{\"u}r eine Photo-oxidative OH-FS-Bildung durch 1O2 verwendet. Mit 0,57 µg/g TG kommt 15-OH-FS allerdings auch im Wurzelgewebe vor, was einen Hinweis darauf darstellt, dass neben einem Licht-abh{\"a}ngigen Hauptweg auch ein Licht-unabh{\"a}ngiger Entstehungsmechanismus von 15-OH-FS bzw. 1O2 existiert. Alternativ w{\"a}re es denkbar, dass ein Transport von 15-OH-FS von den Bl{\"a}ttern in die Wurzeln stattfindet. 6. Eine Untersuchung der Gehalte an OH-FS und PPF1 in NahG-, lsd1-, atrbohD- und atrbohF-Mutanten ergab 48 h nach Infiltration von Pst avrRPM1 keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den Pflanzen des jeweiligen Wildtyps Col-0 und WS. Unter den gew{\"a}hlten Versuchsbedingungen bewirken die genetischen Defekte der untersuchten Mutanten keine ver{\"a}nderte Akkumulation enzymatisch sowie nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine.},
  subject      = {Lipid-Peroxide},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Jeworutzki2009,
  author    = {Jeworutzki, Elena},
  title     = {Elektrophysiologische Untersuchungen zur fr{\"u}hen Erkennungsphase zwischen Pflanzen und Mikroorganismen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47489},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {An der pflanzlichen Plasmamembran geschieht die erste Wahrnehmung von mikrobiellen Molek{\"u}len, die MAMPs genannt werden. MAMP/PAMP Rezeptoren leiten fr{\"u}he Abwehrantworten, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), externe Alkalisierung oder Ethylen, ein. Die Arabidopsis FLS2 rezeptorartige Kinase (RLK) stellt einen plasmamembran-lokalisierten MAMP Rezeptor dar, der {\"u}ber die Detektion des Flagellum von Pseudomonas species, eine basale Immunit{\"a}t in Arabidopsis thaliana vermittelt. Flg22, der k{\"u}rzeste aktive Teil des bakteriellen Flagellins besteht aus 22 Aminos{\"a}uren und ist der bestuntersuchte bakterielle Elizitor. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir eine starke Beteiligung von Ionenfl{\"u}ssen in der Initiationsphase der basalen Immunit{\"a}t. Unsere Messungen an intakten Arabidopsis Pflanzen und Pflanzengeweben sind in h{\"o}chstem Masse reproduzierbar und {\"o}ffnen eine neue Sicht, {\"u}ber die Natur von Ionentransporten in der Pflanzen - Mikroben Interaktion. Als Antwort auf die Applikation von flg22, haben wir nach einer Verz{\"o}gerungsphase von etwa 2 Minuten eine transiente, dosis-abh{\"a}ngige Depolarisation (EC50=0,2 nM) in Mesophyll- und Wurzelhaarzellen von A. thaliana messen k{\"o}nnen. Das um 2 Amins{\"a}uren k{\"u}rzere Peptid flg22 \&\#916;2 oder das Flagellin anderer Bakterien (Agrobacterium or Azospirillum) f{\"u}hrten zu keiner Membrandepolarisation. Ebenso konnten keine Membranspannungs{\"a}nderungen in dem Arabidopsis {\"O}kotypen Ws-0, dem der funktionelle FLS2 Rezeptor fehlt, detektiert werden. Die Komplementation von Ws-0 Pflanzen mit dem intakten FLS2 Rezeptorgen rief eine Resensibilisierung f{\"u}r flg22 hervor. Mit dem EF-Tu Elizitor Peptid aus E.coli, welches durch den Arabidopsis MAMP Rezeptor EFR detektiert wird, wurden {\"a}hnliche Ergebnisse erzielt. Auf der Basis von Aequorin wurden Kalzium-induzierte Lumineszenzmessungen durchgef{\"u}hrt, in denen ein transienter Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration als Antwort auf die Applikation von flg22 gemessen werden konnte. Dosis-Abh{\"a}ngigkeitsmessungen von flg22 und [Ca2+]cyt wiesen zwei unterschiedliche EC50 Werte, von 43 ± 2 pM und 67 ± 42 nM, auf. M{\"o}glicherweise wird auf zwei verschiedene Kalziumpools zugegriffen oder es werden zwei verschiedene Kalziumleitf{\"a}higkeiten aktiviert. Die Ionenkanalaktivierung und folgende Depolarisation ben{\"o}tigt die aktive Rezeptorkinase. In bak1-4 Arabidopsis Pflanzen, in denen die FLS2 Untereinheit BAK1 - eine weitverbreitete RLK, die auch mit dem Brassinosteroid Rezeptor assoziiert ist - fehlt, konnte keine Depolarisation als Antwort auf flg22 gemessen werden. Arabidopsis Mesophyllzellen zeigten die typische Alkalisierung des Apoplasten als Antwort auf flg22. Nicht-invasive MIFETM Experimente mit Ionen-selektiven Elektroden ergaben, dass der pH-Anstieg durch einen Einstrom von Protonen hervorgerufen wurde. Zus{\"a}tzlich wurde ein Ausstrom von Chlorid und Kalium aufgezeichnet. {\"A}hnlich wie das Kalziumsignal waren alle detektierten Ionenstr{\"o}me von transienter Natur. Im zweiten Ansatz wurden Membranpotential-Messungen durchgef{\"u}hrt, w{\"a}hrend in der externen L{\"o}sung die Konzentrationen von Protonen, Kalzium, Kalium oder Anionen variiert wurden. Nur eine {\"A}nderung des Anionengradienten hatte einen entscheidenden Einfluss auf die flg22-induzierte Depolarisation, was die Wichtigkeit der Anionenkanalaktivierung unterstreicht. Exudat Analysen ergaben, dass Nitrat das bevorzugt transportierte Ion ist. Unter zahlreichen getesteten Ionenkanalblockern erwies sich lediglich Lanthan als effektiver Blocker des flg22-induzierten zytosolichen Kalziumanstiegs, des Protoneneinstroms und der Membrandepolarisation. Da Lanthan bekanntlich unspezifische Kationenkan{\"a}le blockt, kann man an diesem Punkt davon ausgehen, dass Kalzium-aktivierte Anionenkan{\"a}le die Membrandepolarisation vermitteln und darauf eine Aktivierung von ausw{\"a}rtsgerichteten Kaliumkan{\"a}len folgt. Zuk{\"u}nftige Studien mit Doppell{\"a}ufigen-Mikroelektroden Spannungsklemmexperimenten oder externen ionenselektiven Elektroden an intakten Schliesszellen werden helfen weitere Informationen {\"u}ber die Natur der Ionenkan{\"a}le in der basalen Immunit{\"a}t oder generell in der Pflanzen-Mikroben Interaktion zu erhalten. {\"U}ber die elektrophysiologische Charakterisierung der multiplen Ionenstr{\"o}me in der basalen Immunit{\"a}t hinaus, ist nat{\"u}rlich der n{\"a}chste wichtige Schritt das oder die Gene zu finden, die f{\"u}r die Ionenkan{\"a}le oder Transporter kodieren, die durch nicht nekrotisierende Elizitoren wie flg22 in der basalen Immunantwort in Pflanzen aktiviert werden.},
  subject      = {Calcium},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Peer2010,
  author    = {Peer, Markus},
  title     = {Sphingolipide - Analytik, Biosynthese und Funktion in der Arabidopsis thaliana Pathogenantwort},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55034},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Sphingolipide (SPL) sind wichtige und ubiquitar verbreitete Bestandteile von Biomembranen. Aufgrund der enormen Vielfalt, der komplexen Struktur und diverser physiko-chemischer Eigenschaften der Sphingolipide gestaltet sich die qualitative und quantitative Untersuchung der Sphingolipide allerdings schwierig. In dieser Arbeit konnten, basierend auf publizierten Methoden, analytische Verfahren entwickelt werden, mit deren Hilfe sich die Gehalte spezifischer Sphingolipide in A. thaliana quantitativ nachweisen lassen. Unter Einsatz eines targeted metabolite profiling-Ansatzes wurde die Rolle spezifischer Sphingolipide in der Pflanzen-Pathogen Interaktion charakterisiert. Infiltration von avirulenten P. syringae pv. tomato (Pst) in Bl{\"a}tter von A. thaliana f{\"u}hrte zu schnell und transient erh{\"o}hten Gehalten der freien Sphingobase Phytosphingosin (t18:0). Im Gegensatz zu avirulenten Pst kam es nach Infiltration von virulenten Pst zu einer schnellen R{\"u}ckkehr auf Basalniveau und nicht zu einer hypersensitiven Antwort (HR), was auf eine positiv regulatorische Rolle von t18:0 in Abwehrreaktionen von Pflanzen hinwies, z.B. bei der HR. Damit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Spiegel freier Sphingobasen der Pflanze, insbesondere von t18:0, in Antwort auf bakterielle Pathogene reguliert werden. Diese spezifische Regulation korreliert, in Abh{\"a}ngigkeit von der Pathogeninfektion, mit dem Verlauf der HR. Im Unterschied zu avirulenten St{\"a}mmen sind virulente Pst in der Lage, Abwehrreaktionen des Wirtsorganismus zu unterdr{\"u}cken. Daher tritt keine HR auf, welche die Ausbreitung des Pathogens stoppen k{\"o}nnte. Die unterschiedliche Beeinflussung der t18:0 Gehalte virulenter und avirulenter St{\"a}mme zeigte sich auch in Experimenten mit einem anderen P. syringae Stamm. Freie Sphingobasen zeigten in dieser Arbeit typische Merkmale von Signalmolekulen: geringe basale Spiegel, schnelle und transiente Gehaltsanderungen, pr{\"a}zise Regulation sowie spezifische Wirkeffekte. Sphingolipide stellen somit, neben den etwa durch PAMPs ausgel{\"o}sten und durch Phytohormone vermittelten, weitere Signalwege in der Pflanzen Pathogen Interaktion dar. Die Infiltration von Pst in Bl{\"a}tter der A. thaliana Mutante sbh1-1 f{\"u}hrte zu transient erh{\"o}hten d18:0 Spiegeln. In dieser Mutante ist die Funktion von einer der zwei Sphingobasen-Hydroxylasen gest{\"o}rt. Wie sich nach Totalhydrolyse zeigte, sind die Gesamtgehalte von t18:0 in der Mutante allerdings nicht reduziert. Dies spricht daf{\"u}r, dass der pathogenabh{\"a}ngige transiente Anstieg von t18:0 durch de novo Synthese aus d18:0 entsteht und nicht durch Freisetzung aus komplexen Sphingolipiden mittels spezifischer Lipasen. Somit ist die Hydroxylase SBH1 f{\"u}r den schnellen signalvermittelten Anstieg von t18:0 verantwortlich. Neben t18:0 l{\"o}sen auch strukturell {\"a}hnliche freie Sphingobasen, z.B. d18:1 und d18:0, Abwehrreaktionen und Zelltod aus, w{\"a}hrend andere Sphingobasen (d20:0 und d20:1) sowie Ceramide keine Reaktionen ausl{\"o}sten. Dies weist auch direkt auf die Spezifit{\"a}t der beteiligten Mechanismen hin.},
  subject      = {Sphingolipide},
  language  = {de}
}