@phdthesis{Stoelzle2003,
  author    = {St{\"o}lzle, Sonja},
  title     = {Licht- und Redoxregulation von Calcium-permeablen Kan{\"a}len in Arabidopsis thaliana Mesophyllzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6975},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {1. Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana sind mit Hyperpolarisations-ab-h{\"a}ngigen, Calcium-permeablen Kan{\"a}len ausgestattet. In Ca2+-haltigen L{\"o}sungen folgte die Nullstromspannung der Nernst-Spannung mit 27 mV bei einer zehnfachen Erh{\"o}hung der Ca2+-Konzentration. Die Sequenz an relativen Stromamplituden ergab Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). Der makroskopische Strom wurde auf der Basis einer 7,2 ± 1 pS-Leitf{\"a}higkeit bei einer Pipettenl{\"o}sung mit 10 mM Ba2+ in der cell-attached Konfiguration gebildet. Die Kan{\"a}le waren sensitiv gegen{\"u}ber Lanthan und Gadolinium, wobei die Stromamplitude bei 100 µM Lanthan um 97,2 ±7 \% und bei 100 µM Gadolinium um 95,2 ± 7 \% reduziert wurde. 2. Blaulicht induzierte den Hyperpolarisations-abh{\"a}ngigen, Calcium-permeablen Kanal in dunkeladaptierten, intakten Mesophyll-Protoplasten. Die Aktivierung war zeitabh{\"a}ngig und der Stromanstiegs erreichte eine S{\"a}ttigung nach 11-16 Minuten. Weiterhin wurde bestimmt, dass eine Kanalaktivit{\"a}t erst bei einer Intensit{\"a}t an Blaulicht > 50 µmol/m2s1 induziert wird. Aufgrund der Tatsache, dass der photosynthetische Elektronentransport-Entkoppler DCMU die Aktivierung nicht verhinderte, konnte eine Beteiligung des Photosyntheseapparates ausgeschlossen werden. Eine Inhibierung der Aktivierung nach Inkubation mit dem Kinase-Inhibitor K252a war ein erster Hinweis f{\"u}r die Beteiligung von Phototropinen als relevante Blaulicht-Rezeptoren, da Phototropine eine Kinase-Funktion besitzen. Diese Hypothese best{\"a}tigte sich nach {\"U}berpr{\"u}fung der Phototropin-knockout-Mutanten phot1-5 und phot1-5 phot2-1. Da die Aktivierung in phot1-5 reduziert war, und in phot1-5 phot2-1 keine Aktivierung der Kan{\"a}le durch Blaulicht mehr m{\"o}glich war, konnte auf eine {\"u}berlappende Funktion beider Photorezeptoren bez{\"u}glich der Aktivierung von Calcium-permeablen Kan{\"a}len geschlossen werden. Dagegen konnte eine Beteiligung weiterer Blaulicht-Rezeptoren, der Cryptochrome, ausgeschlossen werden. 3. Neben Blaulicht aktivierten auch reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) Hyper-polarisation-abh{\"a}ngige, Calcium-permeable Kan{\"a}le. Protoplasten mit intaktem Cytoplasma (cell-attached Konfiguration) zeigten nach Applikation von 5 mM H2O2 eine zeitabh{\"a}ngige Aktivierung der Lanthan-sensitiven Kan{\"a}le. Eine S{\"a}ttigung des Stromanstiegs wurde nach ca. 25 Minuten erreicht. Neben dem Wildtyp (Col-0) wurde die Mutante dnd1 hinsichtlich Calcium-permeabler Kan{\"a}le {\"u}berpr{\"u}ft. Sie besitzt einen nicht-funktionellen putativen cyclisch-Nukleotid-aktivierten Kanal, CNGC2, und zeigt Ph{\"a}notypen bei der Pathogenabwehr. Eine histochemische DAB-F{\"a}rbung ergab, dass dnd1 eine dem Wildtyp vergleichbare ROS-Produktion nach Inokulation mit avirulenten Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB besitzt. Da eine ROS- bzw. H2O2-Produktion, ein wichtiger initiierender Schritt bei Abwehrmechanismen, in der Mutante nicht beeintr{\"a}chtigt war, wurde {\"u}berpr{\"u}ft, ob ROS-aktivierte, Calcium-permeable Kan{\"a}le in dnd1 beobachtet werden konnten. Nach Applikation von 5 mM H2O2 zu intakten Protoplasten wurde keine dem Wildtyp vergleichbare Aktivierung Calcium-permeabler Kan{\"a}le festgestellt. Daraufhin konnte spekuliert werden, dass CNGC2 im Wildtyp den Calcium-permeablen Kanal repr{\"a}sentiert. Eine Blaulicht-Aktivierung der Calcium-permeablen Kan{\"a}le in der Kanal-Mutante war jedoch m{\"o}glich, was die Frage aufkommen ließ, ob es sich um verschiedene Kan{\"a}le mit denselben elektrophysiologischen Charakteristika handelt, oder ob es sich bei dem H2O2-aktivierten und dem Blaulicht-aktivierten Kanal um denselben Kanal handelt, der durch verschiedene Signalketten angeschaltet wird. Cyclische Nukleotide (cAMP) konnten die Kan{\"a}le in Wildtyp-Protoplasten nicht aktivieren, was dagegen sprach, dass es sich um CNGC2 handelte. Eine Inhibierung der H2O2-aktivierten Str{\"o}me durch den Calmodulin-Inhibitor W7 wies auf eine Beteiligung eines Calmodulin-abh{\"a}ngigen Schritts in der Signalkette hin. Untersuchungen des Calcium-permeablen Kanals in der outside-out Konfiguration mit einer dem Cytoplasma {\"a}hnlichen internen L{\"o}sung ergab, dass eine Kanalaktivit{\"a}t durch eine erh{\"o}hte Calcium-Konzentration (21 µM) bei Vorhandensein von Calmodulin induziert werden konnte. Cyclische Nukleotide aktivierten wie erwartet keine Hyperpolarisation-abh{\"a}ngigen, Calcium-permeablen Kan{\"a}le. Dies deutete darauf hin, dass CNGC2 die Calcium-permeablen Kan{\"a}le {\"u}ber einen Ca2+/Calmodulin-abh{\"a}ngigen Schritt in einer H2O2-induzierten Signalkette regulieren k{\"o}nnte. Lokalisationsstudien mit einem GFP-CNGC2-Fusionskonstrukt (CNGC2::mGFP4 /pPILY) zeigten, dass der Kanal in vivo im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sein k{\"o}nnte. Dies best{\"a}tigte die Hypothese, dass CNGC2 nicht den Calcium-permeablen Kanal in der Plasmamembran repr{\"a}sentiert und dass der Verlust der Kanalaktivit{\"a}t in dnd1 in einer beeintr{\"a}chtigten Signalkette zu suchen ist.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wulf2001,
  author    = {Wulf, Andrea},
  title     = {Regulierung eines kalziumempfindlichen Kaliumkanals durch Proteinkinase C},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1179144},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Ca2+-empfindliche K+-Kan{\"a}le mittlerer Leitf{\"a}higkeit (IK1-Kan{\"a}le) {\"u}bernehmen wichtige Funktionen bei vielen physiologischen Prozessen wie z.B. bei der Zell-Proliferation, der epithelialen Salz- und Wasser-Sekretion und der Zellmigration. Die Kan{\"a}le werden durch die intrazelul{\"a}re Ca2+-Konzentration reguliert, wobei ihre Ca2+-Sensitivit{\"a}t durch Phosphorylierungsreaktionen moduliert werden kann. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des aus transformierten Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) klonierten Ca2+-sensitiven K+-Kanals mittlerer Leitf{\"a}higkeit (cIK1) und die Untersuchung seiner Regulierung durch die Proteinkinase C (PKC). Dazu wurde der Kanal heterolog in CHO- und HEK293-Zellen exprimiert. Seine biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften sowie der Einfluß der Proteinkinase C auf die Kanalaktivit{\"a}t wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die cIK1-Str{\"o}me sind schwach einw{\"a}rtsrektifizierend, zeigen keine Aktivierungs- oder Inaktivierungskinetik und weisen im physiologischen Bereich keine Spannungsabh{\"a}ngigkeit auf. Der cIK1 ist K+-selektiv und wird durch einen Anstieg der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration aktiviert. Der Kanal wird durch Barium, Charybdotoxin und Clotrimazol blockiert und durch 1-Ethyl-2-Benzimidazolon aktiviert. Die funktionellen und pharmakologischen Eigenschaften des klonierten cIK1 entsprechen damit denen des nativen Kanals aus MDCK-F-Zellen und stimmen mit denen anderer Mitglieder der IK1-Kanalfamilie {\"u}berein. Neben der Regulierung durch die intrazellul{\"a}re Ca2+-Konzentration wird der cIK1 auch durch eine PKC-abh{\"a}ngige Phosphorylierung reguliert. Sowohl ATP als auch ATP?S stimulieren die Kanalaktivit{\"a}t. Die ATP-abh{\"a}ngige Aktivierung wird durch Inhibitoren der Proteinkinase C (Bisindolylmaleimid, Calphostin C) gehemmt, w{\"a}hrend die mit ATP?S induzierte Kanalaktivit{\"a}t weitgehend resistent gegen diese PKC-Inhibitoren ist. Eine Stimulierung der Proteinkinase C mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) f{\"u}hrt zu einer sofortigen Aktivierung des cIK1. Im Gegensatz dazu sind die cIK1-Kan{\"a}le nach fast vollst{\"a}ndigem Abbau der Proteinkinase C durch eine langfristige Inkubierung der Zellen mit PMA nicht mehr aktiv. Um zu untersuchen, ob diese Regulierung eine direkte Interaktion der Proteinkinase C mit dem Kanalprotein erfordert, wurden die drei putativen PKC-Konsensussequenzen des cIK1 mittels zielgerichteter Mutagenese so ver{\"a}ndert, daß eine Phosphorylierung an diesen Stellen nicht mehr m{\"o}glich ist. Weder die einzelne Mutation der PKC-Konsensussequenzen (T101, S178, T329) noch die gleichzeitige Mutation aller drei Phosporylierungsstellen zu Alanin beeinflußt die akute Regulierung des cIK1 durch die Proteinkinase C. Die cIK1-Mutante T329A und die Dreifachmutante reagieren jedoch nach einem Abbau der Proteinkinase C mit einem extremen Anstieg der Kanalaktivit{\"a}t und demaskieren damit einen zweiten Weg der Kanalregulierung. Die Ergebnisse zeigen, daß der cIK1 durch zwei voneinander unabh{\"a}ngige Mechanismen reguliert wird. Eine PKC-abh{\"a}ngige Phosphorylierung erh{\"o}ht die Aktivit{\"a}t der Kan{\"a}le, findet jedoch nicht an den bekannten PKC-Konsensusesquenzen des Kanalproteins statt. Dagegen werden die cIK1-Kan{\"a}le {\"u}ber einen zweiten ATP-abh{\"a}ngigen Mechanismus, der wahrschenlich eine direkte Interaktion mit dem Kanalprotein erfordert, gehemmt.},
  subject      = {Kaliumkanal},
  language  = {de}
}