@phdthesis{Voss2004,
  author    = {Voss, Jan},
  title     = {Substratspezifit{\"a}t und Signaltransduktion zellul{\"a}rer und onkogener Abl-Tyrosinkinasen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12819},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Deregulierte {\"U}beraktivierung von Tyrosinkinasen der Abl-Familie spielen eine wesentliche Rolle in verschiedenen Leuk{\"a}mieformen beim Menschen. Neben der schon seit vielen Jahren f{\"u}r die CML als urs{\"a}chlich anerkannten Fusionskinase p210Bcr-Abl sind weitere Fusionskinasen unter Beteiligung der Abl-Kinase in Formen der sowohl CML als auch der ALL und CMML beschrieben worden. Diese seltener auftretenden Abl-Fusionskinasen umfassen sowohl Bcr-Abl Proteine anderer Gr{\"o}ße (p165Bcr-Abl, p190Bcr-Abl und p230Bcr-Abl) als auch die Tel-Abl Fusionskinasen, die anstelle von Teilen des Bcr-Proteins Teile des Tel-Proteins beinhalten. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kinasespezifit{\"a}t der onkongenen Fusionstyrosinkinasen Bcr-Abl und Tel-Abl mit der der physiologischen Kinasen c-Abl und Arg verglichen. Mittels kurzer Peptide, deren Aminos{\"a}uresequenzen Phosphorylierungsepitopen in Substratproteinen der Kinasen der Abl-Famile entsprechen, konnte eine verminderte katalytische Spezifit{\"a}t der onkogenen Kinasen Bcr-Abl und Tel-Abl gezeigt werden. Der zweiten Teil der hier dargestellten Ergebnisse fokussiert auf Signaltransduktionsereignisse, die in Tel-Abl exprimierenden Zellen auftreten, und vergleicht diese mit der f{\"u}r Bcr-Abl bekannten Signaltransduktion. {\"A}hnlich wie Bcr-Abl konnte auch Tel-Abl in Proteinkomplexen mit dem Adapterprotein CRKL, ein Protein, das in Bcr-Abl-transformierten Zellen konstitutiv Tyrosin-phosphoryliert ist, nachgewiesen werden. Des weiteren wurde gezeigt, daß in den Tel-Abl exprimierenden Zellen die Adapterproteinen c-CrkII und CRKL phosphoryliert sind und mit vielen anderen tyrosinphosphorylierten Proteinen Komplexe bilden. Schließlich wurden einige Signaltransduktionsschritte beschrieben, die sowohl in Zellen, die Tel-Abl exprimieren, als auch in Zellen mit Bcr-Abl-Expression aktiviert sind. Mittels eines Ras×GPT-spezifischen Pr{\"a}zipitationsassys konnte eine konstitutive Anhebung des GTP-belandenen Anteils des GTPase Ras in den Zellen mit Expression der leuk{\"a}mischen Abl-Formen gezeigt werden. Sowohl die mitogene Kinase MAPK/Erk als auch die Kinase Akt/PKB, welche die Apotptose blockiert, werden ebenfalls durch Tel-Abl aktiviert. Die Ergebnisse der hier dargestellten Arbeit zeigen, daß die leuk{\"a}mischen Abl-Fusionsproteine eine katalytische Spezifit{\"a}t aufweisen, die sich von der der physiologischen Abl-Kinasen unterscheidet und daß Tel-Abl zumindest einige der Signaltransduktionswege zu aktivieren vermag, welche auch durch das onkogene Protein Bcr-Abl aktiviert werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Popp2004,
  author    = {Popp, Christian},
  title     = {Identifizierung von Aminos{\"a}uren als Teile der Substratbindungstasche des Kationentransporters 1 der Ratte (rOCT1) und Interaktion des rOCT2 mit der schwachen Base Chinin},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12349},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Zusammenfassungen 83 5 Zusammenfassungen 5.1 Zusammenfassung Durch Expressionsklonierung wurde 1994 der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Ratte isoliert (Gr{\"u}ndemann et al., 1994). 1999 wurde eine Aminos{\"a}ure in der 11. Transmembrandom{\"a}ne von rOCT1 entdeckt, welche Teil der Substratbindungstasche dieses Transporters war (Gorboulev et al., 1999). Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es weitere funktionell relevante Aminos{\"a}uren zu identifizieren. Ein Vergleich der „Helical Wheels" aller 12 hypothetischen Transmembrandom{\"a}nen zeigte eine Akkumulation von 5 OCT und OCTN spezifischen Aminos{\"a}uren in der vierten Transmembrandom{\"a}ne auf einer Seite. Bei diesen Aminos{\"a}uren handelte es sich um K215, W218, Y222, T226 und V229. Es wurden verschiedene Punktmutationen an diesen Positionen eingef{\"u}hrt. Es zeigte sich mit Hilfe radioaktiv markierter Substrate von rOCT1, dass selbst Substitutionen durch strukturell verwandte Aminos{\"a}uren bei den flankieren Aminos{\"a}uren zu einem Ausfall des rOCT1 vermittelten Substrattransport f{\"u}hrte. Weiterhin schien an Position 218 f{\"u}r den rOCT1- vermittelten Transport von TEA eine aromatische Aminos{\"a}ure von großer funktioneller Relevanz zu sein. Wir vermuten hier eine Kationen p-Elektronen Interaktion des aromatischen Ringsystems des Tryptophans mit der positiven Ladung des TEA. Versuche mit den Mutanten des Tyrosins 222 zeigten ebenfalls {\"A}nderungen bei den Transportraten und Affinit{\"a}ten verschiedener Substrate. Eine Kationen-p Interaktion konnte ausgeschlossen werden, jedoch war die Affinit{\"a}t der Mutante Y222F zum TPeA um einen Faktor 20 gegen{\"u}ber dem Wildtyp erh{\"o}ht. Weiterf{\"u}hrende Untersuchungen mit der Zwei- Elektrodenspannungsklemme zeigten unterschiedliche Affinit{\"a}ten des TPeA zum Wildtyp im Vergleich zum mutierten Protein in seiner nach außen bzw. nach innen gerichteten Konformation. War die Form der Inhibierung des TEA-induzierten Stromes durch TPeA beim Wildtyp kompetitiv, so zeigte sie bei der Mutante einen nicht-kompetitiven Charakter. Die Mutante T226A zeigte ebenfalls {\"A}nderungen in Affinit{\"a}t und Selektivit{\"a}t. Bei allen transportierenden Mutanten zeigte sich, dass der Transport von MPP nicht oder kaum ver{\"a}ndert war, hingegen wurden sehr starke {\"A}nderungen der Transportcharakteristika von TEA gefunden, was auf verschiedene Substratbindungsstellen in rOCT1 hinweist. Diese Versuche zeigen deutlich die funktionelle Relevanz und die Beteiligung der mutierten Aminos{\"a}urepositionen an der Substratbindetasche von rOCT1. In Versuchen, in welchen Chinin als Inhibitor des rOCT2 vermittelten Transports genutzt wurde, passierte Chinin mittels Diffusion in seiner ungeladenen Form die Oozytenmembran und hemmte rOCT2 von der Innenseite. Dies k{\"o}nnte der Grund f{\"u}r die nicht-kompetitive Form der Inhibition der TEA-Aufnahme durch Chinin sein. Diese Versuche wurden dadurch best{\"a}tigt, dass die protonierte Form des Chinins eine kompetitive Form der Inhibition zeigte und den Transporter von außen hemmte.},
  subject      = {Ratte},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hegyi2001,
  author    = {Hegyi, Annette},
  title     = {Charakterisierung der Substratspezifit{\"a}t coronaviraler 3C-like-Proteasen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-271},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Coronaviren sind mit einer Genomgr{\"o}ße von 27-32 kb die gr{\"o}ßten bekannten RNA-Viren. Sie infizieren ein breites Spektrum von Vertebraten und f{\"u}hren zu betr{\"a}chtlichen wirtschaftlichen Sch{\"a}den in der Tierzucht. Eine zentrale Regulationsebene im coronaviralen Lebenszyklus stellt die proteolytische Prozessierung dar. Sie f{\"u}hrt zur Freisetzung der einzelnen funktionellen Proteinkomponenten des Replikationskomplexes. Eine Schl{\"u}sselfunktion in diesem Prozess haben die viruskodierten 3C-like-Proteasen, die aus diesem Grund attraktive Zielmolek{\"u}le f{\"u}r die Entwicklung anticoronaviraler Therapien darstellen. Eine wichtige Voraussetzung f{\"u}r die Entwicklung effektiver und selektiver Inhibitoren stellt die biochemische und strukturelle Charakterisierung der Coronavirus-3C-like-Protease (3CLpro) dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Substratspezifit{\"a}t der coronaviralen 3C-like-Proteasen in vitro untersucht. Dazu wurden zun{\"a}chst f{\"u}nf verschiedene coronavirale 3C-like-Proteinasen (FIPV-, TGEV-, HCoV-, MHV- und IBV-3CLpro) rekombinant als MBP-3CLpro-Fusionsproteine in E.coli exprimiert. Die 3CLpro-Dom{\"a}ne des felinen Coronavirus FIPV wurde dabei erstmals kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminos{\"a}uresequenz der FIPV-3CLpro wurde mit der anderer coronaviraler 3C-like-Proteasen verglichen und ergab eine außerordentlich enge phylogenetische Verwandschaft von FIPV und TGEV. Die MBP-Fusionsproteine wurden affinit{\"a}tschromatographisch aufgereinigt und die authentischen 3C-like-Proteasen durch die Abspaltung des MBP mittels Endoproteinase Faktor Xa freigesetzt. Alle gereinigten 3C-like-Proteasen zeigten Transspaltungsaktivit{\"a}t gegen{\"u}ber synthetischen Peptiden und konnten somit f{\"u}r die biochemische Charakterisierung verwendet werden. Kompetitive Spaltungsassays mit den 3C-like-Proteasen von HCoV, TGEV und MHV und synthetischen Peptiden, die verschiedene Spaltstellen im coronaviralen Replikasepolyprotein repr{\"a}sentieren, ergaben eine Schnittstellenhierarchie, die {\"u}ber Speziesgrenzen hinweg konserviert ist. {\"U}bereinstimmend konnte f{\"u}r die HCoV-, TGEV- und MHV-3C-like-Protease gezeigt werden, dass die die 3CLpro flankierenden Schnittstellen am effektivsten hydrolysiert werden. Diese Daten lassen auf eine fr{\"u}hzeitige (m{\"o}glicherweise kotranslationale) Freisetzung der 3C-like-Protease aus dem viralen Polyprotein schließen, die eine weitgehend in trans erfolgende Prozessierung der viralen Polyproteine zur Folge h{\"a}tte. Interessanterweise wurde das die aminoterminale HCoV-3CLpro-Schnittstelle repr{\"a}sentierende Peptid von allen getesteten coronaviralen 3C-like-Proteasen {\"u}beraus effektiv gespalten, so dass diese Sequenz als Grundlage f{\"u}r die Entwicklung eines f{\"u}r Coronaviren universellen Substrates in einem sensitiven, kontinuierlichen Assay f{\"u}r Coronavirus-3C-like-Proteasen dienen konnte. Dieser auf einem fluorogenen Substrat basierende Assay erweitert das Spektrum der bisher verf{\"u}gbaren analytischen Methoden zur Charakterisierung der coronaviralen 3C-like-Proteasen und k{\"o}nnte in modifizierter Form auch f{\"u}r andere virale Proteasen verwendet werden. Eine initiale Charakterisierung mit klassenspezifischen Inhibitoren zeigte die Eignung des Assays f{\"u}r ein high throughput screening (HTS) nach potentiellen 3CLpro-Inhibitoren, das eine wichtige Technik der pharmazeutischen Industrie f{\"u}r die schnelle und effiziente Suche und Optimierung relevanter Verbindungen darstellt. F{\"u}r das rationale Design 3CLpro-spezifischer Inhibitoren ist die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur essentiell. Von besonderem Interesse ist dabei die Aufkl{\"a}rung der strukturellen Grundlagen der Substratspezifit{\"a}t. Auf der Suche nach coronaviralen 3C-like-Proteasen mit guten Kristallisationseigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit f{\"u}r die FIPV- und TGEV-3CLpro Reinigungsprozeduren etabliert, die zu hochgereinigten Proteinen mit relativ guten Kristallisationseigenschaften f{\"u}hrten, die gute Voraussetzungen f{\"u}r eine r{\"o}ntgenkristallographische Strukturanalyse schaffen.},
  subject      = {Coronaviren},
  language  = {de}
}