@phdthesis{Fehrholz2011,
  author    = {Fehrholz, Markus},
  title     = {APOBEC3G-vermittelte Hemmung der Masernvirus-Replikation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56143},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Das Masernvirus (MV) ist ein negativ-str{\"a}ngiges RNA-Virus aus der Familie der Paramyxovi-ridae und z{\"a}hlt immer noch zu den h{\"a}ufigsten Todesursachen bei Kindern in Entwicklungs-l{\"a}ndern. Nach dem Eintritt in den K{\"o}rper f{\"u}hrt eine Infektion von CD150-exprimierenden B- und T-Lymphozyten sowie dendritischen Zellen (DCs) und Monozyten bzw. Makrophagen zu einer systemischen Infektion. Viele Mitglieder der Familie der APOBEC-Proteine („apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like proteins"), u. a. auch APOBEC3G, werden als Teil der angeborenen Immunantwort in diesen Zellen und infizierten Geweben exprimiert. In fr{\"u}heren Studien wurde bereits gezeigt, dass diese Proteine durch ihre RNA-bindenden Eigenschaften und ihre F{\"a}higkeit zur Desaminierung von Cytosin zu Uracil zu einer Inhibition von verschiedenen Retroelementen und Retroviren, wie beispielsweise den „long interspersed nuclear elements 1" und dem humanen Im-mundefizienz-Virus (HIV) f{\"u}hren. Das Ziel dieser Arbeit war es, m{\"o}gliche antivirale Mechanismen von humanem APOBEC3G gegen das MV als Vertreter der negativ-str{\"a}ngigen RNA-Viren zu identifizieren. Hierzu wurden rekombinante MV-Wildtyp und -Impfst{\"a}mme, sowie APOBEC3G-{\"u}berexprimierende Vero-Zelllinien verwendet. Es zeigte sich, dass die Replikation des verwendeten rekombinanten Masern Wildtyp- und Impfvirus durch humanes APOBEC3G inhibiert wird. Diese Inhibition {\"a}ußerte sich in einer reduzierten Synzytienbildung, einer mindestens 50 \%igen Reduktion viral-exprimierter Proteine, sowie in einer 90-99 \%igen Reduktion der auf APOBEC3G-exprimierenden Zellen entstandenen viralen Titer. Durch Sequenzanalysen konnte festgestellt werde, dass es zu einem Anstieg von 0,2 auf 0,95 unspezifischer Mutationen pro 1.000 Basenpaaren in MV-Transkripten kam, deren Muster mit dem in Kontrollzellen vergleichbar war, wohingegen typische C zu U(T) bzw. G zu A Hypermutationen nicht auftraten. Eine Kolokalisation von humanem APOBEC3G mit MV-spezifischen Proteinen konnte ebenfalls nicht eindeutig beobachtet werden. Es zeigte sich allerdings, dass APOBEC3G an virale RNA binden konnte. Außerdem wurde APOBEC3G in aufgereinigten viralen Partikeln um etwa den Faktor 4 angereichert. Versuche mit einem MV-Minireplikon-System ergaben, dass APOBEC3G eine Inhibition der viralen RNA-abh{\"a}ngigen RNA-Polymerase bewirkt, vermutlich aufgrund der F{\"a}higkeit des Proteins an virale RNA zu binden. Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen mit mutierten APOBEC3G-Proteinen haben auch in die-ser Arbeit erneut belegt, dass der RNA-bindenden Desaminase-Dom{\"a}ne bei der zellul{\"a}ren Lokalisation des Proteins eine besondere Rolle zukommt, da einige Mutationen innerhalb dieses Bereiches zu einem hohen Verlust der Proteinexpression sowie zu einer Ansammlung der mutierten Proteine am rauen endoplasmatischen Retikulum f{\"u}hren. Die in dieser Arbeit gezeigte Inhibition der Replikation von MV durch humanes APO-BEC3G l{\"a}sst eine generelle antivirale Aktivit{\"a}t von Mitgliedern der APOBEC-Familie gegen negativ-str{\"a}ngige RNA-Viren vermuten, welche auf der F{\"a}higkeit des Proteins beruht RNA zu binden. Weitere Untersuchungen bez{\"u}glich der Inhibition anderer Vertreter der Mononegavirales durch verschiedene APOBEC-Proteine k{\"o}nnten Aufschluss {\"u}ber die beteiligten Mechanismen geben.},
  subject      = {RNS-Bindung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zinke2012,
  author    = {Zinke, Michael Benedikt},
  title     = {Hemmung der Masernvirusreplikation durch RNA-Interferenz},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83933},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die subakut sklerosierende Panenzephalitis ist eine demyelinisierende Erkrankung des ZNS. {\"A}tiologisch liegt eine persistierende Infektion von Masernviren der Neuronen bzw. Gliazellen zugrunde. Bis heute gibt es keine spezifische Therapie und lediglich symptomatische Therapiemaßnahmen werden in deren Behandlung angewandt. Obwohl sich w{\"a}hrend des Krankheitsverlaufes eine ausgepr{\"a}gte Immunantwort des nat{\"u}rlichen als auch adaptiven Immunsystems des Wirtes abspielt f{\"u}hrt die Erkrankung unweigerlich zum Tode der Betroffenen. Eine Therapiem{\"o}glichkeit diesbez{\"u}glich k{\"o}nnten die Effekte der RNAi darstellen. Um geeignete Sequenzen f{\"u}r einen m{\"o}glichen Genknockdown einzelner MV-Gene herauszufiltern, wurde ein plasmid-basierendes Testsystem entwickelt, das die mRNA des Fluoreszenzproteins DsRed2 zusammen mit mRNA-Sequenzen einzelner MV-Gene exprimiert. Gegen diese MV-Gene wiederum wurden verschiedene shRNAs ausgew{\"a}hlt, welche mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems exprimiert werden. Als Expressionsindikator findet in diesem lentiviralen Vektorsystem simultan die Expression von eGFP als statt. Die Auswertung dieses Dual-Color-Systems erfolgte im Folgenden mittels FACS-Analysen. Die wirksamsten siRNA-Sequenzen, ausgew{\"a}hlt durch eine hohe Abnahme der Rotfluoreszenz in den untersuchten Zellen, wurden f{\"u}r weitere Versuche selektiert. Die auf diese Weise ausgew{\"a}hlten shRNA-Sequenzen wurden in einem weiteren Schritt durch die Generierung lentiviraler Partikel in persistierend infizierten NT2-Zellen (piNT2), die das Fluoreszenzprotein HcRed als Infektionsindikator exprimieren, transduziert. Weitere durchflusszytometrische Messungen zeigten eine {\"a}ußerst hohe Reduktion viraler Replikation innerhalb von 7 Tagen bis unterhalb der Detektionsgrenze sofern die shRNAs gegen die Expression der MV-Proteine N, P und L gerichtet waren. Die Anzahl der virus-negativen Zellen blieb im Folgenden bis zu 3 Wochen nach stattgehabter Transduktion konstant, sofern das fusion-inhibiting-peptide den Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die transduzierten piNT2-Zellen, welche keine Expression von HcRed zeigten wurden auf Zellrasen bestehend aus Vero-Zellen aufgetragen und f{\"u}hrten im zeitlichen Verlauf zu keiner Fusion bzw. Synzytienbildung. Dieser Zusammenhang legt nahe, dass die transduzierten piNT2-Zellen die F{\"a}higkeit einer Expression viraler Proteine verloren haben und eine „Heilung" stattfinden kann, wenn die virale Proteinbiosynthese durch eine permanente Expression von siRNAs, wie beispielsweise durch lentivirale Vektorsysteme, gehemmt wird.},
  subject      = {RNS-Interferenz},
  language  = {de}
}