@phdthesis{Sauer2006,
  author    = {Sauer, Elizabeta},
  title     = {NAD+-Abh{\"a}ngigkeit bei Pasteurellaceae : Charakterisierung der Nikotinamid-Ribosid-Aufnahme bei Haemophilus influenzae},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22190},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Haemophilus influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium aus der Familie der Pasteurellacaea. Das physiologische Merkmal von H. influenzae ist die essentielle, aber defiziente H{\"a}min- und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) Biosynthese. W{\"a}hrend H{\"a}min f{\"u}r aerobes Wachstum ben{\"o}tigt wird, ist NAD+ sowohl f{\"u}r aerobes, als auch f{\"u}r anaerobes Wachstum essentiell. Als NAD+-abh{\"a}ngiger Organismus fehlen H. influenzae die meisten Enzyme f{\"u}r die NAD+-Biosynthese. Daher kann dieses Bakterium nur eine begrenzte Anzahl an Vorl{\"a}ufermolek{\"u}len, wie NAD+(P), Nikotinamid-Mono-Nukleotid (NMN) und Nikotinamid-Ribosid (NR) aus der Umwelt zur NAD+-Synthese nutzen. Andere NAD+-unabh{\"a}ngige Pasteurellacaea-Spezies, wie Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida und Actinobacillus actinomycetemcomitans, k{\"o}nnen auch kein NAD+ aus der de novo Biosynthese bereitstellen, diese Arten k{\"o}nnen aber zus{\"a}tzlich auf Nikotinamid (NAm) wachsen. Die Erforschung des NAD+-Aufnahmesystems kann f{\"u}r die Entwicklung antimikrobieller Therapeutika von großem Interesse sein. Von unserer Arbeitsgruppe wurde die NAD+-Aufnahmeroute aufgekl{\"a}rt; so werden NAD+(P) und NMN von e(P4) und NadN zu NR degradiert, nachdem NAD+ und NMN durch OmpP2 in das Periplasma gelangt sind. NR wird schließlich, als einziges Substrat, durch einen putativen Transporter in das Zytoplasma aufgenommen. In dieser Arbeit wurde der putative NR-Transporter als das hypothetische Gen HI1077.1 im Genom von H. influenzae identifiziert, welches nur 13,8\% Identit{\"a}t zu Escherichia coli pnuC und 43,6\% Identit{\"a}t zu P. multocida pnuC aufwies. Es konnten zwei Sequenzierungsfehler im original-annotierten Genom von H. influenzae gefunden werden, die zu einer Leserasterverschiebung gef{\"u}hrt haben. HI1077.1 wurde zu pnuCHi reannotiert und weist nun eine 19,7\% Identit{\"a}t zu pnuCEc und 71,4\% Identit{\"a}t zu pnuCPm auf. Es wurde eine HI1077.1 Mutante konstruiert, die ein Wachstumsdefizit auf BHI-Platten bis zu einer NAD+-Konzentration von 15 mM bzw. unterhalb einer NR-Konzentration von 0,1 mM zeigte. Im Transport-Assay transportierte die HI1077.1 Mutante nur noch etwa 1\% des eingesetzten NAD+- bzw. NR-Labels. Im Rattenversuch konnte gezeigt werden, dass das in vitro nicht essentielle pnuC in vivo sehr wohl essentiell ist. Die HI1077.1 Mutante verursachte, im Gegensatz zum Wildtyp und zur pnuC-Komplementante keine Bakteri{\"a}mie mehr. Bei einer Komplementation mit NadV, kodierend f{\"u}r eine Nikotinamid-Phosphoribosyltransferase von H. ducreyi, wurde ebenfalls eine mit dem Wildtyp vergleichende Bakteri{\"a}mie verursacht. Da bisher noch keine H. influenzae Isolate bekannt sind, die nadV besitzen, w{\"u}rde sich der hier identifizierte NR-Transporter von H. influenzae gut als antimikrobielles Ziel eignen. Die Protein-Topologie von PnuC wurde hinsichtlich der Membranlokalisation analysiert und PnuC konnte als ein Transmembranprotein best{\"a}tigt werden, das in der cytosolischen Membran lokalisiert ist. Durch PhoA und LacZ Analysen konnte die Topologie von PnuC aufgekl{\"a}rt werden. Demnach besitzt PnuC acht Transmembrandom{\"a}nen (TMD), wobei die N- und C-Termini im Cytosol lokalisiert sind. Die Analyse der strukturellen Funktion ergab, dass PnuC nur eine Unterbrechung der sechs letzten C-terminalen Aminos{\"a}uren (AS) toleriert, w{\"a}hrend die Proteinfunktion durch einen fusionierten C- und N-terminaler His-Tag nur m{\"a}sig beeinflusst wird. Des Weiteren wurde die Substratspezifit{\"a}t von PnuC untersucht. Dabei zeigte sich, dass der lange geglaubte NMN-Transporter von E. coli ebenfalls als NR-Transporter fungiert. Die Substratspezifit{\"a}t wurde auch bei A. actinomycetemcomitans und P. multocida untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass A. actinomycetemcomitans und P. multocida ebenfalls als einziges Substrat NR transportieren k{\"o}nnen, aber im Gegensatz zu H. influenzae NAD+ und NMN nicht als NR-Quellen verwerten k{\"o}nnen, was wahrscheinlich auf das Fehlen von e(P4) und NadN zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Zus{\"a}tzlich wurde in dieser Arbeit das Gen HI0308 untersucht. Um dem Aspekt der Energetisierung des PnuC-Transporters n{\"a}her zu kommen, sind die Gencluster HI1078-HI1080 und HI0164-HI0171 in die Untersuchung mit einbezogen worden. Die Na+-NQR-Oxidoreduktase wurde im Hinblick ihrer Dehydrogenase-Aktivit{\"a}t genauer charakterisiert. Die Suche nach m{\"o}glichen Inhibitoren von PnuC f{\"u}hrte zu 3-Aminopyridin-Analoga. Durch eine Mutantenanalyse konnte gezeigt werden, dass 3-AADP, 3-AAD und 3-AmPR der selben Aufnahmeroute folgen wie NADP+, NAD+ und NR, und via PnuC in die Zelle aufgenommen werden. Dar{\"u}ber hinaus konnten wir nachweisen, dass NadR aus 3-AmPR und ATP das 3-AAD synthetisiert, welches als kompetitiver Inhibitor mit NAD+ in den zellul{\"a}ren Redoxreaktionen konkurriert und dadurch den Stoffwechsel hemmt. Des Weiteren wurden mehrere spontan 3-Aminopyridin-resistente H. influenzae Mutanten isoliert.},
  subject      = {Haemophilus influenzae},
  language  = {de}
}