@phdthesis{Huyke2004,
  author    = {Huyke, Constance Angela},
  title     = {Expression von rekombinanten Antigenen zur Untersuchung der Autoantik{\"o}rperspezifit{\"a}t bei Goodpasture-Syndrom},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11708},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Das Goodpasture-Syndrom z{\"a}hlt zum Formenkreis von Autoimmunerkrankungen, die klinisch unter dem Bild eines pulmorenalen Syndroms verlaufen. Als Goodpasture-Syndrom wird hierbei die Trias aus rapid progredienter Glomerulonephritis, begleitenden Lungenblutungen und dem Auftreten von Anti-GBM-Autoantik{\"o}rpern bezeichnet. Neben dieser klassischen Form existieren auch Verl{\"a}ufe, die nur die Nieren (35 \%) oder nur die Lunge (5 \%) betreffen. Die B-Zell-vermittelte Immunit{\"a}t tr{\"a}gt den Hauptanteil am Krankheitsgeschehen. Die Autoantik{\"o}rper sind gegen die NC1-Dom{\"a}ne der \&\#945;3-Ketten des glomerul{\"a}ren Basalmembran Kollagen (Typ IV) gerichtet. In der indirekten Immunfluoreszenz sind als Korrelat daf{\"u}r charakteristische lineare Ablagerungen von Immunkomplexen zu sehen. Das Goodpasture-Autoantigen ist Bestandteil eines speziellen Kollagennetzwerkes, das nur in der glomerul{\"a}ren und alveolaren Basalmembran vorkommt. Das Goodpasture-Autoantigen ist von diskontinuierlicher Struktur. F{\"u}r die Antik{\"o}rperbindung sind vor allem die Aminos{\"a}ureabschnitte 17-31 (GPA) und 127-141 (GPB) von \&\#945;3(IV)NC1 verantwortlich. Sie werden durch Faltung des Molek{\"u}ls in r{\"a}umliche N{\"a}he zueinander gestellt. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob unterschiedliche klinische Verl{\"a}ufe mit verschiedenen Autoantik{\"o}rperpopulationen korrelieren. Versuche mit rekombinanten Antigenen zeigten die Existenz mehrerer m{\"o}glicher Autoantik{\"o}rpersubklassen. 12 der 14 Seren reagierten st{\"a}rker mit der Chim{\"a}re C6 ( entspricht dem Epitop GPB) als mit C2 (entspricht dem Epitop GPA), die beiden anderen Seren hatten ein umgekehrtes Reaktionsverhalten. Sie hatten eine h{\"o}here Affinit{\"a}t zu C2 (GPA) als zu C6 (GPB). Von den 12 Seren mit der Reaktion C2 < C6 reagierten 5 Seren etwa gleich stark mit C6 und C2.6 (entspricht GPAB). Bei dieser Gruppe richtete sich die Affinit{\"a}t der Autoantik{\"o}rper haupts{\"a}chlich gegen das Epitop GPB, das in beiden Chim{\"a}ren enthalten ist. Sieben Seren hatten das Charakteristikum C2 < C6 << C2.6. Hier hatten die Autoantik{\"o}rper die h{\"o}chtste Affinit{\"a}t zu dem Epitop GPAB als „Gesamtepitop". Die einzelnen Epitopanteile GPA und GPB konnten allein keine so starke Bindung erzeugen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Zusammenhang zwischen der klnischen Auspr{\"a}gung des Goodpasture Syndroms und den Autoantik{\"o}rpersubklassen zu untersuchen. In den beiden gr{\"o}ßeren Gruppen (n=5 und n=7) waren Patienten mit und ohne Lungenbefall eingeschlossen. Die beiden Seren mit C2 > C6 wiesen ebenfalls eine Beteiligung von Lunge und Niere auf. Mit den vorliegenden Fallzahlen war keine Korrelation zu den Autoantik{\"o}rpersubklassen zu ermitteln. Das Outcome hinsichtlich der Nierenfunktion wurde ebenfalls auf einen Zusammenhang mit den Autoantik{\"o}rpersubklassen hin untersucht. Auch hier ergab sich bei den untersuchten Fallzahlen keine Korrelation mit verschiedenen Autoantik{\"o}rpersubklassen. Das initiale Serumkreatinin bei Diagnosestellung und in gewissem Umfang auch die H{\"o}he des Antik{\"o}rpertiters waren die entscheidenden Faktoren. Der zweite Aspekt der vorliegenden Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit sogenannten „doppelt" positiven Patienten mit pulmorenalem Syndrom. Diese geh{\"o}ren zu einer Untergruppe von Vaskulitis-F{\"a}llen, die neben ANCA auch Anti-GBM-Autoantik{\"o}rper vorweisen. Klinisch verlaufen diese F{\"a}lle oftmals sehr {\"a}hnlich wie ein Goodpasture-Syndrom. Die neun untersuchten Patienten mit C-ANCA (n=7) bzw. P-ANCA (n=2) und Anti-GBM-Autoantik{\"o}rpern reagierten alle mit der \&\#945;3(IV)NC1-Dom{\"a}ne, jedoch reagierte nur ein Serum Goodpasture-typisch. Die anderen 8 Seren zeigten entweder keinen Synergismus (n=2) oder reagierten nur sehr schwach (< 16 \%) mit den Chim{\"a}ren (n=6). Das legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Anti-GBM-Antik{\"o}rper bei Vaskulitis-Patienten in der Regel nicht mit denen von einfach positiven Goodpasture-Patienten {\"u}bereinstimmen, sondern gegen verschiedene Substrukturen der Epitope gerichtet sind. Weiterf{\"u}hrende Untersuchungen k{\"o}nnten in dieser Frage Klarheit verschaffen. Die Ergebnisse k{\"o}nnten auch zur Entwicklung eines diagnostischen Tests f{\"u}hren, der die Differenzierung der Autoantik{\"o}rper erlaubt und die Diagnosestellung erleichtert.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pfister2002,
  author    = {Pfister, Heiko},
  title     = {Wegener'sche Granulomatose},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3133},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Die Wegener'sche Granulomatose (WG) ist eine Autoimmunerkrankung, die sich typischerweise als chronische Entz{\"u}ndung des oberen Respirationstraktes, Vaskulitis und Glomerulonephritis manifestiert. WG geh{\"o}rt zur Gruppe der sog. "pauci-immunen" Vaskulitiden, die mit Anti-Neutrophilen-Antik{\"o}rpern (ANCA, anti neutrophil cytoplasmic antibody) assoziiert sind. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz lassen sich ANCA im Serum der meisten WG-Patienten nachweisen. Die mit WG assoziierten sog. "klassischen" ANCA (c-ANCA) erkennen spezifisch Konformationsepitope der Serinprotease Proteinase 3 (PR3), die in den azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten gespeichert wird. Die enge Korrelation PR3-spezifischer Antik{\"o}rperspiegel mit dem Krankheitsverlauf l{\"a}ßt vermuten, daß sie bei der Pathogenese eine zentrale Rolle spielen k{\"o}nnten. Diese Hypothese wird von Daten aus in vitro Experimenten gest{\"u}tzt: werden Zytokin-stimulierte neutrophile Granulozyten mit Patientenserum oder isolierten c-ANCA inkubiert, erfolgt eine Aktivierung der Neutrophilen, die sich durch Degranulation und Freisetzung von Sauerstoffradikalen {\"a}ußert. c-ANCA k{\"o}nnen so indirekt - aber vermutlich auch direkt - zur Endothelsch{\"a}digung beitragen. Jedoch konnte bisher kein direkter Beweis des pathogenen Potentials von c-ANCA am Tiermodell erbracht werden. Um die Wirkung von c-ANCA an einem Mausmodell zu testen, war zun{\"a}chst ein murines Maus-PR3- (mPR3) spezifisches Antiserum notwendig. Da humane c-ANCA nicht mit mPR3 kreuzreagieren, wurde f{\"u}r die Immunisierung von PR3/Neutrophilen-Elastase (NE)-defizienten M{\"a}usen ein mPR3-Zymogen rekombinant in E. coli als Einschlußk{\"o}rpermaterial (IB, inclusion bodies) hergestellt. Nach Renaturierung des IB-Materials in vitro wurde mit der Dipeptidylaminopeptidase Cathepsin C das N-terminale Propeptid abgespalten. Das gewonnene Enzym besaß die f{\"u}r PR3 und NE spezifische katalytische Aktivit{\"a}t, die durch den physiologischen Inhibitor humaner PR3, a1-Antitrypsin, inhibiert werden konnte. Es ist daher anzunehmen, daß das gewonnene rekombinante Material die korrekte Konformation durch Renaturierung in vitro erhalten hatte. Um nun die pathologische Wirkung von Anti-rmPR3-Antik{\"o}rpern zu testen, wurden PR3/NE-defiziente M{\"a}use mit dem rekombinanten Zymogen (pro-rmPR3) oder der N-terminal prozessierten Form (rmPR3) immunisiert. Die Spezifit{\"a}t der gewonnenen Antiseren wurde durch Festphasenimmunoassay, Western Blotting und indirekte Immunfluoreszenzf{\"a}rbung {\"u}berpr{\"u}ft. Weiterhin konnte fluoreszenzzytometrisch die Bindung von Anti-mPR3-IgG an die Plasmamembran Zytokin-stimulierter Granulozyten nachgewiesen werden. Die hergestellten Antiseren erf{\"u}llten somit die f{\"u}r c-ANCA-positive Seren von WG-Patienten typischen Eigenschaften hinsichtlich der Antigenspezifit{\"a}t. Wenn c-ANCA alleine hinreichend f{\"u}r die Induktion der f{\"u}r WG charakteristischen Symptome sind, sollte der Antiserumtransfer auf Wildtyp-M{\"a}use WG-{\"a}hnliche Symptome in den Rezipienten hervorrufen. Nach wiederholter intraven{\"o}ser Injektion von Serum pro-rmPR3-immunisierter M{\"a}use ließ sich ein signifikanter Antik{\"o}rperspiegel bei Verd{\"u}nnungen von 1:2000 {\"u}ber den gesamten Behandlungszeitraum von 10 Wochen in den Rezipienten nachweisen. Der anschließende histologische Befund von Niere und Lunge ergab jedoch keine pathologischen Ver{\"a}nderungen. Dieses Ergebnis legt nahe, daß c-ANCA alleine keine Krankheitssymptome hervorrufen. In dem gegenw{\"a}rtigen Modell f{\"u}r c-ANCA-vermittelte Vaskulitis entfaltet sich die pathogene Wirkung von c-ANCA vor allem dann, wenn neutrophile Granulozyten zus{\"a}tzlich durch proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor alpha (TNF alpha) stimuliert werden. Erst die Stimulation der Granulozyten erm{\"o}glicht die Bindung von c-ANCA an die Plasmamembran und deren anschließende Aktivierung. Deshalb wurde dieses Modell, das vorwiegend aus Ergebnissen von Experimenten in vitro abgeleitet ist, auf ein lokales Entz{\"u}ndungsmodell der Maus {\"u}bertragen: Durch wiederholte Injektion von TNF alpha in die Haut wurde eine leichte Entz{\"u}ndungsreaktion ausgel{\"o}st. Diese Entz{\"u}ndungsreaktion ließ sich schließlich durch intraven{\"o}se Verabreichung von pro-rmPR3- oder rmPR3-Antiserum verst{\"a}rken. Dieser Befund ist ein wichtiger Beweis f{\"u}r die verbreitete Ansicht, daß c-ANCA nicht nur ein Epih{\"a}nomen der WG darstellen, sondern selbst ein pathogenes Potential besitzen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Serinproteasen NE und PR3 an der Entstehung inflammatorischer Prozesse untersucht. Im Hinblick auf die bei der Pathogenese der WG beteiligten Mechanismen k{\"o}nnten PR3 und NE eine wichtige Rolle spielen. PR3 und NE k{\"o}nnen Proteine der extrazellul{\"a}ren Matrix abbauen, Apoptose in Endothelzellen induzieren und sind an der Regulation entz{\"u}ndlicher Prozesse {\"u}ber verschiedene Wirkmechanismen beteiligt. Um quantitative Unterschiede bei Entz{\"u}ndungsreaktionen zwischen NE/PR3-defizienten M{\"a}usen und kongenen Wildtyp-Tieren zu untersuchen, wurde als Modell einer Typ III Hypersensitivit{\"a}tsreaktion eine lokale passive Arthus-Reaktion induziert. Wildtyp-M{\"a}use entwickelten dabei eine deutlich st{\"a}rkere lokale Entz{\"u}ndung als NE/PR3-defiziente M{\"a}use. Weitere Studien sind n{\"o}tig um die Frage zu kl{\"a}ren, ob eine der beiden Serinproteasen alleine oder in Kooperation mit der anderen diesen Ph{\"a}notyp hervorruft. F{\"u}r einen direkten synergistischen Effekt sprechen indes die Ergebnisse eines in vitro Experiments mit pro-rmPR3 und humaner NE: Bei Inkubation von pro-rmPR3 mit hNE wurde eine Spaltung des Proenzyms beobachtet, die mit einer Verst{\"a}rkung der enzymatischen Bruttoaktivit{\"a}t einherging. Die physiologische Relevanz dieser Beobachtung muß allerdings noch gekl{\"a}rt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stehen im Einklang mit den neuesten Erkenntnissen {\"u}ber die Rolle der PR3 bei der Wegener'schen Granulomatose: PR3 d{\"u}rfte sowohl aufgrund pleiotroper Effekte auf entz{\"u}ndliche Reaktionen als auch wegen seiner lytischen Eigenschaften zur Gewebesch{\"a}digung beitragen. Dar{\"u}berhinaus konnte eine pathogene Wirkung von mPR3-spezifischen Antik{\"o}rpern in der Maus nachgewiesen werden.},
  subject      = {Granuloma gangraenescens},
  language  = {de}
}