@phdthesis{Zinnitsch2010, author = {Zinnitsch, Sabrina}, title = {DNA-Strangbruchinduktion, Mikrokernbildung, Zellzyklusalteration und Apoptose durch Zahnwerkstoffe in humanen Lymphozyten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53835}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die Zahnwerkstoffe HEMA (Hydroxyethylmethacrylat) und TEGDMA (Triethylenglycol-dimethacrylat) geh{\"o}ren zu den so genannten Restmonomeren. Sie liegen nach der Polymerisation noch ungebunden vor und werden anschließend freigesetzt. Sie gelangen in den Organismus {\"u}ber die Pulpa, die Gingiva oder {\"u}ber den Speichel und k{\"o}nnen biologisch wirksam werden. Bisherige Studien zeigen dosisabh{\"a}ngige mutagene Effekte in tierischen und menschlichen Zellen. HEMA und TEGDMA f{\"u}hren zu DNA-Strangbr{\"u}chen, Mikrokernbildung, Apoptosen und nehmen Einfluss auf den Zellzyklus (G1- und G2-Verz{\"o}gerung). Ebenso wurden ein allergenes Potential und eine toxische Wirkung auf die Niere beschrieben. In dieser Arbeit wurden genotoxische Effekte von HEMA und TEGDMA in humanen Lymphozyten in Konzentrationsbereichen {\"u}berpr{\"u}ft, wie sie auch im K{\"o}rper auftreten k{\"o}nnen. Hierf{\"u}r wurden die Lymphozyten 24 Stunden mit 10 µM, 100 µM und 1 mM HEMA und mit 1 µM, 10 µM und 100 µM TEGDMA behandelt. Mit dem Comet Assay werden DNA-Einzel- und Doppelstrangbr{\"u}che sowie die Reparatur zuvor induzierter DNA-Sch{\"a}den erfasst. Durch die Modifikation des Comet Assay mit dem Fpg-Protein werden zus{\"a}tzlich oxidativ gesch{\"a}digte Basen mit hoher Sensitivit{\"a}t nachgewiesen. Der Mikrokerntest weist manifeste DNA-Sch{\"a}den auf DNA-Ebene in Form von Mikrokernen nach. Daneben lassen sich auch andere zellul{\"a}re Reaktionen wie Mitosen und Apoptosen sowie die Proliferationsrate der Zellen bestimmen. Der Chromosomen-aberrationstest dient zum Nachweis von Ver{\"a}nderungen in der Struktur und/oder in der Anzahl von Chromosomen eines Genoms. Mit dem Schwesterchromatidaustauschtest werden ebenfalls Chromosomenmutationen nachgewiesen. Durchflusszytometrische Methoden werden zum Nachweis von Apoptosen und zur Zellzyklusanalyse eingesetzt. Im herk{\"o}mmlichen Comet Assay zeigen HEMA und TEGDMA keine signifikante Wirkung auf die DNA (OTM < 2). Es kann aber gezeigt werden, dass die Behandlung mit Fpg zu einer Verdoppelung des OTM f{\"u}hrt. Bei 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA wird dadurch das OTM auf > 2 angehoben. HEMA und TEGDMA wirken sich nicht auf die Mikrokernbildung aus, jedoch wird durch den Mikrokerntest ab 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA eine Einflussnahme auf die Proliferation gezeigt. Die Rate fr{\"u}her (< 10\%) und sp{\"a}ter Apoptosen Apoptosen (< 4 \%) bleibt im Durchschnitt weitgehend konstant. Eine Ausnahme sind 1 mM HEMA, die die fr{\"u}hen Apoptosen auf > 10 \% anheben. Eine Einflussnahme auf den Zellzyklus, in Form einer Verz{\"o}gerung, {\"u}ben 1 mM HEMA in der S-Phase und 100 µM TEGDMA in der G1-Phase aus. In den Chromosomentests werden einerseits ein dosisabh{\"a}ngiger Anstieg der Aberrationen und andererseits vermehrte Chromatidaustausche beobachtet. In dieser Arbeit wird die Verbindung von HEMA und TEGDMA zu oxidativen Stress im Comet Assay mit Fpg gezeigt. Da die tats{\"a}chlich in vivo erreichbaren Konzentrationen unter 100 µM liegen, ist zu schließen, dass HEMA und TEGDMA in diesem niedrigen Konzentrationsbereich keine nachteiligen Effekte aus{\"u}ben, denn nur die hohen Konzentrationen (1 mM HEMA, 100 µM TEGDMA) sind in der Lage eine genotoxische Wirkung zu entfalten. Jedoch kann das Ausl{\"o}sen von Mutationen mit dem Chromosomenaberrationstest und Schwesterchromatidaustauschtest best{\"a}tigt werden. Um das Sch{\"a}digungsprofil dieser h{\"a}ufig eingesetzten Zahnwerkstoffe detaillierter beschreiben zu k{\"o}nnen, m{\"u}ssen Untersuchungen auf Chromatidebene intensiviert werden.}, subject = {Hydroxyethylmethacrylate}, language = {de} } @phdthesis{Wurster2014, author = {Wurster, Sebastian}, title = {Die Bedeutung von LIN9 f{\"u}r die Regulation der Genexpression, die genomische Stabilit{\"a}t und die Tumorsuppression}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-114967}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Pocket proteins and E2F transcription factors regulate the expression of cell cycle associated genes and play a central role in the coordination of cell division, differentiation, and apoptosis. Disorders of these pathways contribute to the development of various human tumor entities. Despite intensive research in the field of cell cycle regulation many details are not yet understood. The LIN complex (LINC / DREAM) is a recently discovered human multiprotein complex, which dynamically interacts with pocket proteins and E2F transcription factors. An essential component of the LIN complex is the LIN9 protein. In order to obtain a better insight into the function of this protein in cell cycle regulation and tumorigenesis, a conditional Lin9 knockout mouse model was established in our laboratory. The primary objective of this study was the phenotypic characterization of embryonic fibroblasts (MEFs) from these mice. Shortly after inactivation of Lin9 cell proliferation was massively impaired. Multiple types of mitotic defects such as structural abnormalities of the spindle apparatus, aberrant nuclei, failed nuclear segregation and cytokinesis failure have been observed in Lin9-depleted cells leading to a dramatic increase in polyploid and aneuploid cells. Ultimately these serious aberrations result in premature cellular senescence. If the senescence of Lin9-deficient cells is overcome by the Large T antigen the cells can adhere to the loss of Lin9, but show severe genomic instability and grow anchorage-independently in soft-agar as a sign of oncogenic transformation. In the second part of the thesis the gene expression of Lin9-deficient cells was assessed by quantitative real time PCR analyses to determine, whether the mitotic abnormalities are caused by transcriptional defects. Here a significant reduction of mitotic gene expression was observed in Lin9-depleted cells. Additionally chromatin immunoprecipitation experiments were performed to clarify the underlying molecular mechanisms. Compared to control cells epigenetic alterations at the promoters of mitotic target genes with regard to activating histone modifications were found in Lin9-deficient MEFs. In the last section of this study, the effects of Lin9 heterozygosity were analyzed. Lin9 heterozygous MEFs showed normal proliferation, although expression of different mitotic genes was slightly reduced. It appeared, however, that the mitotic spindle checkpoint of Lin9 heterozygous MEFs is weakened and thus over several cell generations an increase in polyploid cells was observed. Soft-agar assays showed that Lin9 heterozygosity contributes to oncogenic transformation. Taken together, these results document a crucial role of LIN9 in the regulation of cell cycle-associated gene expression. LIN9 is an essential factor for cell proliferation on one hand, while at the same time it functions as a tumor suppressor.}, subject = {Zellzyklus}, language = {de} } @phdthesis{Wolter2015, author = {Wolter, Patrick}, title = {Characterization of the mitotic localization and function of the novel DREAM target GAS2L3 and Mitotic kinesins are regulated by the DREAM complex, often up-regulated in cancer cells, and are potential targets for anti-cancer therapy}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-122531}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {The recently discovered human DREAM complex (for DP, RB-like, E2F and MuvB complex) is a chromatin-associated pocket protein complex involved in cell cycle- dependent gene expression. DREAM consists of five core subunits and forms a complex either with the pocket protein p130 and the transcription factor E2F4 to repress gene expression or with the transcription factors B-MYB and FOXM1 to promote gene expression. Gas2l3 was recently identified by our group as a novel DREAM target gene. Subsequent characterization in human cell lines revealed that GAS2L3 is a microtubule and F-actin cross-linking protein, expressed in G2/M, plays a role in cytokinesis, and is important for chromosomal stability. The aim of the first part of the study was to analyze how expression of GAS2L3 is regulated by DREAM and to provide a better understanding of the function of GAS2L3 in mitosis and cytokinesis. ChIP assays revealed that the repressive and the activating form of DREAM bind to the GAS2L3 promoter. RNA interference (RNAi) mediated GAS2L3 depletion demonstrated the requirement of GAS2L3 for proper cleavage furrow ingression in cytokinesis. Immunofluorescence-based localization studies showed a localization of GAS2L3 at the mitotic spindle in mitosis and at the midbody in cytokinesis. Additional experiments demonstrated that the GAS2L3 GAR domain, a putative microtubule- binding domain, is responsible for GAS2L3 localization to the constriction zones in cytokinesis suggesting a function for GAS2L3 in the abscission process. DREAM is known to promote G2/M gene expression. DREAM target genes include several mitotic kinesins and mitotic microtubule-associated proteins (mitotic MAPs). However, it is not clear to what extent DREAM regulates mitotic kinesins and MAPs, so far. Furthermore, a comprehensive study of mitotic kinesin expression in cancer cell lines is still missing. Therefore, the second major aim of the thesis was to characterize the regulation of mitotic kinesins and MAPs by DREAM, to investigate the expression of mitotic kinesins in cancer cell line panels and to evaluate them as possible anti-cancer targets. ChIP assays together with RNAi mediated DREAM subunit depletion experiments demonstrated that DREAM is a master regulator of mitotic kinesins. Furthermore, expression analyses in a panel of breast and lung cancer cell lines revealed that mitotic kinesins are up-regulated in the majority of cancer cell lines in contrast to non-transformed controls. Finally, an inducible lentiviral-based shRNA system was developed to effectively deplete mitotic kinesins. Depletion of selected mitotic kinesins resulted in cytokinesis failures and strong anti-proliferative effects in several human cancer cell lines. Thus, this system will provide a robust tool for future investigation of mitotic kinesin function in cancer cells.}, subject = {Zellzyklus}, language = {en} } @phdthesis{Wickert2006, author = {Wickert, Thomas}, title = {In vitro-Studien zur Biofunktionalit{\"a}t von Betanin und Indicaxanthin sowie von Extrakten aus der Kaktusfeige (Opuntia ficus indica)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19881}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Im Fokus dieser Studien standen mit Indicaxanthin und Betanin die beiden wichtigsten Vertreter der Betalaine sowie Kaktusfeigen- (Opuntia ficus indica) Extrakt. Die Durchf{\"u}hrung der Studien erfolgte in folgenden Schritten: - Isolierung der Referenzsubstanzen Betanin und Indicaxanthin sowie Herstellung von Kaktusfeigen-Extrakt und daraus gewonnener Fraktionen, - Untersuchung der Cytotoxizit{\"a}t von Betanin, Indicaxanthin und Kaktusfeigen-Extrakt in humanen permanent Zell-Linien, - Beeinflussung der Apoptose und des Zellzyklus durch Betanin, Indicaxanthin und Kaktusfeigen-Extrakt in humanen permanent Zell-Linien, - Beeinflussung von Enzymen des Fremdstoffmetabolismus durch Betanin, Indica-xanthin und Kaktusfeigen-Extrakt in humanen permanent Zell-Linien. Die Gewinnung von Indicaxanthin (aus Kaktusfeigen), Betanin (aus Rote Beete-Konzentrat) sowie Kaktusfeigen-Extrakt erfolgte anhand literaturbekannter Methoden. Zur Bestimung der Cytotoxizit{\"a}t wurde untersucht, ob die Testsubstanzen die Proliferation von Caco2-, HT29- und HepG2-Zellen hemmen k{\"o}nnen. Als Ergebnis wurden EC50-Werte f{\"u}r die antiproliferative Wirkung von Betanin in Caco2-Zellen sowie f{\"u}r Kaktusfeigen-Extrakt in Caco2-, HT29- und HepG2-Zellen gefunden. Ein Einfluss der Testsubstanzen auf den Zellzyklus von Caco2- und HT29-Zellen wurde nicht beobachtet. Weiterhin induzierten die Testsubstanzen keine Apoptose in Caco2- oder HT29-Zellen. In den Studien zum Fremdstoffmetabolismus wurde beobachtet, dass vor allem Kaktusfeigen-Extrakt den Substratumsatz von Phase II-Enzyme wie UDP-Glucuronosyltransferase und Glutathion-S-Transferase steigern kann.}, subject = {Betalaine}, language = {de} } @phdthesis{vonPapen2019, author = {von Papen, Hans Michael}, title = {Untersuchungen zum Einfluss der Meningokokkeninfektion auf den Zellzyklus von Epithelzellen}, doi = {10.25972/OPUS-19286}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-192862}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {Zahlreiche humanpathogene bakterielle Erreger k{\"o}nnen ihre F{\"a}higkeit zur Kolonisation epithelialer Barrieren optimieren, indem sie mit dem Zellzyklus der infizierten Wirtszelle in Wechselwirkung treten und so die Abschilferung und Erneuerung des Epithels verz{\"o}gern. Die hierbei wirksamen bakteriellen Effektoren sind als „Cyclomoduline" bekannt und gelten als neue Klasse bakterieller Pathogenit{\"a}tsfaktoren. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war es zu untersuchen, ob durch die Infektion menschlicher pharyngealer Epithelzellen mit N. meningitidis der Zellzyklus der Wirtszelle beeinflusst wird. Mit zwei verschiedenen Untersuchungsmethoden konnte {\"u}bereinstimmend gezeigt werden, dass die Infektion der Epithelzelllinie Detroit 562 mit verschiedenen Meningokokkenisolaten zu einer signifikanten Akkumulation von Epithelzellen in der G1-Phase f{\"u}hrte. Dieser Effekt wurde sowohl von pathogenen Meningokokkenst{\"a}mmen als auch von Tr{\"a}gerst{\"a}mmen ausgel{\"o}st, jedoch nur durch Isolate, die f{\"a}hig zur Adh{\"a}renz und zur Invasion in die Epithelzelle waren. Durch Hitzebehandlung der Bakterien konnte der Zellzyklusarrest vollst{\"a}ndig aufgehoben werden. Ebenso konnte der Effekt durch Inkubation der Epithelzellen mit bakteriellen Kultur{\"u}berst{\"a}nden und durch Infektion der Zellen mit E. coli-St{\"a}mmen, welche die Meningokokkenadh{\"a}sine Opa und Opc {\"u}berexprimieren, nicht ausgel{\"o}st werden. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die Infektion mit N. meningitidis in der Zielzelle zu einer signifikant gesteigerten Expression des CDK-Inhibitors p21WAF1/Cip1 f{\"u}hrte, begleitet von einer vermehrten Lokalisation im Zellkern. Auch zeigte sich eine ver{\"a}nderte Proteinexpression der f{\"u}r die G1-Phase relevanten Cycline D und E. Diese scheint sich erst posttranslational zu ereignen, da die unterschiedliche Expression auf mRNA-Ebene nicht festgestellt werden konnte. Zusammenfassend konnte dargestellt werden, dass die Infektion von Pharynxepithelzellen mit lebenden, zur Adh{\"a}renz und Invasion f{\"a}higen Meningokokkenst{\"a}mmen in der menschlichen Zielzelle einen Zellzyklusarrest in der G1-Phase verursacht, vermutlich durch ver{\"a}nderte Expression der Zellzyklusregulatoren p21WAF1/Cip1, Cyclin D und Cyclin E. M{\"o}glicherweise stellt die Induktion dieses Zellzyklusarrestes einen wichtigen Schritt in der Pathogenese der bakteriellen Kolonisation des oberen Atemwegsepithels durch N. meningitidis dar.}, subject = {Neisseria meningitidis}, language = {de} } @phdthesis{Staykov2012, author = {Staykov, Nikola}, title = {The Role of the GABPα/β Transcription Factor In the Proliferation of NIH-3T3 Cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67655}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {SUMMARY GABP is a heterodymeric member of Ets-family transcription factors. It consists of two subunits - GABPa which contains DNA binding domain and GABPb, which provides transcriptional activation domain and nuclear localization signal. GABPa/b complex is essential for transcriptional activation of multiple lineage-restricted and housekeeping genes, several viral genes, and in some cases might function as transcriptional repressor. Large variety of data indicates involvement of GABP in the complex regulation of cell growth, specified by quiescence, stimulation/proliferation, apoptosis and senescence. Expression level of GABPa subunit is rapidly increased when resting cells enter S-phase, and GABPa/b complex is critical to promote the continuity of the cell cycle. Conditional inactivation of GABPa expression in mouse embryonic fibroblasts results in a complete block of proliferation and acquisition of senescence-like phenotype. However, the influence of GABP on the other cell growth determinant - the apoptosis - remains largely obscure. Therefore we aimed to investigate the influence of GABPa/b expression level on the cell growth in vitro. Using siRNA approach we achieved efficient but only transient down-regulation of GABPa expression which precluded further cell growth studies. Persistent increase of the expression of GABPb subunit only resulted in a positive effect on the cell growth speed. Simultaneous conditional overexpression of both GABPa and GABPb subunits though, strongly reduced the growth of the affected cell cultures in reversible and in expression level dependent manner. Interestingly, GABPa/b overexpressing cells did show neither cell cycle arrest nor massive induction of apoptosis. However, more detailed analyses revealed that dampened apoptotic processes were taking place in GABPa/b-overexpressing cells, starting with a prominent activation of caspase-12. Interestingly, activation of downstream effector caspases was rather suppressed explaining a weak increase of apoptotic cells in GABPa/b overexpressing cultures. This effect suggests that the activation of caspase-12 by elevated amounts of exogenous GABPa/b reflects the normal physiological mechanism of caspase-12 regulation.}, subject = {Proliferation}, language = {en} } @phdthesis{Semmel2005, author = {Semmel, Britta Birgit}, title = {Gentoxizit{\"a}t durch hormonell stimulierte Proliferation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18714}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Hormone spielen bei der Kanzerogenese eine wichtige Rolle, indem sie vor allem auf die Phase der Promotion einwirken und die Proliferation bereits initiierter Zellen steigern k{\"o}nnen. In dieser Arbeit wurden humane Ovarialkarzinomzellen mit {\"O}strogen, Insulin, IGF und EGF zur Proliferation angeregt, woraus eine erh{\"o}hte Mikrokernrate resultierte. Mikrokerne sind chromatinhaltige Strukturen, die außerhalb des Zellkerns liegen. Somit lag nahe, dass durch die Steigerung der Proliferation eine genetische Instabilt{\"a}t erzeugt wurde. Weitere Experimente zeigten eine Forcierung der genetisch gesch{\"a}digten Zellen durch den Zellzyklus, so dass vermutet werden kann, dass schnell proliferierende Zellen durch Verringerung der zellul{\"a}ren Reparaturmechanismen eine erh{\"o}hte Rate an genetischer Instabilit{\"a}t aufweisen. Unterst{\"u}tzt wird diese Hypothese durch Analyse diverser Zellzyklusregulationsproteine mittel Wester-Blot.}, language = {de} } @phdthesis{Schweinfurth2019, author = {Schweinfurth, Philipp}, title = {Der Einfluss von bub1b und p53 auf den Zellzyklus sowie die Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber Docetaxel - Untersuchungen am Mausmodell und an murinen embryonalen Fibroblasten}, doi = {10.25972/OPUS-18251}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-182511}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {Chemotherapeutika, deren Wirkung am MSC von Zellen ansetzen, geh{\"o}ren zum Standardrepertoire der onkologischen Therapie in zahlreichen Malignomen. In der Uroonkologie hat insbesondere das Erstarken von Docetaxel-basierten Therapien im metastasierten Prostatakarzinom den Fokus erneut auf den MSC gerichtet. Diesbez{\"u}glich wurden aber sowohl sch{\"u}tzende, als auch tumortreibende Teilfunktionen des MSCs in verschiedenen Tumorentit{\"a}ten gezeigt und pleiotrope Effekte einzelner Gene des MSCs n{\"a}her untersucht. Die vorliegende Arbeit untersucht daher eine m{\"o}gliche Rolle von bub1b in der Tumorentstehung und in der Modulation der Ansprechbarkeit gegen{\"u}ber Docetaxel. Da die Heterozygotie im Gen bub1b in den existierenden Mausmodellen jedoch nur zu alters-assoziierten Tumorerkrankungen f{\"u}hrt, wurden in Rahmen dieser Arbeit bub1b heterozygote Tiere mit p53 defizienten Tieren verpaart. Eben diese Tiere wurden hinsichtlich ihres {\"U}berlebens sowie der Art der aufgetretenen Tumorentit{\"a}ten untersucht. Zus{\"a}tzlich wurden Proliferations- und Zellzyklusanalysen insbesondere unter Docetaxelstress an MEFs, die aus diesem Mausmodell gewonnen wurden, durchgef{\"u}hrt. In Sektionsstudien des Mausmodells wurde gezeigt, dass bei gleichzeitigem Vorliegen von Heterozygotie von bub1b und Homozygotie von p53 eine Verschiebung des Tumor- Ph{\"a}notyps der p53 defizienten Tiere (Sarkome und Lymphome) erfolgte. Tiere des Genotyps bub1b het / p53 hom wiesen einen signifikant geringeren Anteil von Sarkomen im Vergleich zu den Lymphomen auf. Zus{\"a}tzlich nahm bei den Lymphomen der Anteil von disseminierten Lymphomen gegen{\"u}ber den thymoidalen Lymphomen zu. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass eine Heterozygotie f{\"u}r bub1b die Entwicklung bestimmter Tumorentit{\"a}ten (disseminierte Lymphome) beg{\"u}nstigt, w{\"a}hrend andere Tumorentit{\"a}ten (z.B. Sarkome) durch den Verlust eines bub1b Allels eher verhindert werden. Die molekularen Ursachen f{\"u}r diesen Befund sind zurzeit noch unklar. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde unter Verwendung von Zellkulturen muriner embryonaler Fibroblasten (MEFs), die mittels des vorhandenen Mausmodells etabliert wurden, gezeigt, dass MEFs der Genotypen bub1b wt / p53 hom, wie auch bub1b het / p53 hom im Vergleich zur Kontrollgruppe normal proliferieren und einen weitgehend normalen Zellzyklus aufweisen. Die zytostatische Wirkung des „Spindelcheckpoint Aktivators" Docetaxel ist in MEFs mit einer Heterozygotie f{\"u}r bub1b reduziert, w{\"a}hrend MEFs der Genotypen bub1b wt / p53 hom, wie auch bub1b het / p53 hom sensitiver auf Docetaxel reagieren. Aus diesen Ergebnissen kann eine geringe Effektivit{\"a}t von Docetaxel als zytostatisches Therapeutikum in der Tumortherapie von bub1b heterozygoten Zellen abgeleitet werden. Bei gleichzeitigen Defekten im Gen p53 k{\"o}nnten sich bub1b heterozygote Zellen allerdings sensitiv gegen{\"u}ber einer Therapie verhalten. In MEFs aller drei Genotypen konnte zudem gezeigt werden, dass die Aktivierung des MSCs durch Docetaxel unvollst{\"a}ndig bzw. defekt ist. Dieser Defekt im MSC f{\"u}hrt, wie bereits erw{\"a}hnt, zu einem starken zytostatischen Effekt, aber auch zu einer signifikanten Steigerung der Anzahl und zur Persistenz von polyploiden Zellen in den Zellkulturen der MEFs mit dem Genotyp bub1b het / p53 hom. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass eine Defizienz f{\"u}r p53 und eine Heterozygotie f{\"u}r bub1b einen additiven Effekt in der Entwicklung von polyploiden Zellen besitzen und somit die Entwicklung von Tumorvorstufen beg{\"u}nstigen. Ob diese Effekte auch in nativen Tumoren unter Docetaxel-Behandlung eine Rolle spielen und sich bub1b und p53 als m{\"o}gliche Pr{\"a}diktoren einer Docetaxel-Therapie im Menschen evaluieren lassen, m{\"u}ssten weiterf{\"u}hrende Analysen zeigen, die den Verlauf einer Tumortherapie mit Hilfe eines Spindelgiftes abbilden.}, subject = {Docetaxel}, language = {de} } @phdthesis{Schmitt2010, author = {Schmitt, Kathrin}, title = {Identification and Characterization of GAS2L3 as a Novel Mitotic Regulator in Human Cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52704}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Precise control of mitotic progression is vital for the maintenance of genomic integrity. Since the loss of genomic integrity is known to promote tumorigenesis, the identification of knew G2/M regulatory genes attracts great attention. LINC, a human multiprotein complex, is a transcriptional activator of a set of G2/M specific genes. By depleting LIN9 in MEFs, a core subunit of LINC, Gas2l3 was identified as a novel LINC target gene. The so far uncharacterized Gas2l3 gene encodes for a member of the family of growth arrest specific 2 (GAS2) proteins, which share a highly conserved putative actin binding CH and a putative microtubule binding GAS2 domain. In the present study GAS2L3 was identified as a LINC target gene also in human cells. Gene expression analysis revealed that GAS2L3 transcription, in contrast to all other GAS2 family members, is highly regulated during the cell cycle with highest expression in G2/M. The GAS2L3 protein showed a specific localization pattern during the M phase: In metaphase, GAS2L3 localized to the mitotic spindle, relocated to the spindle midzone microtubules in late anaphase and concentrated at the midbody in telophase where it persisted until the end of cytokinesis. Overexpression of a set of different GAS2L3 deletion mutants demonstrated that the localization to the mitotic microtubule network is dependent on the C-terminus, whereas the midbody localization is dependent on full length GAS2L3 protein. Additionally, exclusive overexpression of the CH domain induced the formation of actin stress fibers, suggesting that the CH domain is an actin binding domain. In contrast, the GAS2 domain was neither needed nor sufficient for microtubule binding, indicating that there must be an additional so far unknown microtubule binding domain in the C-terminus. Interestingly, immunoblot analysis also identified the C-terminus as the domain responsible for GAS2L3 protein instability, partially dependent on proteasomal degradation. Consistent with its specific localization pattern, GAS2L3 depletion by RNAi demonstrated its responsibility for proper mitosis and cytokinesis. GAS2L3 depletion in HeLa cells resulted in the accumulation of multinucleated cells, an indicator for chromosome mis-segregation during mitosis. Also the amount of cells in cytokinesis was enriched, indicating failures in completing the last step of cytokinesis, the abscission. Strikingly, treatment with microtubule poisons that lead to the activation of the spindle assembly checkpoint (SAC) indicated that the SAC was weakened in GAS2L3 depleted cells. Although the exact molecular mechanism is still unknown, fist experiments support the hypothesis that GAS2L3 might be a regulator of the SAC master kinase BUBR1. In conclusion, this study provides first evidence for GAS2L3 as a novel regulator of mitosis and cytokinesis and it might therefore be an important guardian against tumorigenesis.}, subject = {Mensch}, language = {en} } @phdthesis{Schmit2008, author = {Schmit, Fabienne}, title = {LINC, a novel protein complex involved in the regulation of G2/M genes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29336}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Regulated progression through the cell cycle is essential for ordered cell proliferation. One of the best characterized tumor suppressors is the retinoblastoma protein pRB, which together with the E2F transcription factors regulates cell cycle progression. In the model organisms Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans, RB/E2F containing multiprotein complexes have been described as transcriptional regulators of gene expression. This work first describes a homologous complex in human cells named LINC (for LIN complex). It consists of a stable core complex containing LIN-9, LIN-37, LIN-52, LIN-54 and RbAp48. This core complex interacts cell cycle-dependently with different pocket proteins and transcription factors. In quiescent cells, LINC associates with p130 and E2F4. In S-phase cells these interactions are lost and LINC binds to B-MYB and p107. The transient knock-down of LIN-54 in primary fibroblasts, as the depletion of LIN-9, leads to cell cycle defects. The cells are delayed before the entry into mitosis. This effect is due to the fact that the knock-down of LINC components leads to the downregulation of cell cycle genes responsible for the entry into and exit from mitosis as well as for checkpoints during mitosis. These LINC target genes are known E2F G2/M target genes, which are expressed later than the classical G1/S E2F target genes. The transcriptional regulation by LINC is a direct effect as LINC binds to the promoters of its target genes throughout the cell cycle. LINC contains three DNA-binding proteins. E2F4 and B-MYB, which cell cycle-dependently bind to LINC, are known DNA-binding transcription factors. Additionally, it is show here that the LINC core complex member LIN-54 also directly binds to the promoter of a LINC target gene. Although the exact molecular mechanism of LINC function needs to be analyzed further, data in this work provide a model for the delayed activation of G2/M target genes. B-MYB, a G1/S E2F target gene, binds to LINC upon its expression in S-phase. Then only LINC is a transcriptional activator that induces the expression of the G2/M genes. This provides an explanation for the delayed expression of these E2F G2/M target genes.}, subject = {Zellzyklus}, language = {en} } @phdthesis{Reichert2008, author = {Reichert, Nina}, title = {The Role of LIN9 in Mouse Development}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-30889}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {LINC, the human homologue of an evolutionary conserved complex, regulates the transcription of a set of genes essential during the G2/M transition (Osterloh et al., 2007; Schmit et al., 2007). One component of the LINC core module is LIN-9. LIN-9 is essential for the transcriptional activation of LINC target genes and also promotes differentiation in association with pRB (Gagrica et al., 2004). However, nothing is known about its function in vivo. Histological and molecular analysis revealed that Lin9 is ubiquitously expressed throughout embryonic development and in all examined adult organs. Additionally, Lin9 mRNA is expressed in ES cells and blastocysts. Moreover the analogous distribution of the other LINC components suggested that they all function in the same cells and most likely in the same pathway. To deeper investigate the role of LIN9 in cell cycle and differentiation in vivo, a Lin9 gene trap mouse model (GT) was successfully generated and examined. Heterozygouse Lin9GT/+ mice were inconspicuous and develop normally. However, homozygouse knockout embryos were never obtained. The Lin9GT/GT embryos die at peri-implantation, probably due to a defect in the development of the epiblast, which could be shown with in situ hybridization with specific lineage markers. In vitro, the ICM of Lin9-deficient blastocysts did not develop properly. These data suggest that the loss of Lin9 leads to embryonic lethality at peri-implantation, and indicates that LIN9 is required for proper formation of the epiblast. In parallel, the first conditional Lin9 mouse model based on the Cre-loxP technology was generated. The Lin9fl/fl allele can be deleted by Cre-recombinase, in vivo and in vitro. Therefore an inducible system with Lin9fl/fl mice harboring Cre-ERT2 was established. The MEFs generated from these transgenic mice carried a nearly complete knockout upon induction with tamoxifen. Deletion of LIN9 in MEFs had a major impact upon the cell cycle and growth rates. Specifically, they arrested in G2/M phase and stopped to proliferate. Taken together, I was able to generate a lin9 gene trap and a lin9 conditional knockout mouse model. All results obtained so far demonstrate, that Lin9 is an essential gene for embryonic development and cell cycle control. It will be of great interest to further investigate Lin9-deficiency to gain insights into the mechanism of cell cycle control in early embryonic development and cell differentiation.}, subject = {Zellzyklus}, language = {en} } @phdthesis{Osterloh2007, author = {Osterloh, Lisa}, title = {Identifizierung und Charakterisierung LIN-9 regulierter Gene im humanen System - Die Rolle von LIN-9 in der Regulation des Zellzyklus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24360}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Das humane LIN-9 wurde zuerst als pRB-interagierendes Protein beschrieben und spielt eine Rolle als Tumorsuppressor im Kontext des pRB-Signalweges. {\"U}ber die molekulare Funktion von LIN-9 ist jedoch wenig bekannt. Die Homologe von LIN-9 in D. melanogaster und in C. elegans, sind an der transkriptionellen Regulation verschiedener Genen beteiligt. Dies und die Tatsache, dass LIN-9 mit pRB in der Aktivierung differenzierungspezifischer Gene kooperiert, ließ vermuten, dass humanes LIN-9 einen bedeutenden Einfluss auf die transkriptionelle Regulation von Genen haben k{\"o}nnte. Prim{\"a}res Ziel dieser Arbeit war daher die Identifizierung LIN-9 regulierter Gene. Dazu sollte mit Hilfe von cDNA-Microarray Analysen, das Genexpressionsprofil LIN-9 depletierter prim{\"a}rer humaner Fibroblasten (BJ ET Zellen) im Vergleich zu Kontrollzellen untersucht werden. Hierf{\"u}r wurde zun{\"a}chst ein RNAi-basierendes System etabliert, um die posttranskriptionelle Expression von LIN-9 in BJ-ET Zellen effizient zu reprimieren. Auf dem Ergebnis der cDNA-Microarray Analysen aufbauende Untersuchungen sollten Aufschluss {\"u}ber die molekularbiologische Funktion von LIN-9 geben. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der Verlust von LIN-9 zu einer verminderten Expression einer Gruppe G2/M-spezifischer Gene f{\"u}hrt, deren Produkte f{\"u}r den Eintritt in die Mitose ben{\"o}tigt werden. Bekannt war, dass ein Teil dieser Gene durch den Transkriptionsfaktor B-MYB koreguliert wird. Zudem konnten Untersuchungen in unserem Labor eine Interaktion von LIN-9 und B-MYB auf Proteinebene, sowie die Bindung beider Proteine an die Promotoren der LIN-9 regulierten G2/M-Gene nachweisen. Dies l{\"a}sst vermuten, dass LIN-9 und B-MYB gemeinsam die Expression der G2/M-Gene kontrollieren. Die verminderte Expression von G2/M-Genen in LIN-9 bzw. B-MYB depletierten Zellen geht mit einer Reihe ph{\"a}notypischer Ver{\"a}nderungen einher, wie einer deutlich verlangsamten Proliferation und einer Akkumulation der Zellen in der G2/M-Phase. Mit Hilfe eines Durchflusszytometers erstellte Zellzykluskinetiken ergaben, dass die Progression LIN-9 bzw. B-MYB depletierter Fibroblasten von der S-Phase durch die G2/M-Phase und in die n{\"a}chste G1-Phase deutlich verz{\"o}gert ist. Es konnte weder ein Arrest dieser Zellen in der Mitose noch eine ver{\"a}nderte L{\"a}nge der S-Phase nach LIN-9 oder B-MYB Depletion festgestellt werden. Daher ist die verlangsamte Zellzyklusprogression nach LIN-9 bzw. B-MYB Verlust h{\"o}chstwahrscheinlich auf einen Defekt in der sp{\"a}ten G2-Phase zur{\"u}ckzuf{\"u}hren, welcher in einem verz{\"o}gerten Eintritt in die Mitose resultiert. In D. melanogaster und in C. elegans sind die Homologe von LIN-9 und B-MYB zusammen, als Bestandteile hoch konservierter RB/E2F-Komplexe, an der Regulation von Genen entscheidend beteiligt. Daher liegt es nahe, dass im humanen System LIN-9 und B MYB ebenfalls Bestandteile eines {\"a}hnlichen Komplexes sind und dadurch die Aktivierung der LIN 9 abh{\"a}ngigen G2/M-Gene vermitteln. Die Tatsache, dass LIN-9 sowohl als Tumorsuppressor, als auch als positiver Regulator des Zellzyklus fungiert, l{\"a}sst vermuten, dass LIN-9 zu einer stetig gr{\"o}ßer werdenden Gruppe von Proteinen geh{\"o}rt, welche in Abh{\"a}ngigkeit vom zellul{\"a}ren und genetischen Kontext sowohl tumorsuppressive als auch onkogene Funktionen besitzen.}, subject = {Zellzyklus}, language = {de} } @phdthesis{Neveling2007, author = {Neveling, Kornelia}, title = {Molecular causes and consequences of genetic instability with respect to the FA/BRCA Caretaker Pathway}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27383}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {In the context of this thesis, I investigated the molecular causes and functional consequences of genetic instability using a human inherited disease, Fanconi anemia. FA patients display a highly variable clinical phenotype, including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and a high cancer risk. The FA cellular phenotype is characterized by spontaneous and inducible chromosomal instability, and a typical S/G2 phase arrest after exposure to DNA-damaging agents. So far, 13 genes have been identified, whose biallelic (or, in the case of X-linked FANCB, hemizygous) mutations cause this multisystem disorder. The FA proteins interact in a multiprotein network, instrumental and essential in the cellular response to DNA damage. A more comprehensive summary of Fanconi anemia and its myriad clinical, cellular and molecular manifestations is provided in the introduction section of this thesis. The results of my experimental work are presented as published papers and manuscripts ready to be submitted. In the first publication, I investigated the connection between FA genes and bladder tumors. The question I tried to answer was whether a disruption of the FA/BRCA pathway may be a frequent and possibly causal event in bladder cancer, explaining the hypersensitivity of these cells to DNA-crosslinking agents. On the basis of my experimental data I arrived at the conclusion that disruption of the FA/BRCA pathway might be detrimental rather than advantageous for the majority tumor types by rendering them vulnerable towards DNA damaging agents and oxidative stress. The second publication deals with the gene coding for the core complex protein FANCE and tries to answer the question why FANCE is so rarely affected among FA-patients. The conclusion from these studies is that like FANCF, FANCE functions as a probable adaptor protein with a high tolerance towards amino acid substitutions which would explain the relative rareness of FA-E patients. I have also investigated the FANCL gene whose product functions as the catalytic subunit of the E3 ligase. The third publication addresses this issue by providing the first comprehensive description of genetic alterations and phenotypic manifestations in a series of three FA-L patients. The results of my study show that genetic alterations of FANCL are compatible with survival, these alterations may include large deletions such as so far common only in the FANCA gene, FA-L phenotypes can be mild to severe, and FANCL belongs to the group of FA genes that may undergo somatic reversion. The central protein of the FA/BRCA network, FANCD2, is the subject of the fourth publication presented in this thesis. Most importantly, we were able to show that there are no biallelic null mutations in FANCD2. Correspondingly, residual protein of both FANCD2-isotypes (FANCD2-S and FANCD2-L) was present in all available patient cell lines. This suggests that complete abrogation of the FANCD2 protein cannot be tolerated and causes early embryonic lethality. There are at least three FA proteins that are not required for the posttranslational modification of FANCD2. One of these proteins is the 5'-3' helicase BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), a protein that interacts directly with the breast cancer susceptibility protein BRCA1. I participated in the identification of BRIP1 as the FA protein FANCJ. This discovery is described in the fifth publication of this thesis. The newly discovered protein BRIP1/FANCJ seems to act as one of the mediators of genomic maintenance downstream of FANCD2. Another protein identified downstream of FANCD2 is PALB2. PALB2 was originally discovered as "partner and localizer of BRCA2". In a candidate gene approach we tested patients with early childhood cancers but without mutations in BRCA2 for mutations in PALB2 (publication 6). PALB2 was identified as a novel FA gene and designated FANCN. FA-N patients are very severely affected. The last publication included in my thesis describes the identification of the FA gene FANCI as the second monoubiquitinated member of the FA/BRCA pathway (publication 7). We identified biallelic mutations in KIAA1794 in four FA patients, thus proving the genuine FA-nature of this candidate sequence. The general discussion provides a synopsis of the results and conclusions of my work with the state of art of FA research.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {en} } @phdthesis{Mannefeld2009, author = {Mannefeld, Mirijam}, title = {Role of the human LIN complex in DNA damage induced regulation of gene expression}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39261}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {In jeder menschlichen Zelle entstehen t{\"a}glich ca. 10.000 - 150.000 endogene DNA Sch{\"a}den. Eine Anh{\"a}ufung dieser L{\"a}sionen kann zu genetischer Instabilit{\"a}t f{\"u}hren und dadurch zur Krebsentwicklung beitragen. Daher ist eine schnelle DNA Schadensantwort n{\"o}tig, um schwerwiegende Folgen f{\"u}r die Zelle zu vermeiden. Da bekannt ist, dass der Multiproteinkomplex LINC (auch humaner dREAM-Komplex genannt) an der transkriptionellen Regulation mitotischer und G2-spezifischer Gene beteiligt ist, sollte in dieser Arbeit seine Beteiligung an der DNA Schadensantwort genauer untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass in normal wachsenden Zellen B-MYB an den LINC-Kernkomplex bindet, welcher sich aus 5 Proteinen zusammensetzt: LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 und RbAp48. Treten DNA Sch{\"a}den auf, dissoziiert B-MYB vom LINC Kernkomplex wobei gleichzeitig die Bindung von p130 und E2F4 an LINC induziert wird. Zus{\"a}tzlich konnte gezeigt werden, dass der Signalweg, der die LINC Umlagerung vermittelt, sowohl p53- als auch p21-abh{\"a}ngig ist. p53 negative Zellen k{\"o}nnen nach Sch{\"a}digung der DNA weder einen G1 Block induzieren noch einen G2 Block langfristig aufrechterhalten. Eine Erkl{\"a}rung f{\"u}r diese Schw{\"a}chung des G2 Arrests liefern Daten dieser Arbeit: Da in DNA gesch{\"a}digten p53 -/- Zellen keine LINC Umlagerung beobachtet werden kann und zus{\"a}tzlich B-MYB verst{\"a}rkt an LINC und die Zielpromotoren bindet, kommt es zu einer erh{\"o}hten G2/M Genexpression. Dies resultiert h{\"a}ufig in einem verfr{\"u}hten Wiedereintritt in den Zellzyklus („checkpoint adaptation"). Eine Daten-Analyse prim{\"a}rer Brustkrebstumore zeigte außerdem, dass erh{\"o}hte B-MYB Genexpressionslevel mit einer erh{\"o}hte R{\"u}ckfallgefahr und einer schlechten Prognose korrelieren, was m{\"o}glicherweise auf die Funktion von B-MYB w{\"a}hrend der „checkpoint adaptation" zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Schlussendlich lassen die Ergebnisse dieser Arbeit vermuten, dass die Hemmung der B-MYB Funktion in solchen Tumoren, die p53 Mutationen tragen, die Wahrscheinlichkeit eines Behandlungserfolges vergr{\"o}ßern und die Wahrscheinlichkeit eines R{\"u}ckfalls senken k{\"o}nnte.}, subject = {Zellzyklus}, language = {en} } @phdthesis{Lisowski2022, author = {Lisowski, Clivia}, title = {Maturation of the \(Salmonella\) containing vacuole is compromised in G1 arrested host cells}, doi = {10.25972/OPUS-18523}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-185239}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {The interaction of bacterial pathogens and the human host is a complex process that has shaped both organisms on a molecular, cellular and population level. When pathogenic bacteria infect the human body, a battle ensues between the host immune system and the pathogen. In order to escape an immune response and to colonize the host, pathogenic bacteria have developed diverse virulence strategies and some pathogens even replicate within host cells. For survival and propagation within the dynamic environment of a host cell, these bacteria interfere with the regulation of host pathways, such as the cell cycle, for their own benefit. The intracellular pathogen Salmonella Typhimurium invades eukaryotic cells and resides and replicates in a modified vacuolar compartment in which it is protected from the innate immune response. To this end, it employs a set of virulence factors that help to invade cells (SPI-1 effectors) and to hijack and modify the host endolysosomal system, in order to stabilize and mature its vacuolar niche (SPI-2 effectors). Previous studies have shown that Salmonella arrests host cells in G2/M phase and that Salmonella infected cells progress faster from G1 into S phase, suggesting that the G1 phase is disadvantageous for Salmonella infection. In fact, it has already been observed that Salmonella replication is impaired in G1 arrested cells. However, the reason for this impairment remained unclear. The current study addressed this question for the first time and revealed that the highly adapted, intracellular lifestyle of Salmonella is drastically altered upon G1 arrest of the host cell. It is shown that proteasomal degradation in G1 arrested cells is delayed and endolysosomal and autophagosomal trafficking is compromised. Accordingly, processing of lysosomal proteins is insufficient and lysosomal activity is decreased; resulting in uneven distribution and accumulation of endolysosomes and autophagosomes, containing undegraded cargo. The deregulation of these cellular signaling pathways affects maturation of the Salmonella containing vacuole (SCV). For the first time it is shown that acidification of SCVs is impaired upon G1 arrest. Thus, an important environmental factor for the switch from SPI-1 to SPI-2 gene expression is missing and the SPI-2 system is not activated. Consequently, targeting and modification of host cell structures by SPI-2 effectors e.g. recruitment of endolysosomal membrane proteins, like LAMP1, or exchange of endosomal cargo, is compromised. In addition, degradation of Salmonella SPI-1 effectors by the host proteasome is delayed. Their prolonged presence sustained the recruitment of early endosomes and contributed to the SCV remaining in an early, vulnerable maturation stage. Finally, it was shown that SCV membrane integrity is compromised; the early SCV ruptures and bacteria are released into the cytoplasm. Depending on the host cell type, SPI-2 independent, cytoplasmic replication is promoted. This might favor bacterial spreading, dissemination into the tissue and provide an advantage in host colonization. Overall, the present study establishes a link between host cell cycle regulation and the outcome of Salmonella infection. It fills the gap of knowledge as to why the host cell cycle stage is of critical importance for Salmonella infection and sheds light on a key aspect of host-pathogen interaction.}, subject = {Salmonella Typhimurium}, language = {en} } @phdthesis{Kumari2014, author = {Kumari, Geeta}, title = {Molecular Characterization of the Induction of Cell Cycle Inhibitor p21 in Response to Inhibition of the Mitotic Kinase Aurora B}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-101327}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Aurora B ist eine mitotische Kinase, die entscheidende Funktionen in der Zellteilung aus{\"u}bt. Aurora B ist außerdem in einer Vielzahl von Krebsarten mutiert oder {\"u}berexprimiert. Daher ist die Aurora B Kinase ein attraktives Ziel f{\"u}r die Tumortherapie. Gegenw{\"a}rtig werden Aurora B-Inhibitoren zur Behandlung von soliden Tumoren und Leuk{\"a}mien in verschiedenen klinischen Studien getestet. Es fehlen jedoch Informationen, welche molekularen Mechanismen den beschriebenen Ph{\"a}notypen wie Zellzyklusarrest, Aktivierung des Tumorsuppressors p53 und seines Zielgens p21 nach Aurora B-Hemmung zugrunde liegen. Hauptziel dieser Arbeit war es die Mechanismen der p21-Induktion nach Hemmung von Aurora B zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass nach Hemmung von Aurora B die p38 MAPK phosphoryliert und somit aktiviert wird. Experimente mit p38-Inhbitoren belegen, dass p38 f{\"u}r die Induktion von p21 und den Zellzyklusarrest ben{\"o}tigt wird. Die Stabilisierung von p53 nach Aurora B-Inhibition und die Rekrutierung von p53 an den p21-Genpromotor erfolgen jedoch unabh{\"a}ngig vom p38-Signalweg. Stattdessen ist p38 f{\"u}r die Anreicherung der elongierenden RNA-Polymerase II in der kodierenden Region des p21-Gens und f{\"u}r die Bildung des p21 mRNA Transkripts notwendig. Diese Daten zeigen, dass p38 transkriptionelle Elongation des p21-Gens nach Aurora B Hemmung f{\"o}rdert. In weiteren Untersuchungen konnte ich zeigen, dass die Aurora B-Hemmung zu einer Dephosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins f{\"u}hrt und dadurch eine Abnahme der E2F-abh{\"a}ngigen Transkription bewirkt. Dies l{\"o}st indirekt einen Zellzyklusarrest aus. Weiterhin konnte mit Hilfe von synchronisierten Zellen gezeigt werden, dass p21 nach Durchlaufen einer abnormalen Mitose induziert wird, jedoch nicht nach Aurora B-Hemmung in der Interphase. Interessanterweise werden p38, p53 und p21 schon bei partieller Inhibition von Aurora B aktiviert. Die partielle Inhibition von Aurora B f{\"u}hrt zu chromosomaler Instabilit{\"a}t aber nicht zum Versagen der Zytokinese und zur Bildung polyploider Zellen. Damit korreliert die Aktivierung des p38-p53-p21-Signalweges nicht mit Tetraploidie sondern mit vermehrter Aneuploidie. Die partielle Hemmung von Aurora B f{\"u}hrt außerdem zur vermehrten Entstehung von reaktive Sauerstoffspezies (ROS), welche f{\"u}r die Aktivierung von p38, p21 und f{\"u}r den Zellzyklusarrest ben{\"o}tigt werden. Basierend auf diesen Beobachtungen kann folgendes Modell postuliert werden: Die Hemmung von Aurora B f{\"u}hrt zu Fehlern in der Chromosomenverteilung in der Mitose und damit zu Aneuploidie. Dies f{\"u}hrt zu vermehrter Produktion von ROS, m{\"o}glicherweise durch proteotoxischer Stress, hervorgerufen durch die Imbalanz der Proteinbiosynthese in aneuploiden Zellen. ROS bewirkt eine Aktivierung der p38 MAPK und tr{\"a}gt damit zur Induktion von p21 und dem resultierenden Zellzyklusarrest bei. Aneuploidie, proteotoxischer und oxidativer Stress stellen Schl{\"u}sselmerkmale von Tumorkrankungen dar. Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit k{\"o}nnte die Kombination von Aurora B-Hemmstoffen mit Medikamenten, die gezielt aneuploide Zellen angreifen, in Tumorerkrankungen therapeutisch wirksam sein.}, subject = {Zellzyklus}, language = {en} } @phdthesis{Koike2023, author = {Koike, Akito}, title = {Molekular und zellbiologischer Ansatz hin zu neuartigen Medikamenten gegen \(Echinococcus\) \(multilocularis\)}, doi = {10.25972/OPUS-28864}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-288649}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Echinococcosis is an important zoonosis. The causative agent of Alveolar Echinococcosis (AE) is Echinococcus multilocularis. The treatment of human AE is limited to surgery and chemotherapy with albendazole (ABZ). However, ABZ works only parasitostatically and it needs to be taken for long periods, although it causes adverse side effects. Thus, development of new, parasiticidal drug with selective toxicity is required. Because undifferentiated stem cells of E. multilocularis play key role in its longevity and regenerative capacity, targeting stem cells is especially important. In vitro screening of protein kinases inhibitors demonstrated that human PIM kinases inhibitors have detrimental effects on E. multilocularis. Through yeast two hybrid assay, the interaction of parasite PIM kinase (EmPIM) and its CDC25 (EmCDC25) was indicated. Through in situ hybridization, expression of EmPIM in the stem cells was observed. Therefore, EmPim is likely to be a positive regulator of cell cycle progression, the same as human Pim1. In addition, 20 compounds against EmPIM were selected through in silico screening and synthesized. One of them has a detrimental effect on E.multilocularis comparable to human pan-PIM inhibitors, but has much weaker toxicity on human cell lines. Furthermore, triclabendazole (TCBZ) and its metabolite TCBZSX, which are approved for another flatworm disease, Fascioliasis were tried on E. multilocularis. With two stem cell markers, damage to stem cells by TCBZSX was shown. In addition, primary cells from treated vesicles never regenerated and the damage to stem cells proved to be irreversible. Our in silico screening method used in EmPIM research has potential to identify compounds which overcome the side effect problem in ABZ-based chemotherapy. On the other hand, it is expected that my research of TCBZ can lead to development of a practical parasiticidal chemotherapy by combining TCBZ, which damages stem cells, and ABZ, which damages differentiated cells.}, subject = {Bandw{\"u}rmer}, language = {en} } @phdthesis{Kochler2012, author = {Kochler, Yvonne}, title = {Der zeitliche Verlauf von Parametern des Zellzyklus bei Patienten mit Fanconi An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67204}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Es werden die Parameter Summe-G2/GF und G0/G1 der hochaufl{\"o}senden, zweiparametrigen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Fanconi-An{\"a}mie-Patienten, bei denen mehrere Meßwerte vorliegen, im Hinblick auf Schwankungen untersucht. Nach Auswertung der Daten stellen die Werte keine konstanten Parameter f{\"u}r den einzelnen Patienten dar. Die Langzeitanalyse des Zellzyklusverhaltens peripherer Blutlymphozyten reflektiert jedoch weitgehend die klinische Situation der Patienten.}, subject = {Fanconi-An{\"a}mie}, language = {de} } @phdthesis{Herrmann2004, author = {Herrmann, Thomas}, title = {Sequenz-spezifische Interaktion des murinen pr{\"a}replikativen Komplexes mit Origin-DNA}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11241}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Mit Hilfe von in vivo ChIP-Experimenten identifizierten wir eine pr{\"a}RC Bindungsstelle von -2519 bis -2152 (Fragment B) innerhalb eines „origin of bidirectional replication (OBR)" der 44 kb langen Maus-rDNA-Einheit. Diese Bindungsstelle befindet sich ungef{\"a}hr 2,3 kb ubstream des Transkriptionsstartpunktes der RNA-Poymerase I. An dieser Bindungsstelle konnte in der G1-Phase der komplette ORC-Komplex sowie Geminin, MCM3 und -6 nachgewiesen werden. F{\"u}r den G1/S-Phasen{\"u}bergang deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich ORC6 und Geminin von Fragment B abl{\"o}sen, w{\"a}hrend sich CDC6 und -45 an den ORC-Komplex anlagern. Mit Erreichen der S-Phase konnte gezeigt werden, dass sich CDC6 und -45 sowie ORC1 wieder abl{\"o}sen und ein Core-Komplex von ORC2-5 sowie MCM3 und -6 gebunden bleibt. Außerdem konnte an Fragment B eine spezifische Bindung eines aus FM3A-Zellkernprotein angereicherten pr{\"a}RC-Komplexes (Komplex A) auch in vitro mit Hilfe von EMSA-Experimenten beobachtet werden. Die Bindungsaktivit{\"a}t von Komplex A an Fragment B konnte durch ATP verst{\"a}rkt werden.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Heinrich2005, author = {Heinrich, Tilman}, title = {Validierung der Zellzyklusdiagnostik bei Ataxia telangiectasia}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14654}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia beschrieben. Hierzu wurden die Daten von 327 Patienten ausgewertet. In 82 F{\"a}llen ergab sich eine Best{\"a}tigung der Verdachtsdiagnose, in 225 F{\"a}llen konnte das Vorliegen dieser Erkrankung ausgeschlossen werden, bei den {\"u}brigen untersuchten F{\"a}llen ergab die Zellzyklusanalyse Auff{\"a}lligkeiten hinsichtlich des Proliferationsverhaltens der untersuchten Zellen und/oder ihrer Strahlensensitivit{\"a}t, die eine eindeutige Zuordnung zu einer der beiden Gruppen (AT-postiv/AT-negativ) zun{\"a}chst nicht gestatteten. Diese Auff{\"a}lligkeiten lassen sich teils auf technische Probleme (geronnenes Blut, langer Zeitraum zwischen Blutentnahme und Analyse), teils auf biologische Besonderheiten (bestehende Begleiterkrankungen wie Leuk{\"a}mie, Lymphom) zur{\"u}ckf{\"u}hren. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von Lymphozyten ergibt als diagnostisch relevante Parameter den Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) sowie den Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF). Der Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) ist ein Maß f{\"u}r die Stimulierbarkeit der Lymphozyten. Diese Stimulierbarkeit ist bei Zellen von AT-Patienten h{\"a}ufig vermindert, d.h. das Ausmaß der Mitogenantwort gibt ebenso einen Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung AT wie die Strahlensensitivit{\"a}t der Zellen. Letztere wird durch den zweiten der oben angef{\"u}hrten Parameter (G2/GF) repr{\"a}sentiert. Der f{\"u}r die Erkrankung AT charakteristische Funktionsverlust des ATM-Proteins, welches im unbeeintr{\"a}chtigten Zustand f{\"u}r die Kontrolle der Reparatur von strahleninduzierten DNA-Sch{\"a}digungen verantwortlich ist, f{\"u}hrt typischerweise zu einer Erh{\"o}hung des Anteils von Zellen in der G2-Phase, nachdem diese Zellen ionisierender Strahlung ausgesetzt waren. Die zweidimensionale Auftragung dieser Parameter (G0,G1 gegen G2/GF) erlaubt in der Regel bereits eine guten Abgrenzung der Gruppe der AT-positiven gegen die AT-negativen F{\"a}lle. Die Ber{\"u}cksichtigung eines weiteren Parameters, n{\"a}mlich des AFP-Wertes, gestattet dar{\"u}berhinaus in mehreren F{\"a}llen die Zuordnung der oben erw{\"a}hnten, zun{\"a}chst unklaren F{\"a}lle zu einer dieser Gruppen. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von bestrahlten Lymphozyten kann daher als Screening-Methode bei der Untersuchung von Patienten mit der Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia als ein dem CSA {\"u}berlegenes Verfahren angesehen werden. Die Kombination dreier Parameter: 1) Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1), 2) Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF) und 3) AFP-Wert erlaubt hierbei im Rahmen der AT-Diagnostik in >93\% der F{\"a}lle eine eindeutige Zuordnung zur Gruppe der AT-negativen bzw. AT-positiven F{\"a}lle.}, language = {de} } @phdthesis{Hanselmann2023, author = {Hanselmann, Steffen}, title = {PRC1 serves as a microtubule-bundling protein and is a potential therapeutic target for lung cancer}, doi = {10.25972/OPUS-26631}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-266314}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Protein regulator of cytokinesis 1 (PRC1) is a microtubule-associated protein with essential roles in mitosis and cytokinesis. Furthermore, the protein is highly expressed in several cancer types which is correlated with aneuploidy and worse patient outcome. In this study it was investigated, whether PRC1 is a potential target for lung cancer as well as its possible nuclear role. Elevated PRC1 expression was cell cycle-dependent with increasing levels from S-phase to G2/M-phase of the cell cycle. Thereby, PRC1 localized at the nucleus during interphase and at the central spindle and midbody during mitosis and cytokinesis. Genome-wide expression profiling by RNA sequencing of ectopically expressed PRC1 resulted in activation of the p53 pathway. A mutant version of PRC1, that is unable to enter the nucleus, induced the same gene sets as wildtype PRC1, suggesting that PRC1 has no nuclear-specific functions in lung cancer cells. Finally, PRC1 overexpression leads to proliferation defects, multi-nucleation, and enlargement of cells which was directly linked to microtubule-bundling within the cytoplasm. For analysis of the requirement of PRC1 in lung cancer, different inducible cell lines were generated to deplete the protein by RNA interference (RNAi) in vitro. PRC1 depletion caused proliferation defects and cytokinesis failures with increased numbers of bi- and multi-nucleated cells compared to non-induced lung cancer cells. Importantly, effects in control cells were less severe as in lung cancer cells. Finally, p53 wildtype lung cancer cells became senescent, whereas p53 mutant cells became apoptotic upon PRC1 depletion. PRC1 is also required for tumorigenesis in vivo, which was shown by using a mouse model for non-small cell lung cancer driven by oncogenic K-RAS and loss of p53. Here, lung tumor area, tumor number, and high-grade tumors were significantly reduced in PRC1 depleted conditions by RNAi. In this study, it is shown that PRC1 serves as a microtubule-bundling protein with essential roles in mitosis and cytokinesis. Expression of the protein needs to be tightly regulated to allow unperturbed proliferation of lung cancer cells. It is suggested that besides phosphorylation of PRC1, the nuclear localization might be a protective mechanism for the cells to prevent perinuclear microtubule-bundling. In conclusion, PRC1 could be a potential target of lung cancer as mono therapy or in combination with a chemotherapeutic agent, like cisplatin, which enhanced the negative effects on proliferation of lung cancer cells in vitro.}, language = {en} } @phdthesis{Gruendl2021, author = {Gr{\"u}ndl, Marco}, title = {Biochemical characterization of the MMB-Hippo crosstalk and its physiological relevance for heart development}, doi = {10.25972/OPUS-21332}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-213328}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {The Myb-MuvB (MMB) complex plays an essential role in the time-dependent transcriptional activation of mitotic genes. Recently, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP, the transcriptional coactivator of the Hippo pathway, to coregulate a subset of mitotic genes (Pattschull et al., 2019). Several genetic studies have shown that the Hippo-YAP pathway is essential to drive cardiomyocyte proliferation during cardiac development (von Gise et al., 2012; Heallen et al., 2011; Xin et al., 2011). However, the exact mechanisms of how YAP activates proliferation of cardiomyocytes is not known. This doctoral thesis addresses the physiological role of the MMB-Hippo crosstalk within the heart and characterizes the YAP-B-MYB interaction with the overall aim to identify a potent inhibitor of YAP. The results reported in this thesis indicate that complete loss of the MMB scaffold protein LIN9 in heart progenitor cells results in thinning of ventricular walls, reduced cardiomyocyte proliferation and early embryonic lethality. Moreover, genetic experiments using mice deficient in SAV1, a core component of the Hippo pathway, and LIN9-deficient mice revealed that the correct function of the MMB complex is critical for proliferation of cardiomyocytes due to Hippo-deficiency. Whole genome transcriptome profiling as well as genome wide binding studies identified a subset of Hippo-regulated cell cycle genes as direct targets of MMB. By proximity ligation assay (PLA), YAP and B-MYB were discovered to interact in embryonal cardiomyocytes. Biochemical approaches, such as co-immunoprecipitation assays, GST-pulldown assays, and µSPOT-based peptide arrays were employed to characterize the YAP-B-MYB interaction. Here, a PY motif within the N-terminus of B-MYB was found to directly interact with the YAP WW-domains. Consequently, the YAP WW-domains were important for the ability of YAP to drive proliferation in cardiomyocytes and to activate MMB target genes in differentiated C2C12 cells. The biochemical information obtained from the interaction studies was utilized to develop a novel competitive inhibitor of YAP called MY-COMP (Myb-YAP competition). In MY-COMP, the protein fragment of B-MYB containing the YAP binding domain is fused to a nuclear localization signal. Co-immunoprecipitation studies as well as PLA revealed that the YAP-B-MYB interaction is robustly blocked by expression of MY-COMP. Adenoviral overexpression of MY-COMP in embryonal cardiomyocytes suppressed entry into mitosis and blocked the pro-proliferative function of YAP. Strikingly, characterization of the cellular phenotype showed that ectopic expression of MY-COMP led to growth defects, nuclear abnormalities and polyploidization in HeLa cells. Taken together, the results of this thesis reveal the mechanism of the crosstalk between the Hippo signaling pathway and the MMB complex in the heart and form the basis for interference with the oncogenic activity of the Hippo coactivator YAP.}, subject = {Zellzyklus}, language = {en} } @phdthesis{Glaeser2017, author = {Gl{\"a}ser, Katharina}, title = {Einfluss hochfrequenter Felder des Mobilfunks auf das blutbildende System in vitro}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-145733}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2017}, abstract = {Elektromagnetische Felder (EMF) sind in der Umwelt des Menschen allgegenw{\"a}rtig. Unter Verwendung unterschiedlicher Frequenzen bilden sie die Grundlage zahlreicher Technologien und begegnen uns im Alltag in einer Vielzahl von Anwendungen. Eine sehr wichtige Anwendung von EMF ist die mobile Kommunikation. Die hierf{\"u}r verwendeten Frequenzen liegen im hochfrequenten Bereich und variieren mit dem Mobilfunkstandard. Weit verbreitet ist die GSM- und UMTS-Modulation der zweiten (2G) und dritten Generation (3G). Zum neuesten Mobilfunkstandard z{\"a}hlt LTE (4G). Aus statistischen Daten geht hervor, dass derzeit weltweit mehr als sieben Milliarden Mobilfunk-Endger{\"a}te existieren. Die weitverbreitete und stetig ansteigende Verwendung dieser Technologien verdeutlicht, dass viele Menschen, darunter auch zunehmend Kinder und Jugendliche, regelm{\"a}ßig einer Exposition gegen{\"u}ber EMF ausgesetzt sind. Die wichtigste Expositionsquelle stellt dabei das Mobiltelefon dar, da sich in diesem Szenario die Quelle sehr nah am menschlichen K{\"o}rper befindet. In der Vergangenheit wurden zahlreiche in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen sowie epidemiologische Studien durchgef{\"u}hrt, um potentielle, nicht-thermische Effekte von Mobilfunkstrahlung auf biologische Systeme beurteilen zu k{\"o}nnen. Ein vollst{\"a}ndiger Konsens konnte auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse jedoch nicht erzielt werden, sodass weiterhin Bedenken zum sch{\"a}dlichen Potential dieser nichtionisierenden Strahlung bestehen. Insbesondere wurden Fragestellungen zu Langzeiteffekten sowie zu Effekten, die speziell bei Kindern eine besondere Rolle spielen, bisher nicht ausreichend adressiert. Kinder k{\"o}nnen empfindlicher auf Umwelteinfl{\"u}sse reagieren und sind im Vergleich zu Erwachsenen teilweise h{\"o}her gegen{\"u}ber EMF exponiert. Dies gilt vor allem f{\"u}r Kopfregionen, in denen sich das aktive, f{\"u}r die H{\"a}matopoese verantwortliche Knochenmark befindet. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, den Einfluss von Mobilfunkstrahlung auf das humane blutbildende System zu untersuchen. Im Fokus standen dabei humane h{\"a}matopoetische Stammzellen, die mit Frequenzen der Mobilfunkstandards GSM (900 MHz), UMTS (1.950 MHz) und LTE (2.535 MHz) jeweils {\"u}ber einen kurzen (4 h) und einen langen (20 h) Zeitraum und mit unterschiedlichen Intensit{\"a}ten (0 W/kg, 0,5 W/kg, 1 W/kg, 2 W/kg und 4 W/kg) exponiert wurden. Vergleichende Experimente erfolgten mit Zellen der Promyelozyten-Zelllinie HL-60. M{\"o}gliche Effekte wurden mit den Endpunkten Apoptose, oxidativer Stress, Zellzyklus, DNA-Schaden und -Reparatur sowie Differenzierung und Epigenetik in Form von Histonacetylierung bewertet. In keinem der genannten Endpunkte konnten klare Effekte durch Mobilfunkstrahlung ausgemacht werden, weder f{\"u}r die h{\"a}matopoetischen Stammzellen, noch f{\"u}r die Zelllinie HL-60. Die einzige Ver{\"a}nderung wurde bei der Quantifizierung von DNA-Sch{\"a}den beobachtet. Hier zeigte sich nach der Kurzzeitexposition der Stammzellen mit der Modulation GSM eine kleine, aber statistisch signifikante Abnahme der DNA-Sch{\"a}den verglichen mit der Scheinexposition. Diese Beobachtung ließ sich in weiteren Replikaten jedoch nicht reproduzieren und wurde daher als nicht biologisch relevant eingestuft. Insgesamt konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Mobilfunkstrahlung mit Frequenzen der verbreiteten Modulationen GSM, UMTS und LTE sowie SAR-Werten, die unterhalb und oberhalb des empfohlenen Sicherheitsstandards liegen und typischerweise bei Handytelefonaten auftreten, keine Effekte in Zellen des blutbildenden Systems unter den gegebenen Versuchsbedingungen induziert wurden. Ein besonderer Fokus lag hierbei auf der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Weiterhin wurden zum ersten Mal humane h{\"a}matopoetische Stammzellen f{\"u}r derartige Untersuchungen eingesetzt. Dies hat insofern eine besondere Bedeutung, als h{\"a}matopoetische Stammzellen aufgrund ihrer multipotenten Eigenschaften eine breitere Analyse mit Hinblick auf die Kanzerogenese und auf das Immunsystem erm{\"o}glichen. Um {\"u}ber die Mobilfunk-Untersuchungen hinaus die h{\"a}matopoetischen Stammzellen besser charakterisieren zu k{\"o}nnen, sowie die Sensitivit{\"a}t von Blutzellen mit unterschiedlichem Differenzierungsstatus zu analysieren, wurden sie anderen Zellen des blutbildenden Systems (undifferenzierte und differenzierte HL-60-Zellen und TK6-Zellen) gegen{\"u}bergestellt. Eine Behandlung der verschiedenen Zelltypen mit mutagenen Substanzen zeigte, dass sich die h{\"a}matopoetischen Stammzellen in den meisten der untersuchten Endpunkte von den Zelllinien unterschieden. Deutliche Abweichungen zeigten sich beim oxidativen Stress, der DNA-Reparatur und der Histonacetylierung; kein Unterschied konnte dagegen bei den DNA-Sch{\"a}den beobachtet werden. Eine erste Interpretation der erhaltenen Ergebnisse ist auf der Grundlage der unterschiedlichen Eigenschaften von Zellen mit abweichendem Differenzierungsstatus m{\"o}glich. Um jedoch eine eindeutige Aussage treffen zu k{\"o}nnen, m{\"u}ssten noch weitere Untersuchungen durchgef{\"u}hrt werden.}, subject = {Mobilfunk}, language = {de} } @phdthesis{Filatova2009, author = {Filatova, Alina}, title = {Mechanism and Control of Nuclear-Cytoplasmic Translocation of the Transporter Regulator RS1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-38512}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Das RS1 Protein (Gen RSC1A1) beteiligt sich an der Regulation des Na+-D-Glukose-kotransporters SGLT1 und einiger anderer Transporter. In subkonfluenten LLC-PK1 Zellen hemmt RS1 die Freisetzung von SGLT1 aus dem trans-Golgi-Netzwerk und die Transkription von SGLT1. W{\"a}hrend es sich in konfluenten Zellen haupts{\"a}chlich im Zytoplasma befindet, ist RS1 in subkonfluenten Zellen im Kern und im Zytoplasma lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismus und Regulation der konfluenzabh{\"a}ngigen Kernlokalisation von RS1 untersucht. Dabel konnte gezeigt werden, dass die von Konfluenz abh{\"a}ngige Kernlokalisation von RS1 durch den Zellzyklus reguliert wird. In RS1 aus Sus scrofa (pRS1) wurde eine Sequenz identifiziert („nuclear shuttling signal", NS), die f{\"u}r die konfluenzabh{\"a}ngige Verteilung von RS1 verantwortlich ist und sowohl das Signal f{\"u}r die Kernlokalisation (NLS) als auch das Signal f{\"u}r den Export aus dem Kern (NES) beinhaltet. Die NLS und NES Signale von RS1 vermitteln die Translokation des Proteins in den Kern und aus dem Kern mit Hilfe von Importin \&\#946;1 bzw. CRM1, wobei die Verteilung von RS1 zwischen Kern und Zytoplasma durch die Aktivit{\"a}t des Exportsystems bestimmt wird. Es wurde gezeigt, dass die benachbarte Proteinkinase C (PKC) Phosphorylierungsstelle an Serin 370 von pRS1 die NS-gesteuerte Kernlokalisierung kontrolliert und f{\"u}r die vom Zellzyklus abh{\"a}ngige Kernlokalisation notwendig ist. Aufgrund der Ergebnisse der ortsgerichteten Mutagenese, PKC-Aktivierungsexperimenten und Massenspektrometrie-Analyse des Phosphorylierungsmusters von RS1 wurde ein Modell vorgeschlagen, das die Regulation der Kernlokalisation des RS1 Proteins in LLC-PK1 Zellen beschreibt. Dem Modell zufolge wird RS1 in subkonfluenten Zellen stark in den Kern bef{\"o}rdert, w{\"a}hrend der Export von RS1 aus dem Kern nicht stattfindet. Das f{\"u}hrt zur Anreicherung von RS1 im Kern. Nach Konfluenz wird Serin 370 durch PKC phosphoryliert, was die Steigerung des RS1-Exports aus dem Kern beg{\"u}nstigt und die {\"u}berwiegend zytoplasmatische Lokalisation des Proteins in konfluenten Zellen hervorruft. Die konfluenzabh{\"a}ngige Regulation der Lokalisation von RS1 kann die Expression von SGLT1 w{\"a}hrend der Regeneration von Enterozyten im D{\"u}nndarm und der Regeneration von Zellen der Nierentubuli nach hypox{\"a}mischem Stress kontrollieren. Außerdem deutet die Analyse der Genexpression in embryonalen Fibroblasten der RS-/- M{\"a}use deutet darauf hin, dass die transkriptionale Regulation durch RS1 im Zellzyklus und bei der Zellteilung eine wichtige Rolle spielen kann. Da die Lokalisation von RS1 zellzyklusabh{\"a}ngig ist, kann RS1 f{\"u}r die Regulation der Transporter in spezifischen Phasen des Zellzyklus wichtig sein.}, subject = {RS1}, language = {en} } @phdthesis{FetivaMora2023, author = {Fetiva Mora, Maria Camila}, title = {Changes in chromatin accessibility by oncogenic YAP and its relevance for regulation of cell cycle gene expression and cell migration}, doi = {10.25972/OPUS-30291}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-302910}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes. The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration. Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration.}, subject = {Chromatin}, language = {en} } @phdthesis{Fackler2014, author = {Fackler, Marc}, title = {Biochemical characterization of GAS2L3, a target gene of the DREAM complex}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-103394}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {GAS2L3 was identified recently as a target gene of the DREAM complex (Reichert et al., 2010; Wolter et al., 2012). It was shown that GAS2L3 is expressed in a cell cycle specific manner and that depletion of the protein leads to defects in cytokinesis and genomic instability (Wolter et al., 2012). Major aim of this thesis was, to further characterize the biochemical properties and physiological function of GAS2L3. By in vitro co-sedimentation and bundling assays, GAS2L3 was identified as a cytoskeleton associated protein which bundles, binds and crosslinks F-actin and MTs. GST pulldown assays and co-immunoprecipitation experiments revealed that GAS2L3 interacts in vitro and in vivo with the chromosomal passenger complex (CPC), a very important regulator of mitosis and cytokinesis, and that the interaction is mediated by the GAR domain of GAS2L3 and the C-terminal part of Borealin and the N-terminal part of Survivin. Kinase assays showed that GAS2L3 is not a substrate of the CPC but is strongly phosphorylated by CDK1 in vitro. Depletion of GAS2L3 by shRNA influenced protein stability and activity of the CPC. However pharmacological studies showed that the decreased CPC activity is not responsible for the observed cytokinesis defects upon GAS2L3 depletion. Immunofluorescence experiments revealed that GAS2L3 is localized to the constriction zone by the CPC in a GAR dependent manner and that the GAR domain is important for proper protein function. New interacting proteins of GAS2L3 were identified by stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC) in combination with tandem affinity purification and subsequent mass spectrometrical analysis. Co-immunoprecipitation experiments further confirmed the obtained mass spectrometrical data. To address the physiological function of GAS2L3 in vivo, a conditional and a non-conditional knockout mouse strain was established. The non-conditional mouse strain showed a highly increased mortality rate before weaning age probably due to heart failure. The physiological function of GAS2L3 in vivo as well as the exact reason for the observed heart phenotype is not known at the moment.}, subject = {Zellzyklus}, language = {en} } @phdthesis{Esterlechner2013, author = {Esterlechner, Jasmina}, title = {Role of the DREAM complex in mouse embryonic stem cells and identification of ZO-2 as a new LIN9 interacting protein}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-90440}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {The DREAM complex plays an important role in regulation of gene expression during the cell cycle. It was previously shown that the DREAM subunits LIN9 and B-MYB are required for early embryonic development and for the maintenance of the inner cell mass in vitro. In this work the effect of LIN9 or B-MYB depletion on embryonic stem cells (ESC) was examined. It demonstrates that LIN9 and B-MYB knock down changes the cell cycle distribution of ESCs and results in an accumulation of cells in G2 and M and in an increase of polyploid cells. By using genome-wide expression studies it was revealed that the depletion of LIN9 leads to downregulation of mitotic genes and to upregulation of differentiation-specific genes. ChIP-on chip experiments determined that mitotic genes are direct targets of LIN9 while lineage specific markers are regulated indirectly. Importantly, depletion of LIN9 does not alter the expression of the pluripotency markers Sox2 and Oct4 and LIN9 depleted ESCs retain alkaline phosphatase activity. I conclude that LIN9 is essential for proliferation and genome stability of ESCs by activating genes with important functions in mitosis and cytokinesis. The exact molecular mechanisms behind this gene activation are still unclear as no DREAM subunit features a catalytically active domain. It is assumed that DREAM interacts with other proteins or co-factors for transcriptional activation. This study discovered potential binding proteins by combining in vivo isotope labeling of proteins with mass spectrometry (MS) and further analysed the identified interaction of the tight junction protein ZO-2 with DREAM which is cell cycle dependent and strongest in S-phase. ZO-2 depletion results in reduced cell proliferation and decreased G1 gene expression. As no G2/M genes, typical DREAM targets, are affected upon ZO-2 knock down, it is unlikely that ZO-2 binding is needed for a functional DREAM complex. However, this work demonstrates that with (MS)-based quantitative proteomics, DREAM interacting proteins can be identified which might help to elucidate the mechanisms underlying DREAM mediated gene activation.}, subject = {Zellzyklus}, language = {en} } @phdthesis{Endres2003, author = {Endres, Karlheinz}, title = {Zellzykluseffekte von Mitomycin C}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12647}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {ZELLZYKLUSEFFEKTE VON MITOMYCIN C Im Rahmen dieser Arbeit sollten die durch Mitomycin C (MMC) exogen induzierten Zellzyklusst{\"o}rungen mit den endogenen St{\"o}rungen des Zellzyklus bei Fanconi-An{\"a}mie in unterschiedlichen Zellsystemen (periphere Blutlymphozyten, lymphoblastoide Zellen und Fibroblasten) verglichen werden. Die Zellzyklusanalysen wurden mit der zweidimensionalen Durchflusszytometrie nach dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren durchgef{\"u}hrt. Mit diesem Verfahren ist es m{\"o}glich zwischen proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen (Ellwart, Stunkel et al. 1981) zu unterscheiden und Verteilungen der Zellen in bis zu vier Zellzyklusphasen mit quantitativer Analyse der Populationen w{\"a}hrend der G0-G1-, G1-, S- und G2-Phasen zu erfassen (Kubbies 1989). Das Ausscheiden von Zellen aus dem Zellzyklus kann dabei {\"u}ber die Akkumulation in den entsprechenden Phasenanteilen des Zellzyklus erfasst werden. Die Induktion von Zellzyklusst{\"o}rungen erfolgte mit dem bifunktionellen Alkylanz Mitomycin C. Die Applikation von Mitomycin C (MMC) f{\"u}hrte dabei vor allem zu einer dosisabh{\"a}ngigen Zunahme der G2-Phasenanteile der Zellzyklen, was als Akkumulation von Zellen innerhalb dieses Kompartiments zu verstehen ist. Diese Akkumulation konnte bei den durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen mit der abgeleiteten Gr{\"o}ße Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) proliferationsunabh{\"a}ngig erfasst werden. Die konzentrationsabh{\"a}ngige Zunahme der G2-Phasenakkumulation und die unterschiedliche Verteilung innerhalb der Zellzyklen wurden mit den beiden Parametern Increased S G2+G2`/GF und Increased S G2/GF festgehalten und ausgewertet. Die Untersuchungen mit peripheren Blutlymphozyten, lymphoblastoiden Zellen (B-LCL) und Fibroblasten von gesunden Kontrollpersonen zeigten, dass sich die durch Mitomycin C induzierten DNA-Sch{\"a}digungen bei durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen vor allem als G2-Phasenakkumulation darstellen. Demgegen{\"u}ber lagen die ermittelten Werte der S G2/GF von Fa-Individuen bereits bei Standardzellkulturen {\"u}ber denen der gesunden Versuchspersonen. Vor allem bei den Zellzyklusstudien mit peripheren Blutlymphozyten von Fanconi-An{\"a}mie Patienten zeigten sich bereits endogen eine massive Erh{\"o}hung der G2-Phasenanteile. Im Vergleich zu den untersuchten Kontrollen war die Mitomycin C induzierte Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen nicht beliebig steigerbar. Die untersuchten Zellsysteme zeigten verschiedene Proliferationsmuster und reagierten mit einer unterschiedlich starken Arretierung von Zellen in den G2-Phasen bei Zugabe von Mitomycin C. Als sensitivste Zellart reagierten subkutane menschliche Fibroblasten bei Applikation von Mitomycin C. Bei den durchgef{\"u}hrten Zellzyklusanalysen zeigte sich aber auch, dass bei hohen Konzentration von Mitomycin C (MMC) die zytoxischen Effekte von Mitomycin C {\"u}berwiegen und es zu einem starken R{\"u}ckgang des Zellwachstums kommt. Da die exogen induzierten Zellzyklusst{\"o}rungen durch Mitomycin C bei gesunden Kontrollpersonen mit den typischen endogenen St{\"o}rungen des Zellzyklus bei Fa-Individuen vergleichbar waren, kann als m{\"o}gliche Ursache f{\"u}r Fanconi-An{\"a}mie auf einen DNA-Reparaturdefekt geschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auch Zellen von obligat heterozygoten Fa-Individuen mit dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren untersucht. War bei Fa-homozygoten Patienten bereits endogen die Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen deutlich gegen{\"u}ber den gesunden Kontrollpersonen erh{\"o}ht, so konnte dies f{\"u}r Fa-heterozygote Individuen nicht gezeigt werden. Die ermittelten Werte der Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) lagen zwar dabei vor allem bei den untersuchten peripheren Blutlymphozyten und subkutanen Fibroblasten etwas {\"u}ber den Kontrollen. Mit den hier vorgelegten Daten aus den Zellzyklusanalysen war aber keine Unterscheidung zwischen den obligat heterozygoten Fa-Individuen und den gesunden Probanden m{\"o}glich. Die Ergebnisse stehen dennoch im Einklang mit den zytogenetischen Untersuchungen auf erh{\"o}hte Chromosomenbruchraten bei Verdacht auf Fanconi-An{\"a}mie.}, language = {de} } @phdthesis{EiterverhSeidl2023, author = {Eiter [verh. Seidl], Rafael}, title = {Untersuchungen zum Einfluss von Wundsekret auf Zellvermehrung, Chemoresistenzentwicklung, Zellzyklus und die Induktion einer Epithelial-mesenchymalen Transition in Tumorzellen von Kopf und Hals}, doi = {10.25972/OPUS-32678}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-326782}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Tumore von Kopf und Hals gehen weiterhin mit einer schlechten Prognose einher. Im Rahmen einer operativen Therapie tritt Wundsekret (WS) aus, welches der Wundheilung dient. Dieses kann in Kontakt mit Tumorzellen bzw. Resttumor in der Wunde kommen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Frage nach dem Einfluss von Wundsekret auf Zellvermehrung, Chemoresistenzentwicklung, den Zellzyklus und die Induktion einer Epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) in Tumorzellen von Kopf und Hals gestellt. Hierf{\"u}r wurde das WS von Tag1 und das WS von Tag 2 im Dotblot auf seine Zytokinzusammensetzung analysiert. Zwei Tumorzelllinien von Kopf und Hals, FaDu und HlaC78, wurden mit WSTag1 und WSTag2 behandelt und untersucht, welche Effekte das WS auf die Zellen hat. Verwendet wurden ein Proliferationsassay, eine Zellzyklusuntersuchung und Apoptosetestung mittels FACS, eine PCR, ein Spheroidmodell und die Lichtmikroskopie. Im WS wurden erh{\"o}hte Konzentrationen verschiedener Zytokine, insbesondere von IL-6, nachgewiesen. Gezeigt werden konnte eine gesteigerte Proliferationsrate der Tumorzellen unter WS-Behandlung, jedoch keine ver{\"a}nderte Verteilung der Zellzyklusphasen. In HlaC78-Zellen konnte eine vermehrte Vitalit{\"a}t nach Cisplatinbehandlung nachgewiesen werden. In beiden Tumorzelllinien fand sich eine vermehrte Exprimierung von Snail 1, Snail 2 und Vimentin. E-Cadherin wurde vermindert exprimiert. Twist und N-Cadherin wiesen keine Ver{\"a}nderungen auf. Es zeigte sich eine vermehrte Migration der Tumorzellen in die Umgebung. Die Zellen wiesen nach Behandlung mit WS vermehrt mesenchymale Zeichen auf. Es konnte kein Unterschied der Auswirkungen einer Behandlung mit WSTag1 im Vergleich zu einer Behandlung mit WSTag2 festgestellt werden. Insgesamt scheint WS in Tumorzellen von Kopf und Hals einen EMT-artigen Prozess in Gang zu setzen, also eine partial EMT (pEMT). Als m{\"o}gliche Ausl{\"o}ser dieser Ver{\"a}nderungen kommen die im WS nachgewiesenen Zytokine und v. a. IL-6 in Frage.}, subject = {Wundheilung}, language = {de} } @phdthesis{Buck2006, author = {Buck, Annette Dorothea}, title = {Wirkung atherogener Lipoproteine auf den Zellzyklus von Endothelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19157}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Es wurde die Wirkung von oxidiertem LDL, ein ausgepr{\"a}gt atherogen wirkendes Lipoprotein, auf die Zellzyklusregulation von Endothelzellen untersucht. Eine Bestimmung der Proliferation von HUVEC zeigte einen dualer Effekt von OxLDL: Niedrige Konzentrationen (1-50\&\#956;g/ml)OxLDL f{\"u}hrten zu einem Anstieg der Proliferation im Vergleich zu Kontrollzellen,wohingegen es bei h{\"o}heren Konzentrationen OxLDL (100 und 200\&\#956;g/ml) zu einem Absterben der Zellen kam. Im Weiteren wurde der Einfluss von OxLDL auf den Zellzyklusinhibitor p27Kip1 mittels Western Blot-Analyse und Oligonukleotid-Transfektion bestimmt.}, language = {de} } @phdthesis{BergmannBorges2023, author = {Bergmann Borges, Alyssa}, title = {The endo-lysosomal system of \(Trypanosoma\) \(brucei\): insights from a protist cell model}, doi = {10.25972/OPUS-32924}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-329248}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Most of the studies in cell biology primarily focus on models from the opisthokont group of eukaryotes. However, opisthokonts do not encompass the full diversity of eukaryotes. Thus, it is necessary to broaden the research focus to other organisms to gain a comprehensive understanding of basic cellular processes shared across the tree of life. In this sense, Trypanosoma brucei, a unicellular eukaryote, emerges as a viable alternative. The collaborative efforts in genome sequencing and protein tagging over the past two decades have significantly expanded our knowledge on this organism and have provided valuable tools to facilitate a more detailed analysis of this parasite. Nevertheless, numerous questions still remain. The survival of T. brucei within the mammalian host is intricately linked to the endo-lysosomal system, which plays a critical role in surface glycoprotein recycling, antibody clearance, and plasma membrane homeostasis. However, the dynamics of the duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation and its potential relationship with plasma membrane growth remain poorly understood. Thus, as the primary objective, this thesis explores the endo-lysosomal system of T. brucei in the context of the cell cycle, providing insights on cell surface growth, endosome duplication, and clathrin recruitment. In addition, the study revisits ferritin endocytosis to provide quantitative data on the involvement of TbRab proteins (TbRab5A, TbRab7, and TbRab11) and the different endosomal subpopulations (early, late, and recycling endosomes, respectively) in the transport of this fluid-phase marker. Notably, while these subpopulations function as distinct compartments, different TbRabs can be found within the same region or structure, suggesting a potential physical connection between the endosomal subpopulations. The potential physical connection of endosomes is further explored within the context of the cell cycle and, finally, the duplication and morphological plasticity of the lysosome are also investigated. Overall, these findings provide insights into the dynamics of plasma membrane growth and the coordinated duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation. The early duplication of endosomes suggests their potential involvement in plasma membrane growth, while the late duplication of the lysosome indicates a reduced role in this process. The recruitment of clathrin and TbRab GTPases to the site of endosome formation supports the assumption that the newly formed endosomal system is active during cell division and, consequently, indicates its potential role in plasma membrane homeostasis. Furthermore, considering the vast diversity within the Trypanosoma genus, which includes ~500 described species, the macroevolution of the group was investigated using the combined information of the 18S rRNA gene sequence and structure. The sequence-structure analysis of T. brucei and other 42 trypanosome species was conducted in the context of the diversity of Trypanosomatida, the order in which trypanosomes are placed. An additional analysis focused on Trypanosoma highlighted key aspects of the group's macroevolution. To explore these aspects further, additional trypanosome species were included, and the changes in the Trypanosoma tree topology were analyzed. The sequence-structure phylogeny confirmed the independent evolutionary history of the human pathogens T. brucei and Trypanosoma cruzi, while also providing insights into the evolution of the Aquatic clade, paraphyly of groups, and species classification into subgenera.}, subject = {Endocytose}, language = {en} }