@phdthesis{Topf2013,
  author    = {Topf, Christine},
  title     = {Design, Synthese und biologische Testung von KasA-Inhibitoren als potentielle Wirkstoffe gegen Mycobacterium tuberculosis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77865},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Tuberkulose, einer schwerwiegenden bakteriellen Infektionskrankheit, die am h{\"a}ufigsten die Lunge bef{\"a}llt. Die Entwicklung neuer Arzneistoffe gegen diese Erkrankung ist immens wichtig, da nach Angaben der WHO weltweit j{\"a}hrlich {\"u}ber 1 Million Menschen an den Folgen der Tuberkulose sterben, derzeit kein effizienter Impfstoff zur Verf{\"u}gung steht und sich die Therapiem{\"o}glichkeiten auf wenige Arzneistoffe beschr{\"a}nken. Zudem steigt weltweit das Auftreten von arzneistoff- und totalresistenten Tuberkuloseformen. Tuberkulose wird vorwiegend durch das Mycobacterium tuberculosis erregt. Eine Besonderheit des M. tuberculosis stellt die mykobakterielle Zellwand dar, da diese durch einen hohen Anteil an Fetts{\"a}uren besonders wachsartig und dick ist. Die mykobakterielle Fetts{\"a}uresynthese unterscheidet sich signifikant von der Synthese eukaryotischer Fetts{\"a}uren. Daher besteht die M{\"o}glichkeit, Inhibitoren der mykobakteriellen Fetts{\"a}uresynthese als effektive und selektive neue Antituberkulotika zu entwickeln. Zielstruktur dieser Arbeit ist KasA (β-Ketoacylsynthase), ein Enzym der mykobakteriellen Fetts{\"a}uresynthese II, das die Kondensation zwischen der wachsenden Fetts{\"a}urekette und Malonyl-ACP katalysiert. Ein literaturbekannter KasA-Inhibitor ist Thiolactomycin, ein Thiolacton-Derivat mit einer schwachen inhibitorischen Aktivit{\"a}t (IC50: 242 µM; Kd 226 µM), f{\"u}r den eine KasA-Komplexstruktur verf{\"u}gbar ist. Ziel der Arbeit war es, mittels computergest{\"u}tzten Wirkstoffdesigns neue Leitstrukturen f{\"u}r KasA-Inhibitoren zu entwickeln und davon abgeleitet Substanzbibliotheken kleiner Molek{\"u}le zu synthetisieren. Zur Bestimmung der In-vitro-Aktivit{\"a}ten sollte KasA exprimiert und ein Assay etabliert werden. Theoretische und experimentelle Affinit{\"a}ten sollten anschließend analysiert und bewertet werden. Zur Identifizierung neuer potenzieller KasA-Inhibitoren wurde mit Hilfe des Thiolactomycin-Bindemodus ein Pharmakophor-Modell erstellt. In diesem wurden die essentielle Wasserstoffbr{\"u}cke zwischen den Histidinen und dem Carbonyl-Sauerstoff des Thiolactonrings, zwei hydrophobe Bereiche und ein verbindendes Strukturelement definiert und das Volumen des Pharmakophors begrenzt. Das Screening der Datenbank erfolgte mit GOLD4.0 und GOLDscore. Zur Identifizierung der 16 aussichtsreichsten Verbindungen wurden Rescorings mit ChemScore und sfc_score290m durchgef{\"u}hrt, sowie verschiedene physikochemische Deskriptoren und der errechnete Bindungsmodus einbezogen. Ausgew{\"a}hlte Verbindungen des Screenings wurden synthetisiert. Weitere Variationen wurden durch Einf{\"u}hrung von Substituenten und Bromierung und Nitrierung der Grundger{\"u}ste erhalten. Zur biologischen Testung dieser Verbindungen konnte KasA in M. smegmatis exprimiert werden. Die Reinigung des Proteins erfolgte mittels Affinit{\"a}ts- und Gr{\"o}ßenausschlusschromatographie. Affinit{\"a}tswerte an KasA konnten mit einem Fluoreszenzassays bestimmt werden, da in jedem KasA-Monomer vier Tryptophane zur intrinsischen Fluoreszenz beitragen. Die Bindung eines Inhibitors in die TLM-Bindetasche f{\"u}hrte zum Quenching der Fluoreszenz von KasA und konnte unter Ber{\"u}cksichtigung von Verd{\"u}nnungs- und inneren Filtereffekten zur Berechnung der Dissoziationskonstante Kd herangezogen werden. Die In-vitro-Untersuchungen der Inhibitoren von KasA zeigten im Vergleich zu TLM eine Verbesserung der Affinit{\"a}t bis zu einem Faktor von 11, die beste Verbindung war das Nitroisatin-Derivat 2l (22.1 µM). Einen Hinweis auf Hemmung des Wachstums von Mykobakterien war f{\"u}r die Verbindungen 2e (5-Nitro-1-phenethyl-2,3-indolindion) und 3a (5,7-Dibrom-1-(4-chlorbenzyl)indolin-2,3-dion) ersichtlich. Die {\"u}brigen Verbindungen zeigten keine Aktivit{\"a}t, was dadurch bedingt sein kann, dass sie Substanzen nicht lipophil genug sind (clogP-Werte zwischen 1 und 3), um die mykobakterielle Zellwand zu durchdringen. Analog dem Docking im Rahmen des virtuellen Screenings wurde ein Docking mit GOLD4.0 und GOLDscore f{\"u}r die Substanzbibliothek durchgef{\"u}hrt. Verglichen mit den In-vitro-Affinit{\"a}ten konnte eine gute {\"U}bereinstimmung in der Differenzierung der Substanzklassen gefunden werden. Da kleine Molek{\"u}le mit großer biologischer Aktivit{\"a}t zu bevorzugen sind, wurde die „ligand efficiency", die inhibitorische Potenz unabh{\"a}ngig vom Molekulargewicht, f{\"u}r die Verbindungen berechnet. F{\"u}r die Substanzbibliothek wurde eine gute Korrelation von „ligand efficiency" und GOLDscore pro Schweratom erzielt (R2=0.65), beste Substanzgruppen waren monoalkylierte Uracil- und Isatin-Derivate. Der beste Wert wurde f{\"u}r das Isatin-Derivat 1a erzielt. Mit den erarbeiteten theoretischen und experimentellen Ergebnissen und den etablierten Methoden bietet diese Arbeit eine wichtige Grundlage, um erste „hits" von KasA-Inhibitoren zu neuen Leitstrukturen f{\"u}r Wirkstoffe gegen Mycobakterium tuberculosis zu entwickeln.},
  subject      = {Tuberkelbakterium},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Lee2013,
  author    = {Lee, Wook},
  title     = {Computational study on the catalytic mechanism of mtKasA},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83989},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Das Enzym KasA spielt eine entscheidende Rolle in der Biosynthese von Mykols{\"a}uren, den Bausteinen der Zellw{\"a}nde von Mycobacteriumtuberculosis. Dessen essentielle Notwendigkeit zeigt sich bei Abwesenheit von KasA in einer Zelllyse (Aufl{\"o}sung von Zellen) bei Mycobacteriumtuberculosis. Durch seine Bedeutung f{\"u}r Mycobacteriumtuberculosis, dem Erreger von Tuberkulose und damit der zweith{\"a}ufigsten Todesursache durch Infektionskrankheiten, stellt KasA ein vielversprechendes Ziel f{\"u}r die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose dar. Durch das Auftreten von extensiv resistenten St{\"a}mmen welche die meisten bekannten Antibiotika zur Bek{\"a}mpfung von Tuberkulose inaktivieren wird es dringend notwendig neue Medikamente gegen Tuberkulose zu entwickeln. In Kapitel 3.1 wird der Protonierungszustand der katalytischen Reste im Ruhezustand untersucht. F{\"u}r diese Untersuchungen wurden Free Energy Perturbation (FEP) Rechnungen und MD Simulationen verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass der zwitterionische Zustand am wahrscheinlichsten ist. Um diese Aussage mit weiteren handfesten Daten zu untermauern wurden Potential(hyper)fl{\"a}chen (PES) f{\"u}r den Protonentransfer zwischen neutralen und zwitterionischen Zustand mit Hilfe von QM/MM Methoden berechnet. Durch die starke Abh{\"a}ngigkeit der QM/MM Optimierung von der Ausgangsstruktur war es nicht m{\"o}glich konsistente Ergebnisse f{\"u}r diese Berechnungen zu bekommen. Um dieses Problem zu umgehen wurde ein auf QM/MM basierendes Umbrella Sampling mit Semiempirischen Methoden (RM1) durchgef{\"u}hrt. Die sich daraus ergebende PMF Fl{\"a}che zeigt das der zwitterionische Zustand stabiler ist als der neutrale Zustand. In Kapitel 3.2 wurde der Protonierungszustand der entsprechenden Reste im Acyl-Enzym Zustand untersucht. Im Unterschied zu anderen katalytischen Resten ist der Protonierungszustand von His311 ist nicht eindeutig im Acyl-Enzym Zustand und es ergeben sich aus den verschiedenen Protonierungszust{\"a}nden verschiedene Decarboxylierungsmechanismen. Um den wahrscheinlichsten Protonierungszustand bez{\"u}glich der freien Energie zu bestimmen wurden FEP Rechnungen durchgef{\"u}hrt. Die Ergebnisse zeigen, dass der pKa Wert an Nδ betr{\"a}chtlich durch die Enzymumgebung verringert wird, w{\"a}hrend dies f{\"u}r Nε nicht der Fall ist. Zus{\"a}tzlich dazu wurden die PMF Profile f{\"u}r den Protonentransfer zwischen Lys340 und Glu354 mit der QM/MM basierten Umbrella Sampling Methode berechnet. Die Ergebnisse zeigen, dass das Lys340/Glu354 Paar eher neutral als ionisch ist, wenn His311 an Nε protoniert ist. Ein relativ hoher ionischer Charakter des Lys340/Glu354 Paares, wenn His311 doppelt protoniert ist, gibt einen wertvollen Einblick in die Rolle welche das Lys340/Glu354 Paar beim verschieben des Protonierungszustandes von Nδ zu Nε im His311 nach dem Acyltransferschritt spielt. Die Ergebnisse zeigen, dass His311 neutral und an Nε protoniert ist. Ebenso ist das Lys340/Glu354 Paar neutral im Acyl-Enzym Zustand. Diese berechneten Ergebnisse f{\"u}hren zu dem Schluss, dass die Decarboxylierung durch ein Oxyanion Loch erleichtert wird welches aus zwei katalytischen Histidin Resten besteht. In Kapitel 3.3 wurde der Protonierungszustand der katalytischen Reste im Ruhezustand erneut untersucht da eine aktuelle Benchmarkstudie zeigte, dass die verwendete Semiempirische Methode (RM1) in Kapitel 3.1 dazu tendiert die Stabilisation des zwitterionischen Zustandes zu {\"u}bersch{\"a}tzen. Auch wurde in Kapitel 3.1 das Lys340/Glu354 Paar als rein ionisch angesehen, w{\"a}hrend sich in Kapitel 3.2 herausstellte, dass es sich um eine Mischung aus neutralen und ionischen Charakter handelt. Die neuen Untersuchungen beinhalten eine gr{\"o}ßere QM Region inklusive des Lys340/Glu354 Paares. Der daf{\"u}r verwendete BLYP/6-31G** Ansatz ist ausreichend akkurat f{\"u}r die aktuelle Fragestellung, was durch Vergleichsrechnungen bewiesen wurde. Die neuen Ergebnisse der QM/MM MD und FEP Rechnungen deuten an, dass die katalytischen Reste im Ruhezustand h{\"o}chst wahrscheinlich neutral vorliegen. Dies wiederum f{\"u}hrt zu der Frage wie KasA aktiviert werden kann um die katalytische Reaktion zu initiieren. Auf der Basis der Ergebnisse der MD Simulationen und FEP Rechnungen f{\"u}r den His311Ala Mutanten in Kapitel 3.1 stellten wir die Hypothese auf, dass die offene Konformation von Phe404 die Aktivierung der katalytischen Reste durch die (Aus)bildung einer starken Wasserstoffbindung einleitet. Die QM/MM MD Simulation best{\"a}tigt dass diese Aktivierung der katalytischen Reste durch die offene Konformation des Phe404 bewerkstelligt werden kann. Das entsprechende auf Kraftfeld basierende PMF Profil zeigt auch, dass dieser Konformationswechsel energetisch realisierbar ist. Die Verteilung der hydrophilen und hydrophoben Reste in der Malonyl Bindungstasche in Verbindung mit unseren berechneten Ergebnissen geben einen Einblick in den detaillierten},
  subject      = {Tuberkelbakterium},
  language  = {en}
}