@phdthesis{Hess2003,
  author    = {Hess, Petra},
  title     = {Genetische und molekularbiologische Analyse von fim Determinanten bei Citrobacter freundii und Escherichia coli},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7635},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Citrobacter freundii sind Gram-negative, bewegliche, st{\"a}bchenf{\"o}rmige Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Als opportunistischer Erreger kann C. freundii beispielsweise Harnwegsinfektionen und Neugeborenen-Meningitis verursachen. Die Internalisierung von C. freundii 3009 in das Endosom von Harnblasenepithelzellen (T24) erfolgt in vitro {\"u}ber einen ausschließlich Mikrotubuli-abh{\"a}ngigen Mechanismus. Als genetische Grundlage der Invasionskompetenz von C. freundii 3009 wurde in Vorarbeiten eine im Chromosom lokalisierte Invasionsdeterminante identifiziert, die eine hohe Identit{\"a}t zum Typ 1 Fimbrien Gencluster (fim) von Salmonella enterica serovar Typhimurium aufweist. Diese in Plasmid pTO3 klonierte Invasionsdeterminante vermittelt nicht-invasiven E. coli K12 St{\"a}mmen Invasivit{\"a}t. Im Gegensatz dazu sind rekombinante E. coli K12 Klone, die das fim Operon aus S. enterica serovar Typhimurium bzw. E. coli oder andere E. coli Adh{\"a}sindeterminanten tragen, nicht invasiv. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die f{\"u}r die Invasionsf{\"a}higkeit von C. freundii 3009 essentiellen Gene der klonierten Invasionsdeterminante ermittelt. Dies geschah zum einen durch Subklonierung von Teilen des Plasmids pTO3. In anschließenden Invasionsassays wurden die entsprechenden E. coli K12 Klone hinsichtlich ihrer F{\"a}higkeit zur Invasion untersucht. Die Internalisierung des Wildtyps C. freundii 3009 sowie der invasiven rekombinanten E. coli K12 St{\"a}mme konnte nicht nur, wie erwartet, mittels Mannose, sondern auch mittels Chitinhydrolysat [(GlcNAc)n] inhibiert werden. Zum anderen wurden C. freundii Wildtypmutanten konstruiert, in denen der zentrale Teil der Invasionsdeterminante deletiert ist. Diese chromosomalen Deletionsmutanten weisen im Vergleich zum Wildtyp 3009 eine deutlich reduzierte Invasionsrate in die humane Harnblasenepithelzellinie T24 auf. F{\"u}r die Komplementante wurde die Wiederherstellung des invasiven Ph{\"a}notyps demonstriert. Dar{\"u}ber hinaus ist bekannt, dass C. freundii 3009 in humane mikrovaskul{\"a}re Endothelzellen aus dem Gehirn (HBMEC) eindringen und dort replizieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sowohl C. freundii 3009 als auch der, die fimCf Determinante tragende, rekombinante E. coli Stamm HB101pPH1 in der Lage sind, im Tiermodell mit neugeborenen Ratten die Blut-Hirn-Schranke zu {\"u}berwinden. Neben der Analyse der Funktion der klonierten C. freundii 3009 fim Determinante in Invasionsassays und mittels Mannose-sensitiver Hefeagglutination, wurden die Genprodukte selbst ebenfalls nachgewiesen. Durch radioaktive Markierung der f{\"u}r die Invasivit{\"a}t essentiellen Proteine nach induzierter Transkription in einem T7 Phagenexpressionssystem konnten die Molekulargewichte von FimCfA, FimCfD, FimCfF und FimCfH ermittelt werden. Diese stimmen mit den von der DNA Sequenz abgeleiteten Molekulargewichten gut {\"u}berein. Sowohl mit C. freundii 3009 als auch mit entsprechenden rekombinanten E. coli K12 St{\"a}mmen gelang es in Westernblots, das Adh{\"a}sin FimCfH an der Bakterienoberfl{\"a}che nachzuweisen. Dies konnte auch f{\"u}r FimCfF in denselben rekombinanten E. coli K12 St{\"a}mmen gezeigt werden. Allerdings scheinen die FimCf Proteine nicht zu einem Pilus assembliert zu werden, da in elektronenmikroskopischen Untersuchungen von C. freundii 3009 oder die fimCf Determinante tragenden E. coli K12 St{\"a}mmen niemals Fimbrien beobachtet werden konnten. Da auch bestimmte Typ 1 Fimbrien Varianten aus E. coli {\"u}ber das Adh{\"a}sin FimEcH die Internalisierung der Bakterien in Blasenepithelzellen zu induzieren verm{\"o}gen, wurden die fimEc Gencluster aus den beiden human pathogenen E. coli St{\"a}mmen 536 (uropathogenes Isolat) und IHE3034 (Neugeborenen-Meningitis Isolat) kloniert. Zudem wurde die Invasionsf{\"a}higkeit des E. coli K1 Stamms IHE3034 und der fim negativen Insertionsmutante IHE3034-2 charakterisiert. Typ 1 Fimbrien werden als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli (UPEC) angesehen. Trotzdem konnte eine Reihe von klinischen UPEC Isolaten identifiziert werden, die diesen Adh{\"a}sintyp nicht mehr exprimieren. Genetische Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit ergaben, dass in 11 Isolaten das fimEc Operon vollst{\"a}ndig aus dem Chromosom der Bakterien deletiert ist. In den {\"u}brigen 6 Isolaten ist noch ein Teil des 3´-Endes des Gens fimECH vorhanden. Außerdem ist in die Deletionsstelle dieser 6 Isolate ein IS1 Element von E. coli inseriert. In den {\"u}brigen uropathogenen Isolaten sind auch angrenzende DNA Bereiche von der Deletion betroffen. Abschließend kann festgestellt werden, dass eine fim {\"a}hnliche Determinante in C. freundii 3009 als Invasionssystem fungiert. Die Typ 1 Fimbrien der E. coli St{\"a}mme 536 und IHE3034 sind zwar notwendig, aber nicht hinreichend f{\"u}r die Invasivit{\"a}t. Obwohl Typ 1 Fimbrien als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli gelten, ist dennoch in einer Reihe von klinischen UPEC Isolaten das fimEc Operon deletiert.},
  subject      = {Citrobacter freundii},
  language  = {de}
}