@phdthesis{Reuss2006,
  author    = {Reuß, Oliver Rainer},
  title     = {Funktionelle Analyse einer Familie von Oligopeptidtransportern des humanpathogenen Hefepilzes Candida albicans},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20515},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Der Hefepilz Candida albicans ist Teil der nat{\"u}rlichen Mikroflora auf den Schleimh{\"a}uten des Verdauungs- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Allerdings kann C. albicans vor allem in immunsupprimierten Patienten auch schwerwiegende Infektionen verursachen. Diese reichen von oberfl{\"a}chlichen Mykosen bis hin zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen. C. albicans besitzt eine Reihe von Eigenschaften, die es diesem opportunistisch humanpathogenen Pilz erm{\"o}glichen unterschiedliche Wirtsgewebe zu kolonisieren und zu infizieren. Ein wichtiger Virulenzfaktor sind sekretorische Aspartylproteasen (SAPs), die von einer großen Genfamilie von zehn SAP-Genen codiert werden. Die SAPs werden w{\"a}hrend der Infektion differentiell exprimiert und {\"u}bernehmen unterschiedliche Rollen im Infektionsverlauf. So tragen sie zur Adh{\"a}renz bei, k{\"o}nnen Wirtsbarrieren und Molek{\"u}le der Wirtsimmunabwehr zerst{\"o}ren oder liefern N{\"a}hrstoffe, indem sie Proteine abbauen. Unter den zehn SAP-Genen ist SAP2 f{\"u}r ein Wachstum von C. albicans auf Proteinen als alleiniger Stickstoffquelle verantwortlich. Allerdings ist wenig {\"u}ber die Regulation der SAP2-Expression und {\"u}ber die Aufnahme der proteolytischen Abbauprodukte in die Zelle bekannt. In dieser Arbeit wurde eine Familie von Oligopeptidtransportern von C. albicans funktionell analysiert. Da aus fr{\"u}heren Arbeiten bekannt war, dass SAP2 durch Peptide mit mindestens acht Aminos{\"a}uren induziert werden kann, k{\"o}nnten einzelne Mitglieder dieser Familie neben der Transportfunktion auch eine Sensorfunktion f{\"u}r Peptide {\"u}bernehmen und somit {\"u}ber einen Signalweg SAP2 induzieren. In der Genomsequenz von C. albicans wurden neben dem bereits beschriebenen OPT1-Gen sieben weitere Gene identifiziert, deren Genprodukte signifikante Homologie zu Opt1p aufwiesen und die deshalb als OPT2-OPT8 bezeichnet wurden. Um die Rolle dieser putativen Oligopeptidtransporter bei der SAP2-Induktion und beim Transport der durch Sap2p-Aktivit{\"a}t bereitgestellten proteolytischen Abbauprodukte zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die OPT-Gene spezifisch deletiert waren. Zu diesem Zweck wurde eine Methode zur gezielten Geninaktivierung etabliert, die auf einem neuen, recycelbaren dominanten Selektionsmarker (caSAT1) beruht, der Resistenz gegen Nourseothricin verleiht. Die "SAT1-Flipping"-Strategie kann direkt in C. albicans Wildst{\"a}mmen angewendet werden und umgeht somit alle Probleme, die mit der Verwendung von auxotrophen Ausgangsst{\"a}mmen verbunden sind. Alle Mutanten, in denen jeweils eines der OPT-Gene inaktiviert war, verhielten sich wie der Wildtyp und zeigten keinen Wachstumsdefekt auf bovinem Serumalbumin (BSA) als alleiniger Stickstoffquelle, w{\"a}hrend eine sap2-Nullmutante unter diesen Bedingungen nicht wachsen kann. Somit ist kein einzelnes OPT-Gen f{\"u}r C. albicans notwendig, um auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle zu wachsen. Dagegen zeigten opt123-Triplemutanten {\"a}hnlich wie die sap2-Mutante einen starken Wachstumsdefekt auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle, der durch Reintegration einer intakten Kopie von OPT1, OPT2 oder OPT3 wieder aufgehoben werden konnte. Der Wachstumsdefekt der opt123-Triplemutanten war nicht auf eine fehlende Induktion von SAP2 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren, sondern auf das Unverm{\"o}gen dieser Mutanten, die durch den proteolytischen Abbau von BSA entstandenen Peptide zu transportieren. Mit Hilfe von Reportergenen konnte gezeigt werden, dass die einzelnen OPT-Gene differentiell exprimiert werden. W{\"a}hrend keines der Gene in einem Vollmedium (YPD) exprimiert wurde, wurde eine starke Induktion von OPT1 und OPT3 in Gegenwart von BSA als alleiniger Stickstoffquelle beobachtet. Nach Expression von OPT4 und OPT5 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors in den opt123-Triplemutanten konnte deren Wachstumsdefekt auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle ebenfalls kompensiert werden, w{\"a}hrend die zus{\"a}tzliche Deletion dieser Gene in den dabei entstandenen opt1234-Quadruple- und opt12345-Quintuplemutanten den Wachstumsdefekt noch verst{\"a}rkte. Diese Ergebnisse best{\"a}tigten, dass die Gene OPT1-OPT5 f{\"u}r funktionelle Oligopeptidtransporter codieren. Weitere Experimente zeigten, dass die Oligopeptidtransporter unterschiedliche Substratpr{\"a}ferenzen haben. W{\"a}hrend das Tetrapeptid LWMR f{\"u}r St{\"a}mme, die spezifisch OPT3, OPT4, oder OPT5 exprimierten, ein besseres Substrat war als das Tetrapeptid LSKL, konnten St{\"a}mme, die spezifisch OPT2 exprimierten, das LSKL-Peptid verwerten, nicht aber das LWMR-Peptid. Experimente mit Peptiden definierter L{\"a}nge und Zusammensetzung wiesen außerdem darauf hin, dass die Oligopeptidtransporter in der Lage sind, auch l{\"a}ngere Peptide mit bis zu mindestens acht Aminos{\"a}uren zu transportieren. Die Evolution einer Genfamilie, die f{\"u}r Oligopeptidtransporter mit unterschiedlicher Substratpr{\"a}ferenz codieren, hat deshalb vermutlich dazu beigetragen, dass C. albicans Proteine sehr effizient als Stickstoffquelle verwerten und sich an die Nahrungsbedingungen in verschiedenen Wirtsnischen optimal anpassen kann.},
  subject      = {Candida albicans},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rupprecht2006,
  author    = {Rupprecht, Daniel},
  title     = {Synthese und Optimierung sequenzselektiver k{\"u}nstlicher Rezeptoren f{\"u}r biologisch relevante Oligopeptide},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20277},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung von k{\"u}nstlichen Rezeptoren f{\"u}r biologisch relevante Oligopeptide und besteht aus drei Teilen. Im ersten Teil wurde auf der Basis von computergest{\"u}tzten de novo Berechnungen ein k{\"u}nstlicher Rezeptor f{\"u}r den D-Alanin-D-Alanin-C-Terminus entwickelt. Diese Peptidsequenz befindet sich in bakteriellen Zellw{\"a}nden und nimmt eine Schl{\"u}sselfunktion in der Wirkungsweise des Antibiotikums Vancomycin ein. Zur Entwicklung dieses Rezeptors wurde ein Guanidiniocarbonylpyrrol als Bindungsmotiv f{\"u}r Carboxylate mit einer Cyclotribenzylen-Einheit verkn{\"u}pft. Letztere ist entsprechend der theoretischen Berechnungen in der Lage, die Methylreste des Alanins gr{\"o}ßenselektiv durch hydrophobe Wechselwirkungen zu koordinieren. Dieser Rezeptor wurde in umfangreichen Bindungsstudien bez{\"u}glich seiner Affinit{\"a}t in Wasser und seiner Substratselektivit{\"a}t untersucht. Zur Erh{\"o}hung der L{\"o}slichkeit und zur Bestimmung der Komplexstruktur mit NMR-Techniken in Wasser wurde ein weiteres Derivat des Rezeptors synthetisiert, welches in peripherer Position mit Triethylenglykolseitenketten substituiert ist. Auf diese Weise gelang es, einen hoch affinen (log K = 4,7) und hoch selektiven k{\"u}nstlichen Rezeptor f{\"u}r den D-Ala-D-Ala-Terminus darzustellen und umfassend zu charakterisieren. So konnte gezeigt werden, dass ein de novo Design derartiger Rezeptoren prinzipiell m{\"o}glich ist. In einem weiteren Teilprojekt wurde ein k{\"u}nstlicher Rezeptor f{\"u}r die interne RGD-Peptidsequenz entwickelt. Diese nimmt eine zentrale Funktion in Zell-Zell- und Zell-Matrix-Erkennungsprozessen ein. Dieses Teilprojekt wurde in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Schrader (Universit{\"a}t Marburg) durchgef{\"u}hrt. Dazu wurde ein Bindungsmotiv f{\"u}r Alkylguanidine (in der Seitenkette von Arg, R) {\"u}ber einen geeigneten Spacer mit einem Bindungsmotiv f{\"u}r Carboxylate (in der Seitenkette von Asp, D) verkn{\"u}pft. Nach der Synthese und Charakterisierung einer Reihe von vier Rezeptoren konnte die grunds{\"a}tzliche Anwendbarkeit dieses Ansatzes best{\"a}tigt werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass der verwendete Spacer f{\"u}r die Effektivit{\"a}t der Koordinierung von besonderer Bedeutung ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde in einem dritten Teilprojekt ein kombinatorisches Festphasenprotokoll zur Optimierung derartiger Spacer entwickelt. Dabei wurde das Carboxylat-Bindungsmotiv (ein Guanidiniocarbonylpyrrol) auf einem polymeren Tr{\"a}ger immobilisiert. Zu diesem Zweck wurden umfangreiche Studien zur Synthese von Pyrrol-Tricarboxylaten und zur Verwendung verschiedener Schutzgruppen unternommen. Die Eigenschaften von drei Schutzgruppen unterschiedlicher Sensitivit{\"a}t (basisch, stark sauer und photolytisch spaltbar) auf dem Acylguanidin wurden in L{\"o}sung und an der festen Phase untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein umfangreiches HPLC-Protokoll zur Charakterisierung der Reaktion entwickelt. So gelang die Entwicklung und Etablierung eines universell einsetzbaren Protokolls zur Optimierung derartiger Rezeptoren, womit zahlreiche Anwendungsm{\"o}glichkeiten in der kombinatorischen Chemie aber auch in weiteren Teilbereichen wie der Katalyse oder der Chromatographie erm{\"o}glicht werden.},
  subject      = {Oligopeptide},
  language  = {de}
}