@phdthesis{Nuernberg2023,
  author    = {N{\"u}rnberg, Sebastian},
  title     = {Invasive \(Haemophilus\) \(influenzae\)-Isolate in Deutschland: Methodenvalidierung des VITEK MS IVD MALDI-TOF-MS und Untersuchung von Resistenzen gegen Imipenem und Cefotaxim},
  doi       = {10.25972/OPUS-34506},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-345067},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Die Inzidenz invasiver H. influenzae-Infektionen in Deutschland steigt seit Jahren an. Die akkurate Identifizierung und Resistenztestung dieses Erregers sind von großer klinischer und epidemiologischer Bedeutung. Daher wurden im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit umfangreiche Untersuchungen zur Diagnostik und zur Epidemiologie von Antibiotikaresistenzen bei H. influenzae durchgef{\"u}hrt. Es konnte gezeigt werden, dass die in der Routinediagnostik mittlerweile weit verbreitete MALDI-TOF-MS-Diagnostik durch das VITEK MS IVD nur eingeschr{\"a}nkt zur sicheren Unterscheidung von H. influenzae und H. haemolyticus einsetzbar ist. H. influenzae-Isolate erkannte das System mit einer Genauigkeit von 100 \%. Bei H. haemolyticus-Isolaten wurden dagegen 42 \% der untersuchten St{\"a}mme f{\"a}lschlicherweise als H. influenzae erkannt. Dieser Fragestellung wurde mit der bisher umfangreichsten molekularbiologisch charakterisierten Studienpopulation beider Bakterienspezies nachgegangen. Die kalkulierte antibiotische Therapie einer Sepsis oder Meningitis erfolgt h{\"a}ufig mit Carbapenemen, die leitliniengerechte Therapie invasiver H. influenzae-Infektionen mit Drittgenerations-Cephalosporinen. Imipenem und Cefotaxim geh{\"o}ren zu den Hauptvertretern dieser Gruppen. Bez{\"u}glich der Antibiotikaresistenztestung wurde erstmalig f{\"u}r H. influenzae herausgefunden, dass die routinem{\"a}ßig verwendete Gradientenagardiffusion (GAD) bei der Testung von Cefotaxim im Vergleich zum Goldstandard Bouillon-Mikrodilution gleichwertig und bei Imipenem sogar sensitiver in der Detektion von Heteroresistenzen ist. Die Epidemiologie dieser Resistenzen wurde in dieser Arbeit erstmalig f{\"u}r Deutschland systematisch erfasst, indem alle verf{\"u}gbaren invasiven Isolate gemeldeter H. influenzae-Infektionen der Jahre 2016 (Imipenem) beziehungsweise 2016-2019 (Cefotaxim) untersucht wurden. Es wurde eine hohe Pr{\"a}valenz einer Imipenem-Resistenz von 13,5 \% festgestellt. Die Pr{\"a}valenz einer Cefotaxim-Resistenz lag bei 0,9 \%. Zur molekularen Typisierung wurde bei den Imipenem-resistenten Isolaten eine Multilocus-Sequenztypisierung, bei den Cefotaxim-resistenten St{\"a}mmen eine Sequenzierung des vollst{\"a}ndigen Genoms durchgef{\"u}hrt. Hierbei wurde eine hohe genetische Diversit{\"a}t der St{\"a}mme festgestellt, was die Schlussfolgerung zul{\"a}sst, dass resistente Mutanten sporadisch entstehen. Die Untersuchung m{\"o}glicher spatio-temporaler Cluster f{\"u}hrte zum Nachweis einer sehr selten vorkommenden {\"U}bertragung eines Imipenem-resistenten Stamms. Durch die Sequenzierung von Resistenzgenen wurde die Epidemiologie und Relevanz bekannter Aminos{\"a}uresubstitutionen beleuchtet. Unter anderem wurde f{\"u}r die PBP3-Substitutionen L389F und Y557H eine hochsignifikante Korrelation mit dem Auftreten von Cefotaxim-Resistenzen nachgewiesen. Die gewonnenen Genomdaten bieten die Grundlage f{\"u}r die Forschung an weiteren Antibiotikaresistenzdeterminanten von H. influenzae.},
  subject      = {Haemophilus influenzae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bank2014,
  author    = {Bank, Stephanie},
  title     = {LC-ESI und MALDI-Massenspektrometrische Analyse nativer und derivatisierter Zucker und Glykane},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-106085},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Glykane sind weitverbreitete Biomolek{\"u}le, die meist in Form von Glykokonjugaten, wie beispielsweise als Glykoproteine oder Glykolipide, vorliegen. Durch die Interaktion von Glykanen mit Glykan-bindenden Proteinen wird eine Vielzahl an biochemischen Prozessen ausgel{\"o}st, sowohl physiologischer, als auch pathologischer Art. Die Aufkl{\"a}rung der beteiligten Glykanstrukturen ist daher nicht nur wichtig f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis dieser Prozesse, sondern kann auch Hinweise auf verschiedene Erkrankungen geben. Die Identifizierung von Glykanstrukturen kann {\"u}ber verschiedene Wege erfolgen. In der instrumentellen Analytik spielt dabei vor allem die ESI- und MALDI Massenspektrometrie eine wichtige Rolle, da diese sowohl f{\"u}r Detektion, als auch Fragmentierung großer Biomolek{\"u}le geeignet sind. Um die Analyse von Zuckern mittels chromatographischer und massenspektrometrischer Methoden zu erleichtern, werden h{\"a}ufig Derivatisierungsreagenzien eingesetzt. Diese verringern die Polarit{\"a}t der Zucker und erleichtern die Detektion durch das Einbringen von Chromo- oder Fluorophoren. Zur Derivatisierung am reduzierenden Terminus von Glykanen und Zuckern eignen sich vor allem Aminierungsreagenzien oder Hydrazide. Hydrazide haben gegen{\"u}ber anderen Derivatisierungsreagenzien den Vorteil einer einfachen, salzfreien Umsetzung, aus der ein stabiles Derivat mit geschlossenem terminalen Zuckerring hervorgeht. F{\"u}r die vorliegende Arbeit wurde die Derivatisierung mit den neuen Hydrazid Reagenzien INH und BINH, sowie dem bereits von Dr. P. Kapkov{\´a} bearbeiteten BACH untersucht. Als Vergleich dienten die underivatisierten Kohlenhydrate, wie auch das standardm{\"a}ßig eingesetzte Aminierungsreagenz 2-AB. Dabei sollte das Ver-halten verschiedener Zucker und Glykane in Bezug auf chromatographische Trennung, Signalintensit{\"a}t und Fragmentierung analysiert werden. Zun{\"a}chst wurde die Umsetzung von Mono-, Di- und Trisacchariden mit den neuen Derivatisierungsreagenzien INH und BINH optimiert. Dadurch konnte bei beiden Substanzen die komplette Umsetzung der Zucker in ihre Derivate gew{\"a}hrleistet werden. Auch die Derivatisierung mit Hilfe der Mikrowelle konnte bei INH erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden. Auf diese Weise ließ sich die Reaktionszeit, im Vergleich zu den im Thermo-mixer® ben{\"o}tigten 90 Minuten, auf 20 Minuten verk{\"u}rzen. Aufgrund der großen Men-gen an Zucker und Derivatisierungsreagenz, die f{\"u}r die Umsetzung in der Mikrowelle n{\"o}tig sind, war der Versuch jedoch nur f{\"u}r INH geeignet. Im n{\"a}chsten Schritt wurde das Trennverhalten der verschiedenen Mono-, Di- und Tri-saccharid-Derivate auf RP-C18- und HILIC-Phasen untersucht. Bei den Monosaccha-riden konnte durch keines der Derivate eine vollst{\"a}ndige Trennung auf einer der Pha-sen erreicht werden. Das beste Ergebnis wurde durch INH auf der HILIC-S{\"a}ule erzielt, doch auch dort konnten die Epimere Glucose, Mannose und Galactose nicht vollst{\"a}n-dig separiert werden. Die Trennung der Disaccharide Maltose, Cellobiose und Lactose konnte auf der HILIC-Phase mit allen Derivaten außer BACH erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden, auf der RP-C18 erwies sich dagegen nur 2-AB als geeignet. Bei den Trisac-chariden 3'SLN und 6'SLN konnten sowohl underivatisierte Zucker, als auch s{\"a}mtliche Derivate mittels HILIC getrennt werden. Auch auf der C18-Phase war eine Trennung der BINH, BACH und 2-AB-Derivate m{\"o}glich. Des Weiteren konnte durch die Derivati-sierungen die Signalintensit{\"a}t gegen{\"u}ber den underivatisierten Zuckern deutlich gesteigert werden. Nach ihrer Trennung lassen sich massegleiche Di- und Trisaccharide anhand des Fragmentierungsmusters unterscheiden. W{\"a}hrend bei den underivatisierten Disaccha-riden Maltose, Cellobiose und Lactose die charakteristischen Fragmente nur schwach sichtbar waren, konnte mit Hilfe der Hydrazide INH, BINH und BACH die Differenzie-rung deutlich erleichtert werden. Die 2-AB-Derivatisierung zeigte dagegen keine Ver-besserung der Fragmentierungseigenschaften. Bei der Unterscheidung der Trisaccharide 3'SLN und 6'SLN waren ebenfalls sowohl underivatisierte, als auch Hydrazid-derivatisierte Zucker im Vorteil gegen{\"u}ber den 2-AB-Derivaten. Die Derivatisierung der N-Glykane von Ribonuclease B und Ovalbumin f{\"u}hrte bei der Analyse mittels MALDI-TOF zu einer deutlichen Steigerung der Sensitivit{\"a}t. Beispiels-weise ließen sich bei den Glykanen des Ovalbumins durch die Derivatisierungen drei zus{\"a}tzliche Strukturen im Vergleich zu den nativen Glykanen detektieren. Auch das Fragmentierungsverhalten der Glykane am MALDI-TOF/TOF konnte mit Hilfe der Derivatisierungen erheblich verbessert werden. Besonders die Umsetzung mit BINH f{\"u}hrte zu einer Vielzahl charakteristischer Ringfragmente, wodurch die Aufkl{\"a}rung der verschiedenen Glykanstrukturen deutlich vereinfacht wurde. Auch im Vergleich zu 2 AB zeigten die Hydrazid-Derivate sowohl bessere Fragmentierungseigenschaften, als auch eine einfachere Handhabung f{\"u}r die Messung mittels MALDI-MS. Eine weitere M{\"o}glichkeit zur Identifikation von Glykanstrukturen liegt in der spezifischen Bindung durch Lektine. Diese Untersuchung gibt des Weiteren auch einen Hinweis auf funktionelle Eigenschaften der Glykane. Daf{\"u}r wird die hohe Affinit{\"a}t von Biotin-haltigen Derivatisierungsreagenzien zu Avidin und Streptavidin genutzt. Nach der auf diese Weise erfolgten Immobilisierung der Glykane k{\"o}nnen diese mittels spezifischer Lektine nachgewiesen werden. Die Eignung des neuen Derivatisierungsreagen-zes BINH f{\"u}r diese Zwecke wurde anhand eines Glykan-Arrays getestet. Dadurch ließ sich best{\"a}tigen, dass BINH-derivatisierte Glykane und Zucker sowohl in der Lage sind an Streptavidin zu binden, als auch durch Lektine nachgewiesen werden k{\"o}nnen. Daher kann davon ausgegangen werden, dass BINH grunds{\"a}tzlich f{\"u}r den Einsatz in bio-chemischen Methoden geeignet ist. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass die Derivatisierung von Kohlenhydraten mit INH, BINH und BACH zu einer deutlichen Verbesserung der Trenn- und Fragmentierungseigenschaften f{\"u}hrten. Dadurch konnten Identifizierung und Strukturanalyse sowohl von kleinen Zuckern, als auch von Glykanen erleichtert werden. Im Vergleich zu dem Standard-Derivatisierungsreagenz 2-AB zeigten die Hydrazide nicht nur im Bereich der Fragmentierungen, sondern auch durch die einfachere Derivatisierungsreaktion wesentliche Vorteile.},
  subject      = {MALDI-MS},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Menzer2017,
  author    = {Menzer, Alexander},
  title     = {Massenspektrometrische Differenzierung bakterieller Infektionserreger mit dem Vitek MS-Routinetest-System (IVD)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-147355},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {Untersucht wurde die Performance des Vitek MS-Systems anhand eines Keimspektrums von 1357 Isolaten im Zeitraum von Oktober 2011 bis April 2014. Das untersuchte Kollektiv bestand aus Isolaten der mikrobiologischen Routinediagnostik (n=1173), aus Stammsammlungen des Nationalen Referenzzentrum f{\"u}r Meningokokken und Haemophilus influenzae (n=128), sowie offizieller Stammsammlungen wie ATCC, DSMZ, LSM und anderen (n=56). Die Ergebnisse wurden entweder mit einer bereits vorhandenen Stammbezeichnung oder durch eine bzw. Kombinationen mehrerer molekularbiologischer (PCR der Teilabschnitte von Haushaltsgenen: 16S-rRNA-Untereinheit, sodA, recA) oder biochemischen Differenzierungsmethoden (Vitek 2, API-Systeme) verglichen. Mangels Referenzergebnisses wurden 25 Isolate (etwa 1,8\%) aus der weiteren Betrachtung ausgeschlossen. Die verbliebenen 1332 Isolate wurden in 28 Bakterienordnungen, 109 Genera und 269 Spezies unterteilt. Auf Speziesebene konnten 1180 (etwa 88,6\%) zum Vergleich herangezogen werden, da durch die Referenzmethoden nicht immer eine zuverl{\"a}ssige Speziesdifferenzierung gelang. Diese Referenzergebnisse wurden mit den Ergebnissen des Vitek MS-Systems verglichen. Eine {\"U}bereinstimmung zeigte sich auf Genusebene bei 86\% (1157 von 1332 Isolaten) und auf Speziesebene bei 80\% (944 von 1180 speziesdifferenzierten Keimen) der ausgew{\"a}hlten St{\"a}mme. Im Vergleich der Korrelationen der Vitek MS-Identifikationen und den Referenzergebnissen zeigte sich eine durchgehend gute Korrelation innerhalb der unterteilten Bakterienordnungen. Davon abweichend war die Speziesdifferenzierung von Keimen der Ordnung Enterobacteriales. Die beste Korrelation erreichte die Ordnung Clostridiales. St{\"a}mme ohne entsprechendes, dokumentiertes Korrelat in der Vitek MS-Datenbank (n=62) wurden ebenfalls in die Betrachtung mit eingeschlossen. Bei 31 Isolaten konnte kein Ergebnis ermittelt werden, 21 wurden massenspektrometrisch dem gleichen Genus zugeordnet, 10 Genusdifferenzierungen wichen ab. 315 St{\"a}mme wurden sowohl im Standardverfahren durch Konjugation von 1µl Ready-to-use Matrix als auch mit einem zweistufigen S{\"a}ureextraktions- und Matrixkonjugationsverfahren gemessen und mit der solit{\"a}ren Konjugation der doppelten Matrixmenge verglichen. Die Abweichungen auf Genus- wie Speziesebene zwischen dem angewandten Standardprotokoll und den beiden anderen Verfahren waren deutlich signifikant. Im Vergleich der zweifachen Matrixmenge und dem zweistufigen Verfahren zeigte sich kein signifikanter Unterschied. Aufgrund der Ergebnisse scheint jedoch die S{\"a}ureextraktion Gram-positiver Kokken in der Genusdifferenzierung von Vorteil zu sein, sie erreichte jedoch kein ausreichendes Signifikanzniveau. Die Daten sprechen eher daf{\"u}r, eine Optimierung des Probe-Matrix-Verh{\"a}ltnisses anzustreben, zum Beispiel im Rahmen eines ausgedehnten Anwendertrainings.},
  subject      = {Bakterien / Taxonomie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Memmel2015,
  author    = {Memmel, Elisabeth},
  title     = {Vom Glycochip zur lebenden Zelle - Studien zu Infektions- und Tumor-relevanten Kohlenhydrat-Erkennungsprozessen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-115825},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen sind h{\"a}ufig entscheidend beteiligt an verschiedenen einer Infektion oder malignen Erkrankung zugrunde liegenden molekularen Erkennungs-prozessen, die zu Adh{\"a}sion, Zell-Zell-Interaktion sowie Immunreaktion und -toleranz f{\"u}hren. Trotz der hohen Relevanz f{\"u}r Diagnostik und Therapie dieser Erkrankungen sind die betreffenden Strukturen und Mechanismen bisher nur ungen{\"u}gend untersucht und verstanden. Ziel dieser stark interdisziplin{\"a}r angelegten Arbeit war es daher, Methoden der Fachbereiche Chemie und Pharmazie, Biologie und Medizin, aber auch Physik zu kombinieren, um Kohlenhydraterkennungsprozesse im Detail zu untersuchen und auf dieser Basis strukturell neuartige diagnostische und therapeutische Anwendungen zu entwerfen. Die hochkomplexe Zusammensetzung einer Zelloberfl{\"a}che wurde zun{\"a}chst auf ihren Glycan-anteil reduziert und stark vereinfacht auf der Oberfl{\"a}che sogenannter Glycochips imitiert. Die verwendeten Systeme auf Basis einer Gold- bzw. Glasoberfl{\"a}che erg{\"a}nzen sich optimal in ihrer Eignung f{\"u}r komplement{\"a}re analytische Methoden wie Massenspektrometrie sowie quantifizierbare Fluoreszenzspektroskopie. Der {\"U}bergang auf die lebende Zelloberfl{\"a}che gelang mit Hilfe des Metabolic Glyco-engineering, das die kovalente Pr{\"a}sentation definierter Motive durch eine Cycloaddition zwischen zwei bioorthogonalen Reaktionspartnern (z.B. Azid und Alkin) erm{\"o}glicht. Auf diese Weise wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Sauer (Universit{\"a}t W{\"u}rzburg) zun{\"a}chst die Dichte und Verteilung verschiedener Oberfl{\"a}chenglycane auf humanen Zellen mittels hochaufl{\"o}sender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) bestimmt. Diese Parameter zeigten im Modell des Glycochips einen entscheidenden Einfluss auf Bindungsereignisse und multivalente Erkennung und z{\"a}hlen auch auf nat{\"u}rlichen Zelloberfl{\"a}chen - in engem Zusammenhang mit der lateralen und temporalen Dynamik der Motive - zu den wichtigen Faktoren molekularer Erkennungsprozesse. Die gezielte Modifikation zellul{\"a}rer Oberfl{\"a}chenglycane eignet sich aber auch selbst als Methode zur Beeinflussung molekularer Wechselwirkungsprozesse. Dies wurde anhand des humanpathogenen Bakteriums S. aureus gezeigt, dessen Adh{\"a}sion auf Epithelzellen der Blasenwand durch Metabolic Glycoengineering partiell unterdr{\"u}ckt werden konnte. In einem erg{\"a}nzenden Projekt wurden zwei potentielle Metabolite eines konventionellen Antibiotikums - des Nitroxolins - mit bakteriostatischer sowie antiadh{\"a}siver Wirksamkeit dargestellt. Diese dienten als Referenzsubstanzen zur Verifizierung der postulierten Struktur der Derivate, werden aber auch selbst auf ihr Wirkprofil hin untersucht. Gleichzeitig stehen sie zusammen mit der Grundverbindung zudem als Referenz f{\"u}r die Wirkst{\"a}rke potentieller neu entwickelter Antiadh{\"a}siva zur Verf{\"u}gung.},
  subject      = {Microarray},
  language  = {de}
}