@phdthesis{Popp2004,
  author    = {Popp, Christian},
  title     = {Identifizierung von Aminos{\"a}uren als Teile der Substratbindungstasche des Kationentransporters 1 der Ratte (rOCT1) und Interaktion des rOCT2 mit der schwachen Base Chinin},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12349},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Zusammenfassungen 83 5 Zusammenfassungen 5.1 Zusammenfassung Durch Expressionsklonierung wurde 1994 der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Ratte isoliert (Gr{\"u}ndemann et al., 1994). 1999 wurde eine Aminos{\"a}ure in der 11. Transmembrandom{\"a}ne von rOCT1 entdeckt, welche Teil der Substratbindungstasche dieses Transporters war (Gorboulev et al., 1999). Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es weitere funktionell relevante Aminos{\"a}uren zu identifizieren. Ein Vergleich der „Helical Wheels" aller 12 hypothetischen Transmembrandom{\"a}nen zeigte eine Akkumulation von 5 OCT und OCTN spezifischen Aminos{\"a}uren in der vierten Transmembrandom{\"a}ne auf einer Seite. Bei diesen Aminos{\"a}uren handelte es sich um K215, W218, Y222, T226 und V229. Es wurden verschiedene Punktmutationen an diesen Positionen eingef{\"u}hrt. Es zeigte sich mit Hilfe radioaktiv markierter Substrate von rOCT1, dass selbst Substitutionen durch strukturell verwandte Aminos{\"a}uren bei den flankieren Aminos{\"a}uren zu einem Ausfall des rOCT1 vermittelten Substrattransport f{\"u}hrte. Weiterhin schien an Position 218 f{\"u}r den rOCT1- vermittelten Transport von TEA eine aromatische Aminos{\"a}ure von großer funktioneller Relevanz zu sein. Wir vermuten hier eine Kationen p-Elektronen Interaktion des aromatischen Ringsystems des Tryptophans mit der positiven Ladung des TEA. Versuche mit den Mutanten des Tyrosins 222 zeigten ebenfalls {\"A}nderungen bei den Transportraten und Affinit{\"a}ten verschiedener Substrate. Eine Kationen-p Interaktion konnte ausgeschlossen werden, jedoch war die Affinit{\"a}t der Mutante Y222F zum TPeA um einen Faktor 20 gegen{\"u}ber dem Wildtyp erh{\"o}ht. Weiterf{\"u}hrende Untersuchungen mit der Zwei- Elektrodenspannungsklemme zeigten unterschiedliche Affinit{\"a}ten des TPeA zum Wildtyp im Vergleich zum mutierten Protein in seiner nach außen bzw. nach innen gerichteten Konformation. War die Form der Inhibierung des TEA-induzierten Stromes durch TPeA beim Wildtyp kompetitiv, so zeigte sie bei der Mutante einen nicht-kompetitiven Charakter. Die Mutante T226A zeigte ebenfalls {\"A}nderungen in Affinit{\"a}t und Selektivit{\"a}t. Bei allen transportierenden Mutanten zeigte sich, dass der Transport von MPP nicht oder kaum ver{\"a}ndert war, hingegen wurden sehr starke {\"A}nderungen der Transportcharakteristika von TEA gefunden, was auf verschiedene Substratbindungsstellen in rOCT1 hinweist. Diese Versuche zeigen deutlich die funktionelle Relevanz und die Beteiligung der mutierten Aminos{\"a}urepositionen an der Substratbindetasche von rOCT1. In Versuchen, in welchen Chinin als Inhibitor des rOCT2 vermittelten Transports genutzt wurde, passierte Chinin mittels Diffusion in seiner ungeladenen Form die Oozytenmembran und hemmte rOCT2 von der Innenseite. Dies k{\"o}nnte der Grund f{\"u}r die nicht-kompetitive Form der Inhibition der TEA-Aufnahme durch Chinin sein. Diese Versuche wurden dadurch best{\"a}tigt, dass die protonierte Form des Chinins eine kompetitive Form der Inhibition zeigte und den Transporter von außen hemmte.},
  subject      = {Ratte},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Sturm2007,
  author    = {Sturm, Alexander},
  title     = {Identifikation zweier f{\"u}r Regulation, Substratspezifit{\"a}t und Transportgeschwindigkeit bedeutsamer Cysteine des organischen Kationentransporters rOCT1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25717},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Zur SLC22-Genfamilie von Karnitin- und organischen Ionentransportern geh{\"o}ren u. a. auch die organischen Kationentransporter der Ratte rOCT1 und rOCT2 sowie deren humane Analoga. Diese funtionell bereits gut charakterisierten Proteine werden in verschiedenen Geweben exprimiert und transportieren endogene und pharmakologisch relevante Substanzen. Die Aufkl{\"a}rung des Transportmechanismus und der Regulation sind Gegenstand intensiver Forschungsbem{\"u}hungen. In dieser Arbeit wurde durch elekrophysiologische Methoden, die modifiziert auch zur Messung von Membrankapazit{\"a}ten und des Strom-Teilchen-Aufnahmeverh{\"a}ltnisses (CFR) eingesetzt wurden, der Effekt des ungeladenen, membranpermeablen SH-Gruppenregenz MMTS auf den in Xenopus laevis-Oozyten exprimierten rOCT1 untersucht. Durch MMTS kam es zu einer Aktivierung von substratinduzierten Str{\"o}men und Kapazit{\"a}ts{\"a}nderungen, einer unterschiedlichen Ver{\"a}nderung von Substrat- und Inhibitoraffinit{\"a}ten sowie einer Zunahme der absoluten Oozytenmembrankapazit{\"a}t. Die CFR und die Spannungsabh{\"a}ngigkeit {\"a}nderten sich nicht. An rOCT2 konnten teils gleich-, teils gegensinnige Ver{\"a}nderungen nach MMTS-Exposition gezeigt werden. Diese Ph{\"a}nomene k{\"o}nnen am ehesten durch eine Konformations{\"a}nderung der polyvalenten Substratbindungsregion, einen verst{\"a}rken Membraneinbau der Transportermolek{\"u}le und eine gesteigerte Transportrate des Einzeltransporters erkl{\"a}rt werden. Durch die Untersuchung von Mutanten konnten die Cysteine 322 und 451 als essentiell f{\"u}r den MMTS-Effekt identifiziert werden. Die Daten deuten darauf hin, dass die Modifikation dieser Cysteine f{\"u}r die Effekte zwingend erforderlich ist. M{\"o}glicherweise ist aber ein Xenopus-eigenes Regulatorprotein an der Entstehung der Effekte beteiligt, welches in die entsprechenden Proteinregionen des rOCT1 eingreift. Mit der Identifikation von Cystein 451 konnte ein weiterer Beweis f{\"u}r die wichtige Bedeutung der 10. Transmembrandom{\"a}ne erbracht werden. Mit dem Cystein 322 wurde eine weitere wichtige Aminos{\"a}ure f{\"u}r die Funktion und m{\"o}glicherweise auch die Regulation von rOCT1 identifiziert.},
  subject      = {Kationentransporter},
  language  = {de}
}