@phdthesis{Leimeister1999,
  author    = {Leimeister, Cornelia},
  title     = {Identifizierung und Charakterisierung von Genen f{\"u}r die Entwicklung der Nieren und des Urogenitalsystems},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1690},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {1999},
  abstract  = {Das Studium der Nierenentwicklung gibt Einblicke in generelle entwicklungsbiologische Prozesse wie induktive Wechselwirkungen, mesenchymale Kondensation, mesenchymale-epitheliale Umformung, Determinierung von Zellschicksal sowie Differenzierung und damit auch in die Entstehung congenitaler Fehlbildungen. Nach Induktion durch die Ureterknospe entstehen aus dem metanephrogenen Mesenchym die funktionellen Einheiten der Niere - die Nephrone - und das Nierenstroma. Diesen morphogenetischen Prozessen liegen komplexe regulatorische Ver{\"a}nderungen in der Genexpression zugrunde, die bislang nicht im Detail aufgekl{\"a}rt sind. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Identifizierung bekannter und insbesondere neuer Gene, die durch Induktion im metanephrogenen Mesenchym reguliert werden. Mit Hilfe der ddPCR und Transfilter-Organkulturen wurde die Genexpression von induziertem versus nicht-induziertem Mesenchym aus M{\"a}use-Nierenanlagen untersucht. Einzelne Kandidaten wurden auf differenzielle Expression durch Northern Blot Analyse {\"u}berpr{\"u}ft und f{\"u}r die weitere Charakterisierung ausgew{\"a}hlt. Als eines der bekannten Gene wurde sFRP2 als im metanephrogenen Mesenchym induziert best{\"a}tigt und durch in situ Hybridisierung ganzer M{\"a}useembryonen und Paraffinschnitte n{\"a}her untersucht. Es zeigt eine spezifische und dynamische Expression w{\"a}hrend der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe, die mit den Expressionsmustern von sFRP1 und sFRP4 verglichen wurde. Die detailierte Genexpressionsanalyse der sFRP-Familie in der murinen Embryonalentwicklung sollte als Grundlage f{\"u}r funktionelle Studien dieser erst k{\"u}rzlich entdeckten neuen Genfamilie dienen. Erste Untersuchungen der ddPCR-Produkte C0-5, J6-3 und M2-4 zeigten, daß es sich um neue Gene handelt, die unterschiedliche Expressionsmuster in der Niere zeigen. W{\"a}hrend C0-5 dynamisch in Epithelzellen von Ureter und Nephronvorl{\"a}ufern exprimiert ist, markiert J6-3 Stromazellen und M2-4 ist bereits im kondensierenden Mesenchym, sp{\"a}ter aber auch in den epithelialen Derivaten nachweisbar. Die Isolierung und Analyse der dem C0-5-ddPCR-Fragment entsprechenden cDNA zeigte, daß sie f{\"u}r ein kollagenartiges Protein codiert, welches beim Menschen in der N{\"a}he des EWS-Gens auf Chromosom 22q12 liegt. Dar{\"u}ber hinaus wurde eine neue zu hairy und dem E(spl)-Komplex verwandte Genfamile identifiziert. Aufgrund ihrer Verwandtschaft und einem charakteristischen YRPW-Tetrapeptid wurden sie als Hey-Gene bezeichnet f{\"u}r: "hairy- und E(spl)-verwandt mit YRPW-Motiv". Sie zeigen gegen{\"u}ber hairy/E(spl) oder den entsprechenden Vertebraten-Homologen der Hes-Genfamilie ver{\"a}nderte DNA- und Protein-Bindungseigenschaften. Dar{\"u}ber hinaus korrelieren ihre Expressionsmuster h{\"a}ufig mit Genen des Delta-Notch-Signaltransduktionsweg, was auf eine Beteiligung der Hey-Gene an Zelldeterminierung und Bildung von Zellgrenzen hinweist. Diese Vermutung konnte durch die Analyse von Dll1-Knockout-M{\"a}usen f{\"u}r die Somitogenese ansatzweise best{\"a}tigt werden. Die Kombination von Transfilter-Organkultur mit ddPCR erwies sich als geeignet, um transkriptionell regulierte Gene des metanephrogenen Mesenchyms zu identifizieren. Expressions- und Sequenzanalyse vor allem der neuen Gene deutet auf ihre Beteiligung an der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe hin, die nun im Einzelnen untersucht werden muß. Mehr als 50 weitere Kandidaten f{\"u}r neue Gene bilden eine breite Basis zur weiteren Erforschung molekularer Grundlagen der Nierenentwicklung.},
  subject      = {Niere},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Daniels1999,
  author    = {Daniels, Justin John Douglas},
  title     = {Interaction of Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes with the murine host},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1073},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {1999},
  abstract  = {Food borne pathogens that cause systemic disease must cross the intestinal barrier. Many of these pathogens, eg Salmonella typhimurium and Shigella flexneri, use M cells, found only within the follicle associated epithelium (FAE) that overlies Peyer's patches and other lymphoid follicles, to enter the host. This study is primarily an investigation into the interaction of S. typhimurium and Listeria monocytogenes with the intestinal epithelium, representing the early stage of an infection.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Pei2000,
  author    = {Pei, Geng},
  title     = {The Role of Raf-mediated Signalling Pathways for Motoneuron},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1846},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schaefer2000,
  author    = {Sch{\"a}fer, Rolf},
  title     = {Aktivierung von Caspasen in AKR-2B Mausfibroblasten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1950},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivit{\"a}ten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. W{\"a}hrend des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die {\"u}berlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand f{\"u}r mindestens weitere 48h unbeeinflußt, ben{\"o}tigen aber zum {\"U}berleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt f{\"u}r eine Apoptose typische morphologische Ver{\"a}nderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller f{\"u}r den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivit{\"a}t bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivit{\"a}ten lieferte Hinweise zur Identit{\"a}t der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivit{\"a}t wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivit{\"a}ten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivit{\"a}t wird zum gr{\"o}ßten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinit{\"a}tsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine w{\"a}hrend des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivit{\"a}t bietet die beste Grundlage f{\"u}r eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt f{\"u}r den mitochondrial-vermittelten Weg, f{\"u}r dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase f{\"u}hrt, ist Ziel gegenw{\"a}rtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, sch{\"u}tzen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identit{\"a}t dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es m{\"o}glicherweise dieser Weg, der zum {\"U}berleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten w{\"a}hrend des Serumentzugs wesentlich beitr{\"a}gt.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Thumbs2000,
  author    = {Thumbs, Alexander},
  title     = {Modulation der Immunglobulinproduktion bei Ratten mit CD28-spezifischen monoklonalen Antik{\"o}rpern},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180774},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Einer der wichigsten co-stimulatorischen Rezeptoren auf T-Zellen ist CD28. In Abh{\"a}ngigkeit vom TZR-Signal nimmt CD28 Einfluss auf die Th1/Th2-Differenzierung der Immunantwort. Die rattenspezifischen mAk JJ316 und JJ319 binden an das CD28-Molek{\"u}l und haben beide ein gleich starkes co-stimulatorisches Potential. Gabe des mitogenen CD28-spezifischen mAkJJ316 - und nicht des konventionellen mAk JJ319 - f{\"u}hrt auch ohne TZR-Signal in vitro zu Produktion und Proliferation der Zellen (Direkte Stimulation). In vivo f{\"u}hrt Gabe von JJ316 zu einer Erh{\"o}hung der Zellzahl in Milz und Lymphknoten mit einem Maximum nach drei Tagen. In vitro f{\"u}hrte Behandlung mi mAk JJ316 zu einem Anstieg Th2-spezifischer Immunglobuline. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Gabes des mitogenen CD28-spezifischen mAk JJ316 im Vergleich mit dem konventionellen CD28-spezifischen mAk JJ319 auch in vivo zu einer Erh{\"o}hung der Th2-spezifischen Immunglobuline (IgG1, IgG2a, IgE) bei Brown-Norway- und Lewis-Ratten f{\"u}hrt.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schuh2001,
  author    = {Schuh, Kai},
  title     = {Erzeugung und Analyse NF-ATp-defizienter M{\"a}use},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-117},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Ziel dieser Arbeit war es, NF-AT1-Gen-defiziente Mauslinien zu erzeugen und die Folgen dieser genetischen Manipulation in vivo zu untersuchen. Die Untersuchung sollte die durch die Gendefizienz erwarteten M{\"a}ngel w{\"a}hrend der Entwicklung (Embryogenese) und, im Besonderen, die Auswirkungen auf das Immunsytem und die Entwicklung und Differenzierung der T-Zellen aufzeigen. Zur Untersuchung der genomischen Organisation des Maus-NF-AT1-Gens wurde eine genomische l-Phagen-DNA-Bibliothek "gescreent" (durchgef{\"u}hrt von Dr. E. Jankevics, Universit{\"a}t von Riga, Lettland), die entsprechenden l-Phagen, die das NF-AT1-Gen enthielten, isoliert und die DNA pr{\"a}pariert. Nach Analyse der klonierten Phagen (Subklonierung und Sequenzierung) wurde eine Restriktionskarte der entsprechenden Bereiche erstellt und der "targeting-vector" erstellt. Der "targeting-vector" wurde durch Elektroporation in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) eingebracht und die Integration in das Genom ("Homologe Rekombination") durch Southern Blotting- bzw. PCR-Analyse untersucht. Manipulierte ES-Zellklone wurden in C57Bl/6-Blastozysten injiziert, diese in scheinschwangere Ammentiere transferiert und die Nachkommen nach Geburt anhand der Fellfarben klassifiziert. Nachkommen mit einem hohen Anteil hellen Fells wurden mit C57 Bl/6-Tieren verpaart und die Integration des manipulierten Zellklons in die Keimbahn wurde anhand der wildtypischen Fellfarbe und Genotypisierung nachgewiesen. Bez{\"u}glich des manipulierten NF-ATp-Gens heterozygote F1-Tiere wurden miteinander verpaart, um eine homozygote NF-ATp-defiziente M{\"a}use zu erhalten. Die Deletion des NF-ATp-Proteins wurde durch in Western-Blotting-Experimenten und EMSAs ("electrophoretic mobility shift assays") nachgewiesen. Die NF-ATp-/--Tiere zeigten keine augenscheinlichen Ver{\"a}nderungen w{\"a}hrend der Entwicklung und, bei jungen Tieren, keine offensichtlichen Ver{\"a}nderungen bei der Entwicklung des Immunsystems. In {\"a}lteren Tieren (> 6 Wochen) war eine Hyperproliferation der Zellen des Immunsystems zu beobachten, was mit einer Splenomegalie, einer verst{\"a}rkten Bildung von Keimzentren in lymphatischen Organen, vergr{\"o}ßerten Lymphknoten und einer verlangsamten Involution des Thymus einherging. Weitergehende Untersuchungen der Ursache dieser hyperproliferativen Erkrankung offenbarten eine verminderte klonale Deletion nach Aktivierung. Die Ursachen dieses {\"u}berraschenden Effekts sind wahrscheinlich vielf{\"a}ltig, da NF-AT-Faktoren an der Regulation der Expression vieler Gene beteiligt sind, u.a. des Apoptose-assoziierten CD95-Liganden. Da sich bez{\"u}glich der IL-2-Expression keine Unterschiede zwischen NF-ATp-defizienten Tieren und Kontrollen zeigten, jedoch eine erh{\"o}hte IL-2-Konzentration im Medium kultivierter NF-ATp-defizienter T-Zellen beobachtet wurde, wurde die Bindung von NF-ATp an putative NF-AT-Bindungssequenzen des CD25-Promotors, die transkriptionelle Aktivierung des Promotors mittels Luciferase-Assays und die Expression der IL-2R-alpha-Kette (CD25) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß (1.) NF-ATp an zwei Regionen des CD25-Promotors bindet, (2.) der CD25-Promotor durch NF-ATp transkriptionell stark stimuliert wird und (3.) T-Zellen NF-ATp-defizienter Tiere nach Stimulation eine verminderte CD25-Expression zeigen. In NF-ATp-defizienten Tieren war die Expression von CD25 moderat reduziert, was eine Erkl{\"a}rung f{\"u}r den abgeschw{\"a}chten Ph{\"a}notyp dieser Tiere - im Vergleich zu IL-2- oder CD25-defizienten Tieren - sein kann. Die hyperproliferativen Erkrankungen dieser verschiedenen Mauslinien weisen auf eine Beteiligung der NF-AT-/IL-2-/IL-2R-Signalwege nicht nur w{\"a}hrend der T-Zell-Aktivierung hin, sondern auch auf eine Beteiligung an Signalwegen, die zur anschließenden Inaktivierung und Apoptose der T-Lymphozyten n{\"o}tig sind.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Engelhardt2001,
  author    = {Engelhardt, Stefan},
  title     = {Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181950},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte {\"U}berexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener M{\"a}use konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. {\"U}ber einen Zeitraum von mehreren Monaten f{\"u}hrte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem {\"a}hnlichen Ph{\"a}nomen: Durch deutlich erh{\"o}hte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese sch{\"a}dlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalit{\"a}t f{\"u}hrt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivit{\"a}t in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivit{\"a}t aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies k{\"o}nnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivit{\"a}t des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdr{\"u}ckten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Ph{\"a}notypen f{\"u}hrt, wurden verschiedene intrazellul{\"a}re Signalwege auf ihre Aktivierung hin {\"u}berpr{\"u}ft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) f{\"u}hrt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen k{\"o}nnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erkl{\"a}ren. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufkl{\"a}rung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellul{\"a}ren Calcium-hom{\"o}ostase. Als fr{\"u}heste funktionelle Ver{\"a}nderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine St{\"o}rung des intrazellul{\"a}ren Calciumtransienten auf. Als m{\"o}glicher Mechanismus f{\"u}r die St{\"o}rung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende ver{\"a}nderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz f{\"u}r die Therapie der Herzinsuffizienz k{\"o}nnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdr{\"u}cken kann.},
  subject      = {Beta-Rezeptor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Brede2001,
  author    = {Brede, Marc},
  title     = {Kardiovaskul{\"a}re Ph{\"a}notypisierung von Angiotensin II AT2-Rezeptor- und adrenergen Rezeptor-"Knockout"-M{\"a}usen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1179726},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Die Deletion des AT2-Rezeptors (AT2-KO) f{\"u}hrt zu erh{\"o}hter Blutdruckempfindlichkeit und vaskul{\"a}rer Hypertrophie durch Aktivit{\"a}tszunahhme der P70S6-Kinase. Die Vasodilatation von Blutgef{\"a}ßen wird maßgeblich durch beta1-adrenerge Rezeptoren vermittelt. Die Deletion von alpha2-adrenergen Rezeptoren (alpha2-KO) f{\"u}hrt zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz nach Aortenstenose. Der Mortalit{\"a}tanstieg ist mit erh{\"o}hten Plasmanoradrenalin-Spiegeln (a2A-KO), bzw. Plasmaadrenalin-Spiegeln (a2C-KO) assoziiert.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{GrosseWilde2001,
  author    = {Große-Wilde, Anne},
  title     = {Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors f{\"u}r TRAIL (mTRAIL-R)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-559},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie geh{\"o}ren. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten prim{\"a}ren Zellen resistent gegen{\"u}ber TRAIL sind. In pr{\"a}klinischen Studien mit M{\"a}usen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizit{\"a}t von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben betr{\"a}chtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. {\"U}ber die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in M{\"a}usen zu etablieren. Zun{\"a}chst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch {\"u}ber 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach {\"U}berexpression Caspase-abh{\"a}ngig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein l{\"o}sliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu k{\"o}nnen, sollten mTRAIL-R-defiziente M{\"a}use generiert werden. Zur Modifikation des f{\"u}r p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalit{\"a}t oder sekund{\"a}re kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente M{\"a}use hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie l{\"o}sliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente M{\"a}use, k{\"o}nnen nun in vivo f{\"u}r die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Meisenzahl2001,
  author    = {Meisenzahl, Christina},
  title     = {Regulation der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase durch Interferon in retinalen Pigmentepithelzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180452},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, f{\"u}hren in vielen F{\"a}llen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod f{\"u}hren, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage f{\"u}r den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei f{\"u}r die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen prim{\"a}ren RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma {\"u}ber die Nachweisgrenze zu erh{\"o}hen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. F{\"u}r die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR {\"u}bergegangen. W{\"a}hrend Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie w{\"a}hrend der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin geh{\"o}ren, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer origin{\"a}ren retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung h{\"a}ufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivit{\"a}t extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ebinger2002,
  author    = {Ebinger, Martin},
  title     = {Histologie und Funktion der Kniegelenksinnervation der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3745},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Die Kniegelenksinnervation von 6 M{\"a}usen wurde elektronenmikroskopisch untersucht. Der Mediale Artikul{\"a}re Nerv (MAN) enthielt durchschnittlich 75 Nervenfasern, 63 unmyelinisierte und 12 myelinisierte (Durchmesser 1 bis 8 µm, Maximum zwischen 2 und 5 µm). Der Posteriore Artikul{\"a}re Nerv (PAN) bestand durchschnittlich aus 195 Nervenfasern, 129 unmyelinisierte und 66 myelinisierte (Durchmesser zwischen 1 und 12 µm, Maximum bei 4 bis 5 µm). Diese Daten sprechen f{\"u}r eine weitgehende histologische Vergleichbarkeit der Kniegelenksinnervation bei Maus, Ratte und Katze. Lediglich die Anzahl der Nervenfasern ist bei der im Verh{\"a}ltnis kleineren Maus geringer. Spinalganglienzellen von 10 M{\"a}usen wurden mittels hypoosmolarer L{\"o}sung gedehnt. Schwankungen der intrazellul{\"a}ren Kalzium-Konzentrationen und elektrophysiologische Ver{\"a}nderungen wurden dabei registriert (Calcium-Imaging und Patch-Clamp). Die prim{\"a}r sensorischen Neuronen, die nicht an der Kniegelenksinnervation beteiligt waren, konnten in schnell, langsam und nicht reagierende Subpopulationen unterteilt werden. Die Beobachtungen an den retrograd markierten Kniegelnksafferenzen erlaubten eine solche Differenzierung nicht. Die Reizung mit Capsaicin zeigte, dass es sich bei den mechanosensitiven Kniegelenksafferenzen selten um polymodale Nozizeptoren handelte.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Chan2002,
  author    = {Chan, Gordon},
  title     = {The Role of Vav-1, Vav-2 and Lsc in NK T cell development and NK cell cytotoxicity},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3645},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {The hematopoietic-specific Rho-family GTP exchange factor (GEF) Vav-1 is a regulator of lymphocyte antigen receptor signaling and mediates normal maturation and activation of B and T cells. Recent findings suggest that Vav-1 also forms part of signaling pathways required for natural and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of human NK cells. In this study, I show that Vav-1 is also expressed in murine NK cells. Vav-1-/- mice had normal numbers of splenic NK cells, and these displayed a similar expression profile of NK cell receptors as cells from wild type mice. Unexpectedly, IL-2-activated Vav-1-/- NK cells retained normal ADCC. Fc-receptor mediated activation of ERK, JNK, and p38 was also normal. In contrast, Vav-1-/- NK cells exhibited reduced natural cytotoxicity against EL4, C4.4.25, RMA and RMA/S. Together, these results demonstrate that Vav-1 is dispensable for mainstream NK cell development, but is required for NK cell natural cytotoxicity. Vav-2, a protein homologous to Vav-1 has also been implicated in NK cell functions. However, NK cells from Vav-2-/- mice have normal cytotoxic activities and NK cells that lack both Vav-1 and Vav-2 exhibit similar defect as Vav-1-/- cells. Thus Vav-2 has no apparent function in the development and the activation of NK cells. Although NK cell development is normal in Vav-1-/- mice, their numbers of NKT cells were dramatically diminished. Furthermore, NKT cells from Vav-1 mutant mice failed to produce IL-4 and IFNg following in vivo CD3 stimulation. A similar loss of NKT cells was observed in Vav-1-/-Vav-2-/- mice, but not in Vav-2-/- mice, suggesting that only Vav-1, and not Vav-2, is an essential regulator of NKT cell development and NK cell cytotoxicity. Similar to Vav-1, Lsc is a Rho GEF that is expressed specifically in the hematopoietic system. It contains a regulator of G-protein signaling (RGS) domain which negatively regulates the Ga12 and Ga13 subunits of G-protein coupled receptors (GPCRs). This study shows that NK and NKT cell development are normal in Lsc-/- mice. However, NK cells from mutant mice display enhanced cytotoxic responses towards a panel of tumor cells. These data implicate for the first time a RGS-containing Rho GEF in cytotoxic responses and suggest that Lsc down-modulate NK cell activation.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Harder2002,
  author    = {Harder, Friedrich},
  title     = {Untersuchungen zum in vivo Differenzierungspotenzial muriner und humaner h{\"a}matopoetischer sowie muriner neuraler Stammzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4214},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Zusammenfassung Im Zuge der S{\"a}ugerentwicklung entsteht aus der totipotenten Eizelle ein Organismus aus mehr als 200 verschiedenen Zelltypen. Dabei wird die Entwicklung und der Erhalt des Tieres von Stammzellen gew{\"a}hrleistet. W{\"a}hrend der Embryonalentwicklung gibt es nur transient vorkommende Stammzelltypen, w{\"a}hrend der adulte K{\"o}rper die Homoeostase mittels permanent vorhandener somatischer Stammzellen aufrechterh{\"a}lt. Als kennzeichnend f{\"u}r die somatischen Stammzellen galt, dass sie nur die Zellen ihres Gewebes ersetzen k{\"o}nnen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob SSZ tats{\"a}chlich auf die Bildung von Zellen ihres Stammzellkompartiments beschr{\"a}nkt sind. Dazu wurden drei verschiedene Stammzelltypen, murine h{\"a}matopoetische und humane HSZ sowie murine NSZ in murine Pr{\"a}implantationsblastozysten injiziert. Da dies die Zellen mit einer Umgebung exponiert, von der die Bildung aller Zelltypen des erwachsenen Tieres ausgeht. Es konnte gezeigt werden, dass zur Mitte der Schwangerschaft Nachkommen aller drei injizierten Stammzelltypen sich pr{\"a}ferentiell in den f{\"o}talen h{\"a}matopoetischen Geweben befinden. F{\"u}r humane h{\"a}matopoetische und murine NSZ wurde gezeigt, dass diese h{\"a}matopoetische Vorl{\"a}ufer in h{\"a}matopoetischen Geweben der Embryonen bilden, sowie dass Nachkommen dieser Zellen ein erythroides Genexpressionsmuster aktivieren. Der Vergleich adulter chim{\"a}rer Tiere zeigte, dass HSZ zu nahezu gleichen Teilen neurale und h{\"a}matopoetische Gewebe besiedelt hatten. Nachkommen neuraler Stammzellen dagegen vor allem in neuralen Geweben adulter Tiere gefunden wurden. Aus diesen Ergebnisssen l{\"a}sst sich ableiten, dass SSZ durch die Exposition mit der fr{\"u}hen embryonalen Mikroumgebung zur Bildung heterologer Zelltypen angeregt werden k{\"o}nnen. Außerdem demonstrieren diese Ergebnisse das unterschiedliche Entwicklungspotenzial von HSZ und NSZ und grenzen es gegen{\"u}ber dem pluripotenten Differenzierungspotenzial von ES-Zellen ab.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Philipp2002,
  author    = {Philipp, Melanie},
  title     = {Die Rolle von alpha2-adrenergen Rezeptoren w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5186},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Alpha2-Rezeptoren, die weiter in alpha2A, alpha2B und alpha2C unterteilt werden, geh{\"o}ren zur Gruppe der adrenergen Rezeptoren innerhalb der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie sind maßgeblich an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Vieles, was heute {\"u}ber alpha2-Rezeptoren bekannt ist, wurde mithilfe von alpha2-defizienten M{\"a}usen, sogenannten „Knock-Out"-M{\"a}usen (KO) herausgefunden, von denen bislang drei Einzel-KOs und der Doppel-KO der Subtypen A und C existieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch Kreuzung der vorhandenen KO-Linien Mauslinien generiert, die defizient f{\"u}r alpha2A und alpha2B, f{\"u}r alpha2B und alpha2C oder alle drei alpha2-Rezeptoren sind. W{\"a}hrend alpha2AB-KO-M{\"a}use ungef{\"a}hr entsprechend der Mendelschen Verteilung geboren wurden, zeigte sich, dass alpha2BC-KO-M{\"a}use teilweise und alpha2ABC-KO-M{\"a}use sogar komplett embryonal letal waren. Die morphologischen Unter-suchungen legten den Zeitpunkt der embryonalen Letalit{\"a}t der alpha2ABC-KO-M{\"a}use auf den Tag E10,5 der Embryonalentwicklung fest und konnten zeigen, dass diese Letalit{\"a}t in einem Vaskularisierungsdefekt innerhalb der extraembryonalen Organe Plazenta und Dottersack begr{\"u}ndet lag. Diese Organe stellen die Versorgung des Embryos mit N{\"a}hrstoffen und Sauerstoff sicher und sorgen somit f{\"u}r dessen Entwicklung. Durch RT-PCR-Experimente konnte die mRNS f{\"u}r alle drei alpha2-Rezeptorsubtypen an Tag E10,5 sowohl im Embryo als auch in Plazenta und Dottersack nachgewiesen werden. Autoradiographische Experimente und Radioligandenbindungsstudien an Plazenten machten deutlich, dass der Großteil an alpha2-Rezeptoren im embryonalen Teil der Plazenta exprimiert wird, n{\"a}mlich in den Riesenzellen und in der sich daran anschließenden Spongiotrophoblastschicht, und dass hierbei alpha2-Rezeptoren vom B-Subtyp vorherrschen. In den genannten Zellen konnte mittels Immunhistochemie eine alpha2-Rezeptor-vermittelte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 gezeigt werden, die auch in kultivierten WT-Dotters{\"a}cken beobachtet werden konnte. Unter basalen Bedingungen zeigte sich, dass die ERK1/2-Phosphorylierung in Gewebe von alpha2ABC-KO-Embryonen drastisch vermindert war, w{\"a}hrend andere Signalwege, die von alpha2-Rezeptoren angestoßen werden k{\"o}nnen, nicht beeintr{\"a}chtigt waren. Versuche in einem Zellkulturmodell und mit kultivierten WT-Dotters{\"a}cken ergaben eine physiologisch relevante Wechselwirkung zwischen dem alpha2B-Rezeptor und dem PDGFbeta-Rezeptor, einer Rezeptortyrosinkinase, als deren Mechanismus sich in Co-Kultur-Experimenten mit alpha2B-Rezeptor-transfizierten Zellen und alpha2ABC-defizienten Dotters{\"a}cken die Transaktivierung von Rezeptortyrosinkinasen herausstellte. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass a2-Rezeptoren bei der Maus {\"u}ber eine Transaktivierung von ERK1/2 die Vaskularisierung der Plazenta und des Dottersacks bedingen und damit eine normale Embryonalentwicklung sicherstellen.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Jehle2002,
  author    = {Jehle, Margot},
  title     = {Interaktionen der Replikationsproteine der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4068},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Zusammenfassung Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozeß, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der ORC-Komplex an Replikationsorigins in chromosomaler DNA, wodurch die Assemblierung des pr{\"a}replikativen Komplexes an den Origins ausgel{\"o}st wird. Anschließend lagern sich CDC6- und RLF-B/CDT1-Protein an den ORC an, die beide schließlich f{\"u}r die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivit{\"a}t der CDC7/DBF4-Kinase wird der Origin lizensiert, nachdem der letzte Initiationsfaktor CDC45 die Assemblierung des pre-RC vervollst{\"a}ndigt hat. Ein Ziel dieser Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Proteininteraktionen zwischen den verschiedenen Initiationsproteinen durch Two-Hybrid-Studien aufzukl{\"a}ren. Dazu wurden die cDNAs aller bisher in Mus musculus charakterisierten Initiationsproteine, wie ORC1-6, CDC6, MCM2-7, CDC7, DBF4, CDC45, der "polo like kinase" CDC5/PLK, des DNA-Einzelstrang-bindenden Replikationsproteins RPA mit seinen Untereinheiten RPA14, RPA32, RPA70 und schließlich des heterodimeren Proteins Ku mit den Untereinheiten Ku80 und Ku70 jeweils in zwei verschiedene Hefevektoren inseriert. Zum einen handelt es sich dabei um den K{\"o}dervektor pEG202 und andererseits um den Beutevektor pJG4-5 des Two-Hybrid-Systems. Dabei wurden alle m{\"o}glichen K{\"o}der-/Beute-Proteinkonstellationen auf eine Aktivierung des Reportergens LacZ hin untersucht und so zahlreiche Protein-Proteininteraktionen identifiziert. Einige der hier beschriebenen Wechselwirkungen waren auch in anderen Spezies identifiziert worden und konnten somit f{\"u}r Maus best{\"a}tigt werden. Im Rahmen dieser Two-Hybrid-Untersuchungen wurden allerdings auch erstmals neue Protein-Proteininteraktionen nachgewiesen, wie beispielsweise CDC5/PLK mit MCM2 oder Ku80 mit ORC1, -2, -4 und -5. Sowohl von CDC5/PLK- als auch von Ku80-Protein wurde vermutet, daß sie im Zusammenhang mit der Initiation der DNA-Replikation stehen k{\"o}nnten. Die Two-Hybrid-Interaktionen hier vermittelten neue Indizien, die diese Vermutung untermauern. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden f{\"u}nf CDC7-Deletionsmutanten konstruiert, um die Interaktionsdom{\"a}nen des CDC7-Proteins mit anderen Proteinen im Rahmen des Two-Hybrid-Systems bestimmen zu k{\"o}nnen. Die Mutanten wurden dazu jeweils in den pEG202- und den pJG4-5-Hefevektor inseriert. Die Hefe-Studien wurden nur mit denjenigen Proteinen durchgef{\"u}hrt, mit denen das CDC7-Wildtyp-Protein im ersten Teil der Arbeit positive Interaktionen eingegangen war. Auffallend bei den Untersuchungen mit den Deletionsmutanten war, daß sie in der K{\"o}derposition mehr Interaktionen eingingen als in der Beuteposition. Nur die C1-, C2- und N2-Mutante gingen noch Wechselwirkungen mit einigen Initiatorproteinen ein, w{\"a}hrend weder die C2- noch die N1-Mutante dazu in der Lage waren. Als Resultat dieser CDC7-Interaktionsdom{\"a}nenkartierung stellte sich das Kinase-Insert II als ein f{\"u}r die Mehrheit der Protein-Proteininteraktionen des CDC7-Proteins zentrales Element heraus. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war es, paradigmatisch einzelne Protein-Proteininteraktionen, die in den Two-Hybrid-Studien aufgefunden worden waren, mittels einer zweiten Methode zu analysieren. Zus{\"a}tzlich sollte die Zellzyklusabh{\"a}ngigkeit einzelner Interaktionen der an der Initiation der DNA-Replikation beteiligten Proteine untersucht werden. Dazu wurden Immunpr{\"a}zipitationsversuche mit synchronisierten FM3A-Mauszellen durchgef{\"u}hrt. Die in Suspensionskultur kultivierten Mauszellen wurden mit Mevastatin in fr{\"u}her G1-, mit Mimosin in G1/S-, mit Hydroxyharnstoff in der S- und mit Nocodazol in der Mitose arretiert. Ausgangsbasis f{\"u}r die weiteren IP-Experimente waren aus den FM3A-Zellen pr{\"a}parierte Kernextrakte. Folgende Antik{\"o}rper wurden zur Inkubation mit Kernextrakten verwendet: gegen ORC1-, ORC2-, ORC3-, ORC5-, ORC6-, CDC6-, MCM2-, MCM7- und DBF4 gerichtete Antik{\"o}rper. Mit allen genannten Antik{\"o}rpern konnten Immunpr{\"a}zipitationen zwischen einzelnen ORC-Untereinheiten, CDC6- und ORC-Proteinen, einzelnen MCM-Untereinheiten und ORC2- bzw. CDC6-Protein und zwischen der regulatorischen Untereinheit der DDK-Kinase DBF4 und einigen ORC-Untereinheiten nachgewiesen werden. Ein großer Teil der IPs trat in zellzyklusunabh{\"a}ngiger Weise auf, w{\"a}hrend ein kleinerer Anteil Zellzyklusabh{\"a}ngigkeit zeigte, wie beispielsweise die CDC6-ORC2-Wechselwirkung, die nur von der fr{\"u}hen bis zur sp{\"a}ten G1-Phase beobachtet werden konnte. Im vierten und letzten Abschnitt dieser Arbeit ging es um die Identifizierung eines Maus-EST-Klones f{\"u}r das CDT1-Gen. Das CDT1-Protein ist essentieller Bestandteil der Initiation der DNA-Replikation und sorgt gemeinsam mit dem CDC6-Protein f{\"u}r die Rekrutierung des MCM-Komplexes an den Origin, wodurch der pr{\"a}replikative Komplex f{\"u}r die anstehende Initiation der DNA-Replikation lizensiert wird. Der vollst{\"a}ndige Maus-EST-Klon wurde mittels einer Sonde durch radioaktive Hybridisierung einer cDNA-Bibliothek von 9 Tage alten Mausembryonen identifiziert und charakterisiert. Die vollst{\"a}ndige Sequenz von MmCDT1 ergab einen offenen Leserahmen von 1673bp und kodiert f{\"u}r ein Protein mit 557 Aminos{\"a}uren und einer Molmasse von 61.5 kDa.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gehrig2003,
  author    = {Gehrig, Andrea},
  title     = {Untersuchungen zu den molekularen Ursachen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis - vom Gendefekt zum Mausmodell},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7212},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Heredit{\"a}re Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auff{\"a}llig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufkl{\"a}rung der genetischen Ursachen einiger ausgew{\"a}hlter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgekl{\"a}rt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte f{\"u}r 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine h{\"a}ufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge M{\"a}nner weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Ver{\"a}nderungen der zentralen Retina f{\"u}hren. Ungef{\"a}hr 50 \% der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit {\"o}ffentlich zug{\"a}nglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert f{\"u}r ein putatives 224 Aminos{\"a}uren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindom{\"a}nen-Motiv enth{\"a}lt. Discoidindom{\"a}nen sind in Zelladh{\"a}sion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten best{\"a}tigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die {\"u}ber Disulfidbr{\"u}cken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfl{\"a}che der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der {\"a}ußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell f{\"u}r die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren f{\"u}hren. Gegenw{\"a}rtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgef{\"u}hrt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß dar{\"u}ber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein m{\"o}glicher Therapieansatz f{\"u}r RS auch beim Menschen sein k{\"o}nnte.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Buecheler2003,
  author    = {B{\"u}cheler, Markus},
  title     = {Regulation der Neurotransmission im zentralen Nervensystem durch alpha2-adrenerge Rezeptoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7803},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Die Gruppe der adrenergen Rezeptoren (AR) umfasst neun Rezeptoren (3 alpha1-, 3 alpha2-, 3 beta-AR), die alle durch die physiologischen Liganden Adrenalin und Noradrenalin aktiviert werden k{\"o}nnen. Eine Subgruppe der AR bilden die drei alpha2-AR alpha2A, alpha2B und alpha2C. Sie k{\"o}nnen pr{\"a}- oder postsynaptisch lokalisiert sein. Pr{\"a}synaptisch lokalisierte alpha2-AR hemmen die Transmitterfreisetzung im Sinne einer negativen R{\"u}ckkopplung. Die Hauptrolle bei der pr{\"a}synaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung spielen alpha2-AR vom Subtyp alpha2A. Es lagen zu Beginn dieser Arbeit auch Hinweise vor, daß noch weitere alpha2-Rezeptorsubtypen an dieser Funktion beteiligt sind. Eine eindeutige Zuordnung dieser alpha2-AR zu den Subtypen alpha2B oder alpha2C gelang aber bisher nicht. In dieser Arbeit sollte deshalb die Frage beantwortet werden, welche alpha2-AR neben dem alpha2A-AR an der pr{\"a}synaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung im zentralen Nervensystem beteiligt sind. Zur Subtypunterscheidung wurden "knockout"-M{\"a}use verwendet, die nur einen oder zwei alpha2-Rezeptorsubtypen exprimierten. Gehirnschnitte aus dem Neokortex und den Basalganglien dieser Mauslinien wurden mit radoaktiv markiertem Noradrenalin bzw. Dopamin inkubiert. Anschließend wurde in Transmitterfreisetzungsexperimenten mit den so behandelten Gehirnschnitten Konzentrations-Wirkungskurven mit verschiedenen Liganden erstellt. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, daß neben den alpha2A-AR auch alpha2C-AR pr{\"a}synaptisch die Transmitterfreisetzung von Noradrenalin und Dopamin hemmen. In einem weiteren Schritt wurde die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik der alpha2A- und alpha2C-AR im heterologen Expressionssystem untersucht. Hierzu wurden stabile HEK293-Zellinien generiert, die entweder alpha2A- oder alpha2C-AR unterschiedlich stark exprimierten. Diese Zellinien wurden transient mit GIRK-Kan{\"a}len transfiziert, um die durch Stimulation mit Noradrenalin resultierenden Kaliumstr{\"o}me mit der "patch-clamp"-Technik zu messen. Dabei ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen alpha2A- und alpha2C-AR bez{\"u}glich der Aktivierungskinetik. Alpha2C-AR deaktivierten jedoch deutlich langsamer als alpha2A-AR. Diese Befunde belegen, daß zwei der drei alpha2-AR-Subtypen, alpha2A und alpha2C, als pr{\"a}synaptische Autorezeptoren (Noradrenalin) bzw. Heterorezeptoren (Dopamin) die Neurotransmission modulieren. Dies k{\"o}nnte in der Zukunft f{\"u}r die Entwicklung neuer, subtypspezifischer Pharmaka von großer Bedeutung sein.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Tyrsin2003,
  author    = {Tyrsin, Oleg},
  title     = {Role of Raf family members in mouse development},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9453},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Raf Proteine sind Serin/Threonin Kinasen, die als zentrale Elemente des Ras, Raf, Mek, Map Kinase Wegs, an der Weiterleitung von extrazellul{\"a}ren Signalen von der Zellmembran zu nukle{\"a}ren Effektoren beteiligt sind. Auf diese Weise kontrollieren sie elementare Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und das {\"U}berleben von Zellen. In S{\"a}ugetieren wurden drei funktionelle Gene (A-, B- and C-raf) beschrieben. Aus biochemischen Untersuchungen ergibt sich, dass die Isozyme {\"u}berlappende aber auch differentielle Funktionen {\"u}bernehmen. Allerdings wurde ein differenziertes Verst{\"a}ndnis der jeweiligen spezifischen Rolle dadurch erschwert, dass in den meisten Zelltypen verschiedene Raf-Isozyme expremiert werden und dass wegen der Vielzahl der Aktivatoren und Effektoren eine eindeutige Isoform-Zuordnung schwer m{\"o}glich war. Aufgrund der Beteiligung an verschiedenen Krankheitsbildern, insbesondere der Tumorentstehung und -progression, ist jedoch die Aufkl{\"a}rung der Isozym-spezifischen Funktionen von vorranginger wissenschaftlicher Bedeutung. B-Raf hat unter den Raf Kinasen die h{\"o}chste Kinaseaktivit{\"a}t und zeigt antiapoptotische Eigenschaften. B-Raf knockout M{\"a}use zeigen eine allgemeine Wachstumsverz{\"o}gerung und sterben zwischen E10,5 und E12,5 aufgrund fehlentwickelter Gef{\"a}sse in Folge massiver Apoptose differenzierter Endothelzellen. [1]. Um die Lethalit{\"a}t des B-Raf-/- (KO) Ph{\"a}notyps zu {\"u}berkommen und um die Redundanz der B-Raf Proteine weiter zu untersuchen, wurden M{\"a}use generiert, die unter der Kontrolle des B-Raf Promoters statt B-Raf eine A-Raf cDNA exprimieren. Nur in einem Fall entwickelte sich eine ausgewachsene p20 Maus ohne sichtbare Entwicklungsdefekte oder Verhaltensauff{\"a}lligkeiten. Dar{\"u}ber hinaus wurden lebende Embryonen mit normaler Entwicklung aber reduzierter Gr{\"o}sse mit niedriger Inzidenz zwischen E12,5d und E16,5d beobachtet. In allen diesen F{\"a}llen fanden wir ein intaktes Gef{\"a}ßsystem. Andererseits waren Neurogenese und die Bewegung der neuralen Vorl{\"a}uferzellen in den {\"u}berlebenden Embryonen gest{\"o}rt, was in einigen F{\"a}llen zu unterentwickelten Hirnregionen f{\"u}hrte. Mittels TUNEL bzw. PCNA Assay konnten wir zeigen, dass mehr apoptotische und weniger proliferierende Zellen in ventrikul{\"a}rer und subventrikul{\"a}rer Zone der Hirn Ventrikel und im Striatum der KIN Embryonen zu finden sind. Außerdem wurden in einer Reihe von Geweben von E13,5d und in den Lungen von E16,5d Embryonen, vermehrt apoptotische Zellen beobachtet. Dies war in der einen ausgewachsenen KIN Maus nicht der Fall. Diese zeigte einen reduzierten Anteil an neuronalen Vorl{\"a}uferzellen in der subgranul{\"a}ren Zone des Hippocampus und an reifen Neuronen im Riechkolben. Ansonsten waren aber keine St{\"o}rungen der Neurogenese in der ausgewachsenen KIN Maus detektierbar. Fibroblasten die aus KIN Embryonen etabliert wurden, zeigten im Vergleich zu Wildtypzellen reduzierte F{\"a}higkeit zur Proliferation und erh{\"o}hte Sensibilit{\"a}t gegen{\"u}ber Apoptoseausl{\"o}sern. Die erh{\"o}hte Apoptosetendenz spiegelte sich auf molekularer Ebene in einer Reduktion an antiapoptotischen Molek{\"u}len wieder. Aktive ERK und Akt Kinase sind erniedrigt. Außerdem war von dem bekannten Raf Substrat BAD, weniger an der inaktiven phosphorylierten Form zu beobachten, wodurch bei gleicher Menge Gesamtprotein auf ein Mehr an proapoptotischem unphosphoryliertem BAD geschlossen werden kann. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Substitution von B-Raf durch die weniger aktive A-Raf Kinase zwar die endotheliale Apoptose verhindern kann, die die Ursache f{\"u}r das fr{\"u}he Absterben der B-Raf-/- (KO) M{\"a}use ist, dass aber die normale Entwicklung dennoch entscheidend gest{\"o}rt ist.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Treichel2003,
  author    = {Treichel, Dieter},
  title     = {Isolierung, evolutive Einordnung und funktionelle Charakterisierung von Knopfkopf, einem buttonhead-Ortholog in der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5867},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Isolierung des Sp1-verwandten Transkriptionsfaktors Knopfkopf mittels eines PCR-basierten Homologie-Screens in der Maus. Das Gen Knopfkopf wurde anschließend hinsichtlich der evolutiven Verwandtschaftsbeziehungen zum Drosophila-Gen buttonhead eingeordnet. Eine funktionelle Charakterisierung erfolgte mit Hilfe einer gezielten Geninaktivierung durch homologe Rekombination (knock out). Es konnte gezeigt werden, dass das Gen in der Embryogenese der Maus essentiell ist f{\"u}r die Entwicklung der Extremit{\"a}ten, der Nase und des Zentralen Nervensystems sowie der sekund{\"a}ren Gastrulation.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schulte2003,
  author    = {Schulte, Valerie},
  title     = {In vitro and in vivo studies on the activating platelet collagen receptor glycoprotein VI in mice},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6564},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {The work summarized here focused on the characterization of the murine platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI and was performed to evaluate its potential as an antithrombotic target. The first mAb against (mouse) GPVI, JAQ1, was generated and used to demonstrate that GPVI requires the FcRgamma-chain for its expression and function and that this receptor is the central molecule in collagen-induced platelet activation. Blocking the major collagen binding site on GPVI with JAQ1 revealed the presence of a second activatory epitope within collagen. Additionally, the collagen receptor integrin alpha2beta1 was found to be required for activation via this second pathway but not to be essential for collagen-induced activation of normal platelets. In studies with mice expressing reduced levels of the GPVI-FcRgamma-complex, differential responses to GPVI ligands were observed. Most importantly, the striking difference between platelet responses to collagen and the GPVI specific synthetic collagen related peptide (CRP) confirmed the supportive role of other collagen receptor(s) on platelets. Irrespective of yet undefined additional receptors, studies with mice deficient in GPVI (FcRgamma-chain) or alpha2beta1 showed that GPVI, but not alpha2beta1 is essential for platelet-collagen interaction. Based on these results, the model of platelet attachment to collagen was revised establishing GPVI as the initial activating receptor which upregulates the activity of integrins, thus enabling firm attachment of platelets to the ECM. While the mAb JAQ1 had only limited inhibitory effects on collagen-induced activation in vitro, its in vivo application to mice resulted in completely abolished platelet responses to collagen and the GPVI specific agonists CRP and convulxin. This effect was found to be due to antibody-induced irreversible down-regulation of GPVI on circulating platelets for at least two weeks. Further studies revealed that GPVI depletion occurs independently of the targeted epitope on the receptor and does not require the divalent form of IgG as it was also induced by mAbs (JAQ2, JAQ3) or the respective Fab fragments directed against epitopes distinct from the major collagen binding site. The internalization of GPVI in vivo resulted in a long-term protection of the mice from lethal collagen-dependent thromboembolism whereas it had only moderate effects on the bleeding time, probably because the treatment did not affect other activation pathways. These results establish GPVI as a potential pharmacological target for the prevention of ischemic cardiovascular diseases and may open the way for a completely new generation of antithrombotics.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{GarciaArguinzonis2003,
  author    = {Garc{\´i}a Arguinzonis, Ma{\´i}sa In{\´e}s},
  title     = {Analysis of signal transduction pathways and the cytoskeleton in VASP-deficient cell lines and mouse models},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6195},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {The mammalian Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) is a founding member of the Ena/VASP family of proteins that includes Drosophila Enabled (ena), the mammalian Ena homologue (Mena) and the Ena-VASP-like protein (Evl). VASP was initially discovered and characterized as a substrate for cGMP- and cAMP-dependent protein kinases (cGKs and cAKs). Ena/VASP proteins are involved in Actin-filament formation, plasma membrane protrusion, acceleration of Actin-based motility of Listeria and the establishment of cell-cell adhesion. Moreover, Ena/VASP proteins have been implicated as inhibitory factors in repulsive axon guidance and inhibition of plasma membrane activity and random motility in fibroblast. In order to study the physiological function of VASP, VASP-deficient mice had been generated in the laboratory by homologous recombination. VASP-/- mice showed hyperplasia of megakaryocytes in the bone marrow and spleen and a two-fold increase in thrombin- and collagen-induced platelet activation. To further investigate the cellular function of VASP, I established cardiac fibroblast cell lines derived from both wild type and VASP-/- mice. Both cell lines presented similar growth rates and normal contact dependent-growth inhibition but showed differences in morphology, migration and adhesion. Adherent VASP-/- cells, despite normal Mena and Evl expression levels, were highly spread. VASP-/- cells covered about twice the substrate surface area as wild type cells, while the cell volumes were unchanged. This shape difference suggests that VASP is involved in the regulation of spreading. Since the small GTPases Rac and Cdc 42 and their effector p21-activated kinase (Pak) are key regulators of lamellipodia formation and cell spreading, I analyzed this signalling pathway in VASP-/- cells stimulated with Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) or fetal calf serum. In wild type cells Rac and Pak were rapidly and transiently activated by PDGF or serum; however, in the absence of VASP both Rac and Pak activation was dramatically prolonged. The Rac/Pak pathway is known to play an essential role in cell motility. VASP deficient cells showed compromised migration and reorientation in a wound healing assay, probably due to enhanced Rac activity. The spreading phenotype, compromised migration and the effect observed on the Rac and Pak activities were reverted in VASP-/- cells stably transfected with full lenght human VASP, indicating a VASP dependent modulation of the Rac/Pak pathway and Rac/Pak regulated processes. Moreover, adhesion and detachment of VASP-deficient cells were significantly slower when compared to wild type cells. Preincubation of VASP+/+ cells with a cGMP analog accelerated adhesion. This acceleration did not take place in the VASP-/- cells, suggesting a VASP dependent effect. The second part of this work focused on VASP function in platelets. On the one hand I investigated the possibility of VASP-dependent Rac regulation in mouse platelets. Murine platelets are a good model for studying Rac regulation since they express high levels of VASP but not Mena/Evl and since VASP-deficient platelets show an increased platelet activation. Rac was activated by platelet agonists which was inhibited by preincubation with cGMP and cAMP analogs. Initial results which need to be extended showed that the cGMPcaused inhibition of Rac activation was VASP-dependent. Finally, in vivo platelet adhesion (platelet-vessel wall interactions) was studied using VASP-deficient mice. These studies demonstrated in-vivo that VASP down regulates platelet adhesion to the vascular wall under both physiological and pathophysiological conditions.},
  subject      = {Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Herrmann2004,
  author    = {Herrmann, Thomas},
  title     = {Sequenz-spezifische Interaktion des murinen pr{\"a}replikativen Komplexes mit Origin-DNA},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11241},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Mit Hilfe von in vivo ChIP-Experimenten identifizierten wir eine pr{\"a}RC Bindungsstelle von -2519 bis -2152 (Fragment B) innerhalb eines „origin of bidirectional replication (OBR)" der 44 kb langen Maus-rDNA-Einheit. Diese Bindungsstelle befindet sich ungef{\"a}hr 2,3 kb ubstream des Transkriptionsstartpunktes der RNA-Poymerase I. An dieser Bindungsstelle konnte in der G1-Phase der komplette ORC-Komplex sowie Geminin, MCM3 und -6 nachgewiesen werden. F{\"u}r den G1/S-Phasen{\"u}bergang deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich ORC6 und Geminin von Fragment B abl{\"o}sen, w{\"a}hrend sich CDC6 und -45 an den ORC-Komplex anlagern. Mit Erreichen der S-Phase konnte gezeigt werden, dass sich CDC6 und -45 sowie ORC1 wieder abl{\"o}sen und ein Core-Komplex von ORC2-5 sowie MCM3 und -6 gebunden bleibt. Außerdem konnte an Fragment B eine spezifische Bindung eines aus FM3A-Zellkernprotein angereicherten pr{\"a}RC-Komplexes (Komplex A) auch in vitro mit Hilfe von EMSA-Experimenten beobachtet werden. Die Bindungsaktivit{\"a}t von Komplex A an Fragment B konnte durch ATP verst{\"a}rkt werden.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schulz2004,
  author    = {Schulz, Carsten},
  title     = {Analyse des Replikationsprozesses der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11199},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Initiation der DNA-Replikation ist in Eukaryonten ein hochkonservierter Prozess. Zuerst bindet der „origin recognition complex" (ORC) an Replikationsstartpunkte chromosomaler DNA und stellt das Startsignal f{\"u}r die Assemblierung des pr{\"a}replikativen Komplexes (pre-RC) dar. Anschließend assoziieren die Initiationsfaktoren CDC6 und CDT1 mit dem ORC. Durch die Rekrutierung des MCM-Komplexes wird der pre-RC schließlich vervollst{\"a}ndigt. Die Aktivit{\"a}t der CDC7/DBF4-Kinase und die Anlagerung von CDC45 lizensiert den Origin f{\"u}r die DNA-Replikation. Ein Ziel dieser Arbeit war, den vollst{\"a}ndigen murinen ORC rekombinant darzustellen. Um den gesamten Komplex durch Copr{\"a}zipitation zu isolieren, wurden ORC1, 3, 4, 5 und 6 als Wildtyp-Proteine und ORC2 mit einer N-terminalen Poly-His-Dom{\"a}ne mit Hilfe von Baculoviren koexprimiert. Nach der Aufreinigung konnten, mit Ausnahme von ORC3, alle ORC-Untereinheiten in den Elutionsfraktionen immundetektiert werden. Eine Gelfiltration der Fraktionen ließ auf die Isolierung eines 450 kD großen Komplexes schließen, der mindestens f{\"u}nf der sechs ORC-Untereinheiten enthielt. Dies zeigt, dass der murine ORC als Holokomplex rekombinant isoliert werden kann. In einem weiteren Teil dieser Arbeit sollte die Rolle des MCM-Komplexes bei der Termination der DNA-Replikation am 3'-Ende muriner rDNA-Transkriptionseinheiten untersucht werden. Durch polare Replikationsgabelbarrieren im 3'-Bereich der ribosomalen Gene wird {\"u}ber die Kontrahelikaseaktivit{\"a}t von TTF-I die Bewegungsrichtung der Replikation auf die Richtung der Transkription limitiert. In dieser Arbeit sollte festgestellt werden, ob dies auch bei der murinen MCM4/6/7-Helikase der Fall ist. Um MCM4/6/7-Hexamere zu isolieren, wurden die Untereinheiten MCM4 und 7 in Wildtyp-Form und MCM6 mit einem N-terminal fusionierten HA-Tag mittels Baculoviren koexprimiert. Zur Durchf{\"u}hrung der Kontrahelikasestudien musste die Helikaseaktivit{\"a}t der isolierten Komplexe ermittelt werden. Bereits mit kurzen partiell doppelstr{\"a}ngigen M13-Substraten (17 nt) zeigte sich eine geringere Entwindungsf{\"a}higkeit als in der Literatur beschrieben. Bei weiteren Helikasestudien wurden DNA-Substrate (30 nt) mit einem 5'-{\"U}berhang sowie SSB bzw. RPA eingesetzt. Zwar konnte so eine Steigerung der Helikaseaktivit{\"a}t von MCM4/6/7 verzeichnet werden, jedoch fand diese nicht in ausreichendem Maße statt. Zudem war das entwundene Oligonukleotid einem Abbau unterworfen, dessen Ursache nicht aufgekl{\"a}rt werden konnte. Aufgrund der zu geringen Helikaseaktivit{\"a}t im Hinblick auf die TTF-I-Kontrahelikasestudien wurden diese Arbeiten eingestellt. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war der Transport von MCM-Proteinen in den Zellkern. Der MCM-Komplex ist in fast allen Organismen konstitutiv im Zellkern lokalisiert. Die {\"U}berexpression einzelner exogener MCM-Proteine zeigte allerdings, dass nur MCM2 und 3 mit Hilfe ihrer ihrer NLS-Motive in den Kern transportiert werden, w{\"a}hrend dies bei MCM4 bis 7 nicht erfolgt. Two-Hybrid-Studien unserer Arbeitsgruppe ließen auf paarweise Wechselwirkungen der MCM4 bis 7-Untereinheiten mit MCM2 bzw. MCM3 schließen. Deshalb wurden EGFP-MCM-Proteine zusammen mit Wildtyp-MCM-Proteinen in Mauszellen koexprimiert. Dabei zeigte sich, dass MCM2 die Proteine MCM4, 6 und 7 in den Kern transportiert, w{\"a}hrend MCM3 nur MCM5 in den Zellkern einschleust. Weitere Interaktionen zwischen MCM6 und 4 sowie zwischen MCM6 und 7 konnten bei MCM4/6/7-Aufreinigungen beobachtet werden. Zuletzt wurde noch die Lokalisation von CDT1 in der OBR-Region des murinen rDNA-Cistrons untersucht. Bislang wurde nur in S. cerevisiae eine sequenzspezifische ORC-Bindung an ACS-Bereiche identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe konnte im murinen rDNA-Cluster stromaufw{\"a}rts des Transkriptionsstartpunktes ein Origin charakterisiert und die Bindungstelle verschiedener Initiatorproteine um die Position -2500 eingegrenzt werden. Die Assoziation von CDT1 mit derselben Region w{\"u}rde die Assemblierung eines pre-RC in dem untersuchten Bereich zus{\"a}tzlich best{\"a}tigen. Zur Umsetzung von ChIP-Studien wurden CDT1-Antik{\"o}rper hergestellt. Um die Assemblierung von CDT1 mit dem Origin in Abh{\"a}ngigkeit des Zellzyklus zu untersuchen, wurden FM3A-Mauszellen in fr{\"u}her G1-, sp{\"a}ter G1-, G1/S-, S- und in der G2/M-Phase arretiert. Die Auswertung der ChIP-Analysen, die den zu analysierenden Bereich von -2837 bis -1820 umspannten, zeigte, dass CDT1 ausschließlich w{\"a}hrend der G1-Phase mit dem Chromatin assoziiert ist. Dies ist konsistent mit der Aktivit{\"a}t von CDT1 w{\"a}hrend des Zellzyklus in S{\"a}ugern. Der h{\"o}chste Anteil an DNA-gebundenem CDT1 konnte in dem Bereich -2519 bis -2152 festgestellt werden. Eine Sequenzanalyse des OBR der murinen rDNA lieferte keine Homologie zu anderen bekannten Origins. Jedoch wurden diverse DNA-Strukturelemente, wie z.B. HSS, DUEs oder CpG-Inseln, sowie verschiedene Protein-Bindungsstellen gefunden, die potentiellen Einfluss auf die Festlegung des murinen OBR haben k{\"o}nnten.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Frydrychowicz2004,
  author    = {Frydrychowicz, Alex},
  title     = {Hochaufgel{\"o}ste cine-Magnetresonanz-Bildgebung des M{\"a}useherzens zur Bestimmung rechtsventrikul{\"a}rer Morphologie und funktioneller Parameter : Validierung der Methode und Etablierung an zwei Modellen der Herzinsuffizienz},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10207},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Rolle des rechten Ventrikels in der Entwicklung der Herzinsuffizienz ist bis heute umstritten. Vor dem Hintergrund neuer transgener Mausmodelle war es Ziel dieser Studie, die MR-basierte Volumenquantifizierung f{\"u}r den rechten Ventrikel der Maus zu validieren und auf zwei Mausmodell mit Rechtsherzinsuffizienz anzuwenden. Gesunde M{\"a}use unterschiedlichen Alters wurden mittels MR-Bildgebung bei 7T untersucht. Zur Generierung der Herzinsuffizienz wurde eine Infarzierung durch Banding der LAD, zur Erzeugung einer isolierten Rechtsherzinsuffizienz eine Pulmonalarterienstenose operativ induziert. Die Schnittf{\"u}hrung der MR-Aufnahmen lag orthogonal zum Ventrikelseptum, um Partialvolumen-Fehler zu minimieren. Die MR-Daten wurden von 2 unabh{\"a}ngigen Auswertern zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit analysiert. Der Vergleich linksventrikul{\"a}rer (LV) und rechtsventrikul{\"a}rer (RV) Volumina zeigte eine enge Korrelation f{\"u}r die Schlagvolumina (SV) (r=0.97, p<0.0001). Die Bland-Altman-Analyse best{\"a}tigte diese enge {\"U}bereinstimmung (mittlere Differenz 0.4µl). Wiederholte Messung der RV Parameter zeigte ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit (intraobserver- und interobserver-Variabilit{\"a}t jeweils <7\%). Die MR-Messung 4 Wochen nach Pulmonalbanding ergab einen signifikanten Anstieg des RV enddiastolischen Volumens (+44\%, p<0.005) und vor allem RV endsystolischen Volumens (+133\%, p<0.0001). Die RV Ejektionsfraktion war signifikant reduziert (31.2±6.2 \% vs. 57.0±2.3 \%, p<0.001). Die LV Volumina sowie EF waren unver{\"a}ndert zum Normalkollektiv und best{\"a}tigten den Befund der isolierten Rechtsherzinsuffizienz. Neben LV Volumina erlaubt die 3D MR-Datenakquisition auch eine reproduzierbare Analyse des deutlich komplexeren rechten Ventrikels der Maus. Die Studie belegt eindrucksvoll des Potential von hochaufl{\"o}sender MR-Bildgebung zur Aufkl{\"a}rung von Pathomechanismen rechtsventrikul{\"a}rer Erkrankungen.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stuermer2004,
  author    = {St{\"u}rmer, Andrea},
  title     = {Interaktionen und Lokalisationen der Replikationsproteine der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9563},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex" (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des pr{\"a}replikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgel{\"o}st wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich f{\"u}r die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivit{\"a}t der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin f{\"u}r den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den pr{\"a}replikativen Komplex vervollst{\"a}ndigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzukl{\"a}ren. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellul{\"a}ren Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-F{\"a}rbung mit Antik{\"o}rpern gegen eine konservierte Dom{\"a}ne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antik{\"o}rpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch f{\"u}r die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zus{\"a}tzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte {\"u}ber Immunpr{\"a}zipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin pr{\"a}zipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine w{\"a}hrend der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down" des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System erm{\"o}glicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte St{\"o}rung des Zellwachstums hin. Zus{\"a}tzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollst{\"a}ndig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen m{\"o}glichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auff{\"a}llig h{\"a}ufig lagen in MCM3-„knock-down"-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Ph{\"a}notypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukle{\"a}rer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down"-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des pr{\"a}replikativen Komplexes eine zus{\"a}tzliche Funktion in der Mitose aus{\"u}ben.},
  subject      = {Replikation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Petrovic2004,
  author    = {Petrovic, Suzana},
  title     = {In vivo analysis of homing pattern and differentiation potential of cells deriving from embryonic and adult haematopoietic regions},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9323},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {The experimental work of this thesis addresses the questions of whether established cell lines injected into murine blastocysts find their way back home and seed preferentially at the site of their origin. Furthermore, can they change their fate and differentiate to unrelated cell types when exposed to the embryonic environment. This survey was based on the fact that different cell lines have different potentials in developing embryos, dependent on their cellular identity. The cell lines used in this survey were AGM region-deriving DAS 104-4, DAS 104-8 cells, yolk sac-deriving YSE cells and bone marrow-deriving FDCP mix cells. These cells were injected into mouse blastocysts. Donor cells were traced in developing embryos via specific markers. Analysis of the embryos revealed that DAS cells are promiscuous in their seeding pattern, since they were found in all analysed tissues with similar frequencies. YSE cells showed preferences in seeding yolk sac and liver. YSE donor cells in chimaeric tissues were not able to change their immuno-phenotype, indicating that they did not change their destiny. Analysis of adult mice did not reveal any of YSE-derived cells donor contribution. In contrast, FDCP mix cells mostly engrafted haematopoietic tissues, although the embryos analysed by in situ hybridization had donor signals frequently in cartilage primordia, heads, and livers. Analysis of whether FDCPmix-derived cells found in foetal livers were of haematopoietic or hepatocytes nature showed that progeny of injected FDCP mix cells do not differentiate into cells that express a hepatocyte-specific marker. Further analysis showed that FDCPmix-derived donor cells found in brain express neural or haematopoietic markers. In order to reveal if they transdifferentiate to neurons or fuse with neurons/glial cells, nuclear diameters of donor and recipient cells were determined. Comparison of the nuclear diameters of recipient and donor cells revealed no differences. Therefore this suggests that progeny of FDCP mix in brain are not fusion products. Analysis of adult mice tissues revealed that presence of FDCP mix-derived cells was the highest in brains. These results confirmed the assumption that the developmental potential of the analysed cells cannot be easily modified, even when exposed to early embryonic environment. Therefore one can conclude that the analysed cell types had different homing patterns depending on their origins.},
  subject      = {Zelllinie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schmittwolf2004,
  author    = {Schmittwolf, Carolin},
  title     = {Analyse des Differenzierungspotentials muriner h{\"a}matopoetischer und neuraler Stammzellen nach Modifikation ihrer Genexpression},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8812},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde das Differenzierungspotential muriner h{\"a}matopoetischer und neuraler Stammzellen nach Modifikation ihrer Genexpression untersucht. Zur Ver{\"a}nderung der Genexpression wurden f{\"u}r die beiden adulten Stammzelltypen zwei unterschiedliche experimentelle Ans{\"a}tze gew{\"a}hlt: In h{\"a}matopoetischen Stammzellen wurden molekulare Regulatoren der H{\"a}matopoese durch retroviral vermittelten Gentransfer {\"u}berexprimiert und anschließend ihr in vitro Verhalten und in vivo in Maustransplantationsmodellen ihre Rekonstitutionsf{\"a}higkeit untersucht. Neurale Stammzellen wurden gleichzeitig mit den Chromatin-modifizierenden Substanzen Trichostatin A (TSA) und 5-Aza-2´-desoxycytidin (AzadC) behandelt, im Anschluß ihre Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber der Behandlung in vitro bestimmt und ihr h{\"a}matopoetisches Entwicklungspotential in vivo analysiert. In h{\"a}matopoetischen Stammzellen wurde der Transkriptionsfaktor HOXB4, die h{\"a}matopoetische Vorl{\"a}uferkinase 1 (HPK1) oder eine Kinase-inaktive Mutante der HPK1 (HPK1M46) durch retrovirale Transduktion {\"u}berexprimiert. Der Transfer wildtypischer HPK1 oder HPK1M46 Gene in Knochenmarkzellen hatte in vitro keinen meßbaren Einfluß auf die Proliferation und Anzahl primitiver Vorl{\"a}uferzellen, was auch nach Expression verschiedener Proteinmengen beobachtet wurde. Das Repopulationsverhalten h{\"a}matopoetischer Stammzellen, die mit wildtypischer HPK1 transduziert wurden, war vergleichbar mit dem kontrolltransduzierter Stammzellen. Nach HPK1M46 Transduktion zeigten h{\"a}matopoetische Stammzellen in vivo ein reduziertes Langzeitrepopulationsverhalten und Knochenmarkzellen ex vivo ein eingeschr{\"a}nktes Koloniebildungspotential. Sowohl mit wildtypischer HPK1 als auch mit HPK1M46 transduzierte h{\"a}matopoetische Stammzellen wiesen ein normales Multilinienbesiedlungspotential auf. Nach Transduktion von Knochenmarkzellen mit HOXB4, einem wichtigen Regulator der Selbsterneuerung h{\"a}matopoetischer Stammzellen, konnten diese in vitro expandiert werden, ohne daß sie, wie dies bei kontrolltransduzierten Knochenmarkzellen auftrat, ph{\"a}notypisch Differenzierungsmarker ausbildeten. Nach HOXB4 Transduktion akkumulierte eine homogene, Mac-1niedrig exprimierende Zellpopulation im Gegensatz zu einer Mac-1hoch, Gr-1 sowie c-kit positiven Population, die sich in den Kontrollkulturen entwickelte. Auf mRNS Ebene wurden nur in den Kontrollkulturen Transkripte hochreguliert, die f{\"u}r differenzierende Zellen spezifisch sind, wie z. B. Zyklin D1 w{\"a}hrend myeloider Differenzierung. Die {\"U}berexpression von HOXB4 erm{\"o}glichte eine konstante Proliferationsrate und hatte auf das Verh{\"a}ltnis von asymmetrischen zu symmetrischen Zellteilungen jedoch keinen Einfluß. Entsprechend blieb das Expressionsmuster an Zyklinen, Zyklin-abh{\"a}ngigen Kinasen und Mitgliedern des Transkriptionsaktivators AP-1 in HOXB4 transduzierten Knochenmarkzellen {\"u}ber den beobachteten Zeitraum konstant. Durch die {\"U}berexpression von HOXB4 kann somit in kultivierten Knochenmarkzellen in vitro eine stabile Proliferationsrate induziert und parallel eine fortschreitende Differenzierung der Knochenmarkkultur aufgehalten oder zumindest verz{\"o}gert werden. Sowohl wildtypische als auch bcl-2 transgene neurale Stammzellen, die mit den Epigenotyp-ver{\"a}ndernden Substanzen TSA und AzadC behandelt wurden, zeigten nach Transplantation in bestrahlte adulte Rezipienten h{\"a}matopoetisches Entwicklungspotential, das unbehandelte neurale Stammzellen nicht aufwiesen. Die Frequenz chim{\"a}rer Tiere konnte durch Verwendung bcl-2 transgener neuraler Stammzellen erh{\"o}ht werden und bereits in vitro wiesen wildtypische und bcl-2 transgene neurale Stammzellen unterschiedliche Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber der TSA/AzadC Behandlung auf. Diese von behandelten neuralen Stammzellen vermittelte Rekonstitution des h{\"a}matopoetischen Systems war langanhaltend und fand sowohl in der myeloiden als auch in der lymphoiden Linie statt. Eine erfolgreiche h{\"a}matopoetische Besiedlung war auch nach Transplantation klonaler neuraler Stammzellen zu beobachten, so daß eine Verunreinigung mit h{\"a}matopoetischen Zellen als Ursache der Rekonstitution ausgeschlossen werden konnte. Die beobachtete Generierung der morphologisch und ph{\"a}notypisch intakten h{\"a}matopoetischen Zellen aus neuralen Zellen war nicht das Ergebnis einer Zellfusion von Rezipientenzellen mit injizierten Donorzellen. Denn die h{\"a}matopoetischen Donorzellen trugen einen normalen 2n Karyotyp und wiesen keine Heterokaryons auf, die f{\"u}r Fusionen charakteristisch w{\"a}ren. Somit ist es m{\"o}glich, durch die Ver{\"a}nderung des Epigenotyps neuraler Stammzellen gefolgt von einer Transplantation in eine h{\"a}matopoetische Mikroumgebung eine Transdifferenzierung neuraler in h{\"a}matopoetische Zellen zu induzieren.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Faul2004,
  author    = {Faul, Thomas},
  title     = {Lokalisation und Dynamik der Replikationsproteine des murinen pr{\"a}-replikativen Komplexes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10473},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Lokalisation und der Dynamik der Replikationsproteine des murinen pr{\"a}-replikativen Komplexes in vivo. Dazu wurden die zu untersuchenden Replikationsproteine als EGFP-Fusionsproteine in LTK--Zellen exprimiert und am konfokalen Laserscanning-Mikroskop untersucht. CDC6-EGFP war in der G1-Phase diffus in Zellkern und Cytoplasma verteilt, am G1/S-{\"U}bergang ausschließlich im Zellkern lokalisiert und w{\"a}hrend der S-Phase in zahlreichen Foci im Kern akkumuliert. CDC6-EGFP war mit Replikationsfoci colokalisiert. Endogenes Cdc6p wies dieselbe subzellul{\"a}re Verteilung wie CDC6-EGFP auf. Auch Fusionsproteine des humanen Proteins Cdc6p waren in HEK-293T-Zellen in Replikationsfoci lokalisiert. FRAP-Studien ergaben, dass 80-90 \% von CDC6-EGFP w{\"a}hrend der gesamten S-Phase stabil mit der Replikationsmaschinerie assoziiert sind. Durch Mutation der Phosphoryliersstellen f{\"u}r Cyclin-abh{\"a}ngige Proteinkinasen wurde der Einfluss des Phosphorylierungsstatus der konservierten Serinreste der Cdk-Phosphorylierungsstellen auf die Lokalisation von CDC6-EGFP in vivo untersucht. Alle Mutanten bei denen die Cdk-Serinreste zu nicht-phosphorylierbaren Alaninresten mutiert wurden waren in Replikationsfoci lokalisiert. Dies zeigt, dass die Phosphorylierung dieser Serinreste f{\"u}r die Lokalisation von CDC6-EGFP an Stellen aktiver DNA-Replikation nicht essentiell ist. Durch Mutation der Serinreste zu Phosphatreste-simulierenden Aspartatresten konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des Serinrests S102 zum Export von CDC6-EGFP aus dem Zellkern f{\"u}hrt. FRAP-Studien ergaben, dass CDC6-EGFP in Replikationsfoci an Serinrest 82 phosphoryliert und an Serinrest 102 dephosphoryliert vorliegt. Mit Immunfluoreszenz-Analysen konnte gezeigt werden, dass Chromatin in Replikationsfoci nicht acetyliert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Elongation der DNA-Replikation an nicht-acetyliertem Chromatin erfolgt. Trichostatin A-induzierte Hyperacetylierung des Chromatins hatte keinen Einfluss auf Lokalisation und Mobilit{\"a}t von CDC6-EGFP in Replikationsfoci. Die Mobilit{\"a}t des nucleoplasmatischen CDC6-EGFP-Pools wurde dadurch erh{\"o}ht. In der G1-Phase wurde die Mobilit{\"a}t von CDC6-EGFP durch TSA verringert, woraus gefolgert werden kann, dass der Acetylierungsstatus des Chromatins in der G1-Phase die Mobilit{\"a}t von CDC6-EGFP beeinflusst. ORC1-EGFP war im Zellkern in großen kugelf{\"o}rmigen Strukturen lokalisiert, ORC2-EGFP war diffus in Cytoplasma und Zellkern verteilt. ORC3-EGFP akkumulierte in PML nuclear bodies. W{\"a}hrend ORC4-EGFP und ORC5-EGFP am Centrosom lokalisiert waren konnte ORC6-EGFP in Nucleoli nachgewiesen werden. Die EGFP-Fusionsproteine von Cdc45p, PCNA und DNA-Ligase-I waren im Zellkern lokalisiert, die Nucleoli waren ausgespart. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der Substratspezifit{\"a}t der murinen Cdc7p/Dbf4p-Proteinkinase. Die in Sf9-Zellen exprimierte und aufgereinigte Kinase phosphorylierte Orc2p, Orc6p, Cdc45p und Mcm6p. Mit Phosphopeptidkartierungen konnte gezeigt werden, dass Cdc7p von CylinE/Cdk2 an zwei Stellen und von CyclinA/Cdk2 an einer Stelle in vitro phosphoryliert wird. CDC7-EGFP war in der G1-Phase, am G1/S-{\"U}bergang und in der S-Phase im Kern lokalisiert. Durch FISH-Experimente konnte der genomische Locus des murinen Cdc7-Gens der Bande E von Chromosom 5 zugeordnet werden. Mit Kinase-Assays wurde untersucht, ob die murine Plk1p-Kinase Initiationsfaktoren der DNA-Replikation in vitro phosphoryliert. Die in Sf9-Zellen exprimierte Plk1p phosphorylierte Cdc7p, Orc2p und Orc6p. Cdc7p und Orc6p sind mit Plk1p am Midbody w{\"a}hrend der Telophase in vivo colokalisiert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Messung der Mobilit{\"a}t des murinen Transkriptions-Terminationsfaktors TTF-I mittels FRAP. EGFP-TTF-I und EGFP-NRD waren diffus in den Nucleoli verteilt, einzelne Areale waren ausgespart. EGFP-TTFdeltaN185 war hingegen in distinkten nucleol{\"a}ren Stellen akkumuliert. Mit FRAP-Studien konnte gezeigt werden, dass EGFP-TTFdeltaN185 in einer 10 \%igen immobilen Fraktion vorlag w{\"a}hrend das Gesamtprotein EGFP-TTF-I zu 100\% mobil war. Das Protein TIP5 interagiert mit TTF-I. EGFP-TIP5 war diffus im Nucleoplasma verteilt, die Ncleoli waren ausgespart. Durch Cotransfektionen verschiedener EYFP-TTF-I-Konstrukte mit EGFP-TIP5 konnte gezeigt werden, dass EGFP-TIP5 von EYFP-TTFdeltaN185 nicht in Nucleoli cotransportiert wird. Mit BRET-Studien ergaben, dass Orc6p mit TTF-I in vivo interagiert. Eine Interaktion mit TTFdeltaN185 war nicht nachweisbar.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Auth2005,
  author    = {Auth, Tanja},
  title     = {Funktionelle Analyse der Interaktion und Lokalisation von Replikationsfaktoren und replikationsrelevanten Proteinen in Mauszellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13082},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Zeil dieser Arbeit war die Identifikation von Proteinen, die mit Bestandteilen des f{\"u}r die DNA-Replikation essentiellen pr{\"a}replikativen Komplexes in der Maus wechselwirken. Hierbei konnten Interkationen des Heterochromatin Proteins 1a mit den Replikationsfaktoren ORC1, ORC2 und CDC6 sowohl in Two Hybrid-Studien als auch in Immunpr{\"a}zipitationen gezeigt werden. Dar{\"u}berhinaus konnten signifikante Kolokalisationen dieser Proteine mit HP1a an heterochromatischen Regionen in murinen NIH3T3-Zellen nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte hier erstmals eine Lokalisation von HP1a am Centrosom demonstriert werden. Ein siRNA-vermittelter Knock Down von HP1a zeigte jedoch keinen direkten Einfluß auf die Replikation. Es konnte hingegen gezeigt werden, daß ein Knock Down von HP1a in signifikatnen Defekten in der Cytokinese und einer deutlich verlangsamten Zellproliferation resultiert. So konnten h{\"a}ufig multinukle{\"a}re Zellen und eine Arretierung in der G1-Phase beobachtet werden. Weiterhin wurde der Einfluß der Phosphorylierung von HP1a durch die Casein Kinase II mithilfe von Phosphorylierungsmutanten untersucht. Im Gegensatz zu Drosophila-Zellen zeigten sich in murinen Zellen jedoch keine Auswirkungen dieser Mutationen auf die Lokalisation von HP1a an Heterochromatin. Wieterhin konnten Interaktionen des Replikationsinhibitors Geminin mit den Replikationsproteinen ORC1, ORC2 und CDC7 sowohl im Two Hybrid-System als auch in Immunpr{\"a}zipitationen gezeigt werden, die unterschiedliche Zellzyklusabh{\"a}ngigkeiten aufwiesen. In murinen NIH3T3-Zellen zeigte eine Knock Down von Geminin jedoch im Gegensatz zu anderen Zellinien keinen Einfluß auf die Replikation. In weiteren Teilen dieser Arbeit konnten Interaktionen des Retinoblastoma Proteins mit ORC2 und MCM7 sowohl in Two Hybrid- als auch in Immunpr{\"a}zipitations-Experimenten gezeigt werden. Dar{\"u}berhinaus wies Pescadillo Interaktionen mit den Replikationsproteinen ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 und CDC45 im Two Hybrid-System und Interaktionen mit MCM2 und MCM3 in Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten auf. Eine Kolokalisation von Pescadillo und ORC6 in den Nukleoli l{\"a}ßt auf eine Funktion beider Proteinen bei der Ribosomen Biogenese schließen. Es konnten ebenfalls Interaktionen der Untereinheit E1 des humanen Papillomavirus Subtyp 11 mit den Replikationsfaktoren ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb und Pescadillo im Two Hybrid-System beobachtet werden.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klein2005,
  author    = {Klein, J{\"o}rg},
  title     = {Verwendung von Gene-Targeting-Techniken zur Etablierung neuer Mauslinien mit Mutationen in B-Zell-Signalwegen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13615},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Das Hauptthema der hier vorliegenden Arbeit befaßt sich mit dem B-Zell spezifischen Oberfl{\"a}chenprotein CD22, einem Mitglied der Siglec (Sialins{\"a}ure bindende Ig{\"a}hnliche Lektine) Proteinfamilie. Dieses Transmembranprotein besitzt sieben extrazellul{\"a}re Immunoglobulin-{\"a}hnliche Dom{\"a}nen und kann {\"u}ber die {\"a}ußerste V-set Dom{\"a}ne seine Liganden: \&\#945;2,6 verkn{\"u}pfte Sialins{\"a}uren binden. CD22 hat eine Transmembrandom{\"a}ne und eine cytoplasmatische Dom{\"a}ne mit sechs potentiellen Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen drei eine ITIM-Sequenz (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) aufweisen. CD22 defiziente M{\"a}use zeigten eindeutig, daß das Siglec CD22 ein negativer Regulator des BCR-Signals ist. Durch BCR-Kreuzvernetzung wird CD22 tyrosinphosphoryliert, die inhibitorische Tyrosinphosphatase SHP-1 gebunden, aktiviert, und ist nun in der Lage das BCR Ca2+ Signal zu inhibieren. Um die Rolle der CD22Ligandenbindungsdom{\"a}ne, in vivo zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit eine CD22 knock -in Maus erzeugt werden (CD22R130E Maus), in der die Ligandenbindungsdom{\"a}ne von CD22 durch eine Punktmutation funktionell ausgeschaltet ist. In der hieraus resultierenden Mauslinie sollte dann die BZellentwicklung, Signaltransduktion und der Immunstatus analysiert werden. Der Vergleich des Ph{\"a}notyps der CD22R130E Maus und der CD22 defizienten Maus sollte dann zeigen, wie die Adh{\"a}sions- und Signalleitungseigenschaften von CD22 zusammenh{\"a}ngen. Der „Targeting" Vektor f{\"u}r die „Gene Targeting" Experimente wurde von der Arbeitsgruppe Dr. Anton van der Merwe (von Christina Piperi) angefertigt. Urspr{\"u}nglich wurde ein „Targeting" Vektor aus genomischer C57BL/6-DNA verwendet, um den genetischen Hintergrund der CD22-defizienten Maus beizubehalten. Dieser Vektor wurde von mir f{\"u}r ES-Zell Transfektionen in der C57Bl/6 ES-Zellline verwendet. Aus den Gene Targeting Experimenten mit der C57Bl/6-III ES-Zelllinie konnten zwei ES-Zellklone isoliert werden, die eine korrekte homologe Integration des Targetvektors trugen. Aus einem Blastozysteninjektions- Experiment mit einem Cre-deletierten C57BL/6-III Subklon wurden sechs hochchim{\"a}re M{\"a}use erhalten, mit denen allerdings keine Keimbahntransmission erzielt werden konnte. Nach Problemen mit Keimbahntransmission von Klonen aus der C57BL/6-III ESZelllinie, wurden noch die BALB/c und die E14Tg2a ES-Zelllinie f{\"u}r neue Gene Targeting Experimente verwendet. Die Experimente mit der BALB/c ES-Zelllinie ergaben keine ES-Zellklone mit korrekter homologer Integration, dies beruhte wahrscheinlich auf dem nicht isogenen Hintergrund. Alle folgenden Experimente mit der E14Tg2a ES-Zelllinie (genetischer Hintergrund: 129/ola) wurden mit dem verl{\"a}ngerten R130E-Targetvektor (Targetvektor 2), der mit 129/ola DNA um 2,3 Kb in 5'-Richtung verl{\"a}ngert wurde, um den isogenetischen Anteil des Targetvektors zu erh{\"o}hen, durchgef{\"u}hrt. Aus diesen Experimenten resultierten wiederum zwei ESZellklone, deren korrekte homologen Rekombination durch Southern Blot best{\"a}tigt werden konnten. Bei den darauffolgenden Blastozysten-Injektionsexperimenten mit diesen zwei E14Tg2a Klonen konnten f{\"u}nf chim{\"a}re Tiere gewonnen werden. Ein 80 \%ig chim{\"a}res M{\"a}nnchen erzeugte eine hohe Anzahl von Nachkommen mit Keimbahntransmission. Bei der Analyse dieser Tiere trat das Resultat zutage, daß alle diese Tiere mit Keimbahntransmission einen wildtypischen Genotyp besaßen. Ein weiteres Mitglied der Siglecproteinfamilie, das murine SiglecG (ein Ortholog zu humanem Siglec10), wurde in dieser Arbeit untersucht. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Paul Crocker sollte eine SiglecG knock out Maus hergestellt werden. Die Strategie f{\"u}r die Gene Targeting Experimente f{\"u}r einen SiglecG knock out basierten auf der Verwendung der BalbI ES-Zelllinie (aus BALB/c M{\"a}usen), da hiermit sehr gute Erfahrungen vorlagen, was die Stabilit{\"a}t ihrer Pluripotenz und des Keimbahntransmissionspotenzials angeht. Daher wurde im Labor von Paul Crocker (von Sheena Kerr) ein Kontroll- und ein Targetvektor kloniert, mit dem große Teile der ersten und zweiten Ig-Dom{\"a}ne von SiglecG ausgeschaltet werden sollte. Mit diesem Vektor f{\"u}hrte ich mehrere ES-Zell Transfektionsexperimente durch. Innerhalb der Zeitspanne meiner Doktorarbeit konnten keine ES-Zellklone mit einem korrekten homologen Integrationsereignis gewonnen werden. Mittels der urspr{\"u}nglichen Strategie konnte die mir nachfolgende Doktorandin jedoch ES-Zell Klone isolieren, nach Blastozysteninjektion Keimbahntransmission erzielen und somit eine SiglecGdefiziente Maus generieren. Eine andere Zusammenarbeit kam mit Dr. Burkhard Kneitz (Physiologisches Chemie I, Biozentrum, Universit{\"a}t W{\"u}rzburg) zustande. Seine Intention war es, die Rolle des TGF-\&\#946; Signalmediators SMAD2 auf B-Zellebene n{\"a}her zu untersuchen. Von Erwin B{\"o}ttinger bekamen wir eine Mauslinie, in der das Smad2-Gen gefloxt ist, die mit der CD19-Cre Maus gekreuzt wurde. So wurde eine B-Zell spezifische SMAD2 knock out Maus (bSmad2-/-) erzeugt. Meine Aufgabe bestand darin, die B-Zellkompartmente und die Immunantworten der B-Zell spezifischen Smad2-defizienten Maus zu analysieren. Faßt man alle gewonnenen Daten aus den hier generierten B-Zell spezifischen Smad2 knock out Tieren zusammen, so kann man zu dem klaren Ergebnis kommen, daß der TGF-\&\#946; Signalmediator Smad2 eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von TGF-\&\#946; Signalen in das Zellinnere von B-Zellen spielt. Hierbei zeigten sich klare Ver{\"a}nderungen, im Vergleich zu Kontrolltieren, eine Erh{\"o}hung der Zellzahl in den Peyerschen Plaques (PP), und der B1-Zellen im Peritoneum. Die IgA-Immunantwort war in bSmad-/- Tieren stark erniedrigt. Der f{\"u}r TGF-\&\#946; beschriebene Effekt der Proliferationshemmung von aktivierten B-Zellen war bei aktivierten B-Zellen der bSmad2-/- M{\"a}use hingegen nicht beeintr{\"a}chtigt.},
  subject      = {B-Lymphozyt},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rabie2005,
  author    = {Rabie, Tamer},
  title     = {Cellular regulation of platelet glycoprotein VI : in vivo and in vitro studies in mice},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14267},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Platelet interaction with the subendothelium is essential to limit blood loss after tissue injury. However, upon rupture of atherosclerotic plaques, this interaction may result in blood vessel occlusion leading to life threatening diseases such as myocardial infarction or stroke. Among the subendothelial matrix proteins, collagen is considered to be the most thrombogenic component as it directly activates platelets. Platelets interact with collagen, either indirectly through glycoprotein (GP) Ib-V-IX receptor complex, or directly through the major collagen receptor on the platelet surface, GPVI. The work presented here focused on studying the cellular regulation of GPVI. In addition, a possible role for GPVI in thrombus formation induced by atherosclerotic plaque material was investigated and it was found that GPVI plays an important role in this process. Using a recently published mitochondrial injury model, it was found that GPVI contains a cleavage site for a platelet-expressed metalloproteinase. Further studies showed that platelet activation by CRP, or thrombin induced down-regulation of GPIb\&\#61537;, but not GPVI. In parallel, cellular regulation of GPV was studied and it was found that GPV is cleaved in vitro by the metalloproteinase ADAM17. In previous studies it was shown that injection of mice with the anti-GPVI mAb, JAQ1, induces GPVI down-regulation, which is associated with a strong, but transient, thrombocytopenia. Using new anti-GPVI mAbs, which bind different epitopes on the receptor, it is shown in this study that GPVI down-regulation occurs in an epitope-independent manner. Further experiments showed that antibody treatment induces a transient, but significant increase in bleeding time. Using different genetically modified mice, it is shown that, upon antibody injection, GPVI is both, shed from the platelet surface and internalized into the platelet. Signaling through the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) of the FcR\&\#61543; chain is essential for both processes, while LAT and PLC\&\#61543;2 are essential for the shedding process only. Antibody-induced increase in bleeding time and thrombocytopenia were absent in LAT deficient mice, showing that it is possible to uncouple the associated side effects from the down-regulation process. As antibody-induced GPVI internalization still occurs in LAT and PLC\&\#61543;2 deficient mice, this suggests a novel signaling pathway downstream of GPVI that has not been described so far.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Brand2005,
  author    = {Brand, Normen},
  title     = {Lokalisation, Regulation und Interaktionen muriner DNA-Replikationsproteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14057},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gew{\"a}hrleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform f{\"u}r weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abh{\"a}ngigkeit von Cdc6 und Cdt1 den pr{\"a}-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase f{\"u}r die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies erm{\"o}glicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen f{\"u}r drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und r{\"a}umlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivit{\"a}t und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgef{\"u}hrt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate f{\"u}r die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufkl{\"a}rung von Protein-Protein-Interaktionen ist f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Vorg{\"a}nge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 \& Orc3, Orc2 \& Orc4, Orc2 \& Orc5, Orc4 \& Orc6, Plk1 \& Orc2 und Plk1 \& Dbf4 gezeigt werden. Zus{\"a}tzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abh{\"a}ngigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch {\"u}berexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung f{\"u}r die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschr{\"a}nkt ist. Mit der erst k{\"u}rzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukle{\"a}re Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukle{\"a}re Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilit{\"a}t des bin{\"a}ren Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erh{\"o}hten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 f{\"u}hrt. Zus{\"a}tzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzellul{\"a}re Lokalisation und die intranukle{\"a}re Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilit{\"a}t von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bundschu2005,
  author    = {Bundschu, Karin},
  title     = {Generation and characterization of spred-2 knockout mice},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14333},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Spreds are a new Sprouty-related family of membrane-associated proteins inhibiting the MAPK signaling pathway by interacting with Ras and Raf-1. Different studies have already demonstrated the inhibitory function of Spreds in cell culture systems, but the in vivo function of Spreds in the whole organism was still unclear. Therefore, Spred-2 knockout mice were generated using a gene trap approach. The Spred-2 deficiency was verified on RNA and protein levels and the lack of functional Spred-2 protein in mice caused a dwarf phenotype similar to achondroplasia, the most common form of human dwarfism. Spred-2-/- mice showed reduced growth and body weight, they had a shorter tibia length and showed narrower growth plates as compared to wildtype mice. Spred-2 promoter activity and protein expression were detected in chondrocytes, suggesting an important function of Spred-2 in chondrocytes and bone development. Furthermore, stimulation of chondrocytes with different FGF concentrations showed earlier and augmented ERK phosphorylation in Spred-2-/- chondrocytes as compared to Spred-2+/+ chondrocytes. These observations suggest a model, in which loss of Spred-2 inhibits bone growth by inhibiting chondrocyte differentiation through upregulation of the MAPK signaling pathway. An additional observation of Spred-2-/- mice was an increased bleeding phenotype after injuries, whereas the bleeding volume was extremely enlarged and the bleeding time was significantly prolonged. So far, hypertension as cause could be excluded, but to discover the physiological reasons for this phenotype, the different steps of the clotting cascade have to be investigated further. As the Spred-2 promoter activity studies demonstrated a high and specific Spred-2 expression in vascular smooth muscle cells and previous studies showed an interaction of Spreds with RhoA, a key regulator of vascular smooth muscle contraction, the regulation of smooth muscle contractility seems to be a good candidate of this phenomenon. Moreover, Spred-1 and Spred-2 specific antibodies were generated as important tools to study the protein expression patterns in mice. Furthermore, nothing was known about the Spred-2 promoter region and its regulation. Here, a detailed in situ analysis of the physiological promoter activity profile in the gene trapped Spred-2-deficient mouse strain was shown. In these mice, the beta-galactosidase and neomycin fusion gene (\&\#946;-geo) of the gene trap vector was brought under control of the endogenous Spred-2 promoter, giving the opportunity to monitor Spred-2 promoter activity in practically every organ and their corresponding sub-compartments. X-Gal staining of sections of newborn and adult mice revealed 1) a very high Spred-2 promoter activity in neural tissues and different glands; 2) a high activity in intestinal and uterine smooth muscle cells, and kidney; 3) a low activity in heart, testis, lung, and liver; 4) an almost lacking activity in skeletal muscle and spleen, and 5) very interestingly, a very distinct and strong activity in vascular smooth muscle cells. Moreover, comparison of newborn and adult mouse organs revealed a nearly congruent Spred-2 promoter activity. These detailed data provide valuable information for further studies of the physiological functions of Spred-2 in organs showing strong Spred-2 promoter activity, which are in most of these organs still unclear. Finally, gene targeting vectors for Spred-1 and Spred-2 were cloned, to generate ES cells with a floxed exon 2 of the Spred-1 and Spred-2 gene, respectively. Now, these ES cells are valuable tools to establish conditional knockout mice. This is of major interest to investigate the physiological tissue specific functions of Spred-1 and Spred-2, especially if the double knockout mice are not viable.},
  subject      = {Spred Protein},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Toben2005,
  author    = {Toben, Catherine Gisela},
  title     = {Generation and analysis of transgenic mice expressing ovalbumin as a neo-self antigen under control of the myelin basic protein promoter},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16708},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {In this project two novel murine autoimmune models were to be established in an attempt to further investigate the nervous system disorders of Multiple Sclerosis and Guillain Barr{\´e} Syndrome. Previous experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and experimental autoimmune neuritis (EAN) models have demonstrated that T cells play a major role in these diseases. Which roles CD4 and CD8 T cells specifically have in the initiation, propagation and termination of an autoimmune nervous system disorder remains controversial. To this end two transgenic mice specifically expressing the neo-antigen (Ag) ovalbumin (OVA) in either the central nervous system (CNS) or peripheral nervous system (PNS) were to be generated. The myelin basic protein (MBP) is a major component of the myelin sheath both within the CNS and the PNS. Therefore the MBP promoter was employed for its distinct regulatory elements to facilitate exclusive CNS or PNS OVA expression. The adoptive transfer of OVA specific MHCI restricted (OT-I) and MHCII restricted (OT-II) TCR Tg T cells extended the OVA Tg mouse model by allowing potentially encephalitogenic T cells to be tracked in vivo. Specificity for the target Ag should enable the dynamic role of antigen specific T cells in neuroinflammatory diseases to be revealed in more detail.},
  subject      = {Multiple Sklerose},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Glueckert2006,
  author    = {Gl{\"u}ckert, Eva-Katharina},
  title     = {Charakterisierung eines Antiserums gegen BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und Optimierung von Methoden zum immunhistochemischen Nachweis von BDNF im Hippocampus der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18696},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF geh{\"o}rt neben NGF, NT-3 und NT-4/5 zur Familie der Neurotrophine. Er spielt eine wichtige Rolle f{\"u}r {\"U}berleben und Differenzierung von Nervenzellen und ist insbesondere auch verantwortlich f{\"u}r die Regulation synaptischer Plastizit{\"a}t. Besonders im Hippocampus, dem Ort der h{\"o}chsten Expression von BDNF im adulten Gehirn, wirkt BDNF bei den Vorg{\"a}ngen von Lernen und Ged{\"a}chtnis mit, welches als Ph{\"a}nomen der LTP untersucht werden kann. Bisher ist eine Lokalisation von BDNF-Protein mittels Immunfluoreszenz-Techniken im Gehirn der Maus oder Ratte nur sehr schwer gelungen. In den meisten Arbeiten gelang die Lokalisation von BDNF {\"u}ber den Nachweis von mRNA oder im Western Blot, die Gruppe von Conner et al. konnte einen qualitativen Nachweis von BDNF-Protein mittels eines eigens hergestellten Antiserums erbringen (Conner et al. 1997). Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Antiserums gegen BDNF zur subzellul{\"a}ren Lokalisation mittels Immunhistochemie. Durch die Verwendung von Immunfluoreszenz-gekoppelten Sekund{\"a}rantik{\"o}rpern sollte zum einen eine quantitative Bestimmung von BDNF m{\"o}glich sein, zum anderen sollte durch die M{\"o}glichkeit einer nahezu dreidimensionalen Darstellung des Gewebes mittels Vibratomschnitten auch eine Aussage {\"u}ber eine genauere Lokalisation von BDNF gemacht werden k{\"o}nnen. Um den immunhistochemischen Nachweis von BDNF-Protein im Hippocampus der Maus mittels Immunfluoreszenz f{\"u}hren zu k{\"o}nnen, wurde zun{\"a}chst ein geeignetes Anti-serum ben{\"o}tigt. Zwei zu Vergleichszwecken ausgetestete kommerzielle Antik{\"o}rper zeigten keine F{\"a}rbung. Nach dem Vorbild zweier Arbeitsgruppen (Yan et al. 1997b und Conner et al. 1996, 1997) wurde ein Antiserum gegen humanes rekombinantes BDNF in Kaninchen hergestellt. Das Antiserum erhielt den Namen „BDNF RabbitB". Die Spezifit{\"a}t des Antiserums wurde mittels Western Blot und in der Zellkultur anhand von H{\"u}hnchen-DRGs {\"u}berpr{\"u}ft. Im Western Blot zeigte das Antiserum eine spezifische Anf{\"a}rbung von rekombinantem BDNF sowie im Hippocampus-Proteinextrakt. In der Kontrolle mit Pr{\"a}immunserum zeigte sich keine Anf{\"a}rbung. In der Zellkultur mit H{\"u}hnchen-DRGs konnte eine blockierende Wirkung des Antiserums in Gegenwart von BDNF als neurotrophem Wachstumsfaktor im Zellkulturmedium nachgewiesen werden, es zeigte sich eine signifikante Reduktion des {\"U}berlebens von Zellen bei einer Verd{\"u}nnung des Antiserums von 1:1.000. Das Pr{\"a}immunserum zeigte keine Wirkung. Eine Kreuzreaktivit{\"a}t mit NGF als struktur{\"a}hnlichem Protein konnte ausgeschlossen werden, da das Antiserum in Gegenwart von NGF im Kulturmedium keine Wirkung zeigte. Anschließend galt es, die Methoden f{\"u}r die Immunhistochemie mit diesem Antiserum zu optimieren, da es Hinweise gab, daß gerade die Immunhistochemie neurotropher Faktoren sehr sensibel auf verschiedene Methoden reagiert. Daher wurden sowohl die Fixierungsmethode, unterschiedliche Gewebeschnitte, verschiedene Puffersysteme und immunhistochemische F{\"a}rbemethoden untersucht und verglichen. Die Standard-Fixierungsmethode mit Phosphat-Puffer, modifiziert nach der Methode nach Yan et al. 1997b mit maximal 2 h Nachfixierung stellte sich als beste Methode heraus. Eine Kombination zweier verschiedener Puffer (TBS und PB) innerhalb der Fixierung ist ung{\"u}nstig. Daher sollte innerhalb einer Methode immer bei einem Puffersystem geblieben werden, wobei hier insgesamt bei dem Vergleich von PBS, TBS und TRIS-Puffer sowohl in der Fixierung als auch in der F{\"a}rbemethode dem Phosphat-Puffer der Vorzug gegeben wird, welches auch das Standard-System darstellt. Bei den Gewebeschnitten sind, wie urspr{\"u}nglich geplant Vibratomschnitte zu bevorzugen. Insgesamt konnten jedoch m{\"o}gliche Ursachen f{\"u}r die Anf{\"a}lligkeit der BDNF-Immunreaktivit{\"a}t bei Fixierungs- und F{\"a}rbemethoden hier nicht abschließend erkl{\"a}rt werden. Problematisch war die ausgepr{\"a}gte Hintergrundf{\"a}rbung des Antiserums v.a. in der Immunhistochemie, die nicht ausreichend behoben werden konnte. Insofern sollte das Antiserum f{\"u}r die Verwendung bei immunhistochemischen F{\"a}rbungen noch weiter optimiert werden. F{\"u}r die Verwendung in der Zellkultur ist das Antiserum auf Grund seiner BDNF-blockierenden Eigenschaften gut einsetzbar. Im Western Blot sollte „BDNF RabbitB" in einer Verd{\"u}nnung von 1:5.000, in Zellkultur mit 1:1.000 und in der Immunhistochemie mit Vibratomschnitten mit 1:2.000 eingesetzt werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Steidl2006,
  author    = {Steidl, Christian},
  title     = {Funktionsanalyse des notch-Zielgens heyL und verwandter bHLH-Transkriptionsfaktoren in der Entwicklung der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18557},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {In der Embryonalentwicklung von Insekten, Nematoden und Vertebraten reguliert der delta-notch-Signalweg vielf{\"a}ltige Zelldifferenzierungsvorg{\"a}nge wie die laterale Inhibierung, Zelllinien-Entscheidungen und die Bildung von Grenzen. In Vertebraten aktivieren die transmembranen Liganden delta-like 1, 3 oder 4, bzw. jagged 1 oder 2 einen notch-Rezeptor (notch1, 2, 3 oder 4). Dessen intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne bildet im Zellkern mit rbp-j\&\#61547; und weiteren Proteinen einen Aktivator-Komplex, der an den Promotor der notch-Zielgene bindet. Neben drei hes-Genen z{\"a}hlen dazu die Gene hey1, hey2 und heyL, die alle eng verwandt sind mit hairy und den Genen des Enhancer of Split-Komplexes (E(spl)) bei Drosophila melanogaster. Die hey-Gene sind in der Maus unter anderem w{\"a}hrend der Entwicklung von Niere, Arterien, Herz, Nervensystem, Thymus und Somiten spezifisch exprimiert. Um die Bedeutung des heyL-Gens f{\"u}r die Bildung dieser Organe zu untersuchen, wurden heyL-Knockoutm{\"a}use generiert, bei denen jedoch keine morphologischen Ver{\"a}nderungen oder Erkrankungen erkennbar waren. Die durch entsprechende Verpaarung erhaltenen heyL/1-Doppelknockoutm{\"a}use wiesen in der F9-R{\"u}ckkreuzungsgeneration einen Ventrikel-Septum-Defekt (VSD) auf und verstarben gr{\"o}ßtenteils ein bis zwei Tage nach der Geburt. {\"A}hnliche Krankheitssymptome zeigen die mit anderen Komponenten des delta-notch-Signalweges in Verbindung gebrachten Erbkrankheiten „Fallot´sche Tetralogie" (ToF) und das Alagille Syndrom (AGS). Vergleichbare VSDs treten auch bei hey2-Knockoutm{\"a}usen auf. Es stellte sich daher die Frage, welche Zielgene des hey2-Transkriptionsfaktors an der Herzbildung beteiligt sind. Literaturbekannte HEY2-Zielgen-Kandidaten sind beim Menschen Follistatin (FST), Keratin 2-7 (KRT2-7) und das epitheliale V-{\"a}hnliche Antigen (EVA1). Durch antisense RNA in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutmausschnitten konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster entdeckt werden. Eigene Microarray-Analysen mit RNA aus hey2-{\"u}berexprimierenden, humanen 293-Zelllinien identifizierten das Neurofilamentgen NEFL als HEY2-Zielgenkandidat. Bei der in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutm{\"a}usen mit einer Probe f{\"u}r das nefl-Gen konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster erkannt werden, so dass nefl in vivo vermutlich komplexer reguliert wird. Neben den Ventrikel-Septum-Defekten zeigen die heyL/1-Doppelknockoutm{\"a}use einen zweiten abnormalen Ph{\"a}notyp. Die embryonalen Thymi dieser Tiere sind kleiner als die der wildtypischen M{\"a}use. Die detaillierte Analyse der Thymozyten-Subpopulationen erbrachte, dass die niedrigere Zellzahl vor allem zu Lasten der doppelt positiven Thymozyten geht. Grund hierf{\"u}r k{\"o}nnte eine teilweise Blockierung der Entwicklung zwischen der zweiten und dritten Phase des zuvor durchlaufenen doppelt negativen Stadiums sein, denn die absolute Zahl der DN3-Thymozyten ist um {\"u}ber 90 Prozent verringert. Die Blockierung des delta-notch-Signalweges durch Zugabe eines \&\#61543;-Sekretase-Inhibitors f{\"u}hrte ebenfalls zu einer Verringerung der DN3-Zellen in der gleichen Gr{\"o}ßenordnung, jedoch im Gegensatz zu den heyL/hey1-Doppelknockout-Thymi gleichzeitig zur Verdreifachung der absoluten Zahl der DN2-Zellen. Diese Unterschiede unterstreichen die Bedeutung weiterer notch-Zielgene wie beispielsweise hes1. Ob die beobachteten Ver{\"a}nderungen in der Entwicklung der Thymozyten Folgen f{\"u}r die Immunabwehr haben, wurde im Rahmen von Immunisierungen mit Trinitrophenyl (TNP)-Ovalbumin untersucht. Hierbei zeigte sich eine Erh{\"o}hung der IgG2a und IgG2b Werte und eine Reduktion der IgG1 Produktion bei den heyL/hey1-Doppelknockoutm{\"a}usen, w{\"a}hrend die IgM-Werte zwischen den verschiedenen Mausgenotypen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen. Die IgG-Ver{\"a}nderungen deuten darauf hin, dass die T-Zellen vermehrt in die TH1-Zelldifferenzierungsrichtung getrieben werden und die TH2-Cytokinproduktion verringert ist. Bei den hey-Knockoutm{\"a}usen waren aufgrund des Expressionsprofils der hey-Gene nicht nur Ver{\"a}nderungen in der Herzentwicklung und im Thymus erwartet worden, sondern auch in der Somitogenese. Dies gilt im Besonderen f{\"u}r die bereits zuvor generierten hey2-Knockoutm{\"a}use, denn hey2 ist im pr{\"a}somitischen Mesoderm zyklisch exprimiert. Im Gegensatz zu den Knockoutm{\"a}usen des verwandten und ebenfalls zyklisch exprimierten hes1-Gens, litten jedoch weder die heyL/hey1-Doppelknockoutm{\"a}use, noch die hey2-Knockoutm{\"a}use an Defekten in der Somitogenese. W{\"a}hrend die Bedeutung der Genexpression der hey-Gene in der Somitogenese weiterhin unklar sind, konnten Erkenntnisse {\"u}ber die Funktionen von heyL und hey1 in der Herzentwicklung und bei der Ausreifung der Thymozyten gewonnen werden. Die Identifizierung von hey-Zielgenen in diesen Entwicklungsprozessen kann das Verst{\"a}ndnis des delta-notch-Signalweges erweitern, die Ursachen von Erbkrankheiten aufkl{\"a}ren helfen und m{\"o}glicherweise Therapiestrategien aufzeigen.},
  subject      = {Gen notch},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Xiang2006,
  author    = {Xiang, Chaomei},
  title     = {The role of B-RAF in embryonic development of mouse forebrain},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18326},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Die Familie der RAF-Kinasen umfasst drei Mitglieder, A-RAF, B-RAF und C-RAF. Nur f{\"u}r die B-RAF-Isoform wurde eine wichtige Funktion f{\"u}r die Entwicklung des Zentralen Nervensystems (ZNS) gefunden. Das Fehlen von B-RAF f{\"u}hrt bei neu generierten embryonalen Neuronen zum Zelltod, weil sie in vitro nicht auf {\"u}berlebensfaktoren reagieren k{\"o}nnen. Bei einer zweiten Zelllinie, die durch die Abwesenheit von B-RAF beeintr{\"a}chtigt ist, handelt es sich um endotheliale Zellen. Ihr Zelltod f{\"u}hrt zu inneren Blutungen und zu Letalit{\"a}t von B-RAF-/--M{\"a}usen zwischen Tag 10.5 (E10.5) und 12.5 (E12.5) der Embryonalentwicklung. Dies verhinderte bisher weitere Untersuchungen der neuralen B-RAF-Funktion bei sp{\"a}teren Stadien. Im Gegensatz zu B-RAF-/--M{\"a}usen {\"u}berleben B-RAFKIN/KIN-M{\"a}use die Mitte der Embryonalentwicklung, da ihre Endothelzellen vor Apoptose gesch{\"a}tzt sind. Diese Tiere besitzen kein B-RAF, stattdessen wird im B-RAF-Locus ein chim{\"a}res Protein exprimiert, das den N-Terminus von B-RAF sowie alle Dom{\"a}nen von A-RAF umfasst. Der Schutz vor abnormaler neuraler Apoptose im Vorderhirn macht diese Tiere zu einem potentiellen Modell zur Untersuchung der Proliferations- und Differenzierungsfunktion von B-RAF, die die Kinase neben der {\"U}berlebensfunktion in der ZNS-Entwicklung aus{\"u}bt. Die detaillierte Untersuchung der B-RAFKIN/KIN-Tiere konzentrierte sich auf die Entwicklung der Hirnrinde. Augenscheinlich waren kortikale Defekte im B-RAFKIN/KIN Vorderhirn: Der Verlust von B-RAF f{\"u}hrte zu einer starken Reduzierung von Brn-2 exprimierenden pyramidalen Projektions-Neuronen begleitet von einer St{\"o}rung der Dendritenbildung mit weniger und d{\"u}nneren Dendriten in diesen oberen Schichten. Weitere Untersuchungen mit BrdU-Markierungsexperimenten zeigten in der ventrikul{\"a}ren Schicht reduzierte Zellproliferation f{\"u}r E14.5-E16.5 der Mutantenembryonen und ein Migrationsdefizit der sp{\"a}tgebideten kortikalen Neuronen. W{\"a}hrend der Proliferationsdefekt der Hirnrinden-Vorl{\"a}uferzellen mit einer reduzierten ERK-Aktivierung einherging, bleibt der Mechanismus der gest{\"o}rten neuralen Migration zu erkl{\"a}ren. Unsere Hypothese ist, dass die subzellul{\"a}re Lokalisation von Phospho-ERK in den wandernden Hirnrinden-Neuronen der B-RAFKIN/KIN-M{\"a}use ver{\"a}ndert sein k{\"o}nnte. Zur Best{\"a}igung der in vivo-Funktion von B-RAF und weiteren Studien zu ihrer unbekannten Rolle in der embryonalen Neurogenese sowie anderen Morphogenesen w{\"a}re die konditionale B-RAF Inaktivierung erforderlich. Durch die Deletion des genetischen Materials bzw. die Inaktivierung der Genfunktion in ausgew{\"i}?'½hlten Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt ließen sich die Embryo-Letalit{\"a}t sowie unerw{\"u}nschte pleiotrope Nebeneffekte vermeiden und akkumulierende, kompensierende Entwicklungsver{\"a}nderungen von Beginn an ausschließen. Um die Cre Rekombinase-Methode einsetzen zu k{\"o}nnen, wurden floxed B-RAF embryonale Stammzell (ES)-Zelllinien generiert. Außerdem wurde ein auf dem Tetrazyklin Operator basierendes Schaltallel in den B-RAF Genort von embryonalen Stammzellen integriert, so dass die B-RAF Expression konditional und reversibel durch die Zugabe von Doxyzyklin angeschaltet werden konnte. Bisher wurden hochgradige chim{\"a}re M{\"a}use nach Blastozysten-Injektion geboren. Die Keimbahn{\"u}bertragung dieser chim{\"a}ren M{\"a}use wird momentan untersucht. Wenn beide konditionale Mauslinien bereit sind, k{\"i}?'½nnte die Entwicklung ihres Zentralnervensystems untersucht werden, um die Rolle von B-RAF in der Entwicklung des Nervensystems herauszufinden.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Loeffler2006,
  author    = {L{\"o}ffler, Daniela Inge Martina},
  title     = {Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes St{\"a}mme als Impfstofftr{\"a}ger im Mausmodell},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Virulenzattenuierte St{\"a}mme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Tr{\"a}ger f{\"u}r heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem prim{\"a}ren phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpr{\"a}sentierenden Zellen (APC). Diese F{\"a}higkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete {\"U}bertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Pr{\"a}sentationswege, um so eine effektive zellul{\"a}re Immunit{\"a}t zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm \&\#61508;trpS St{\"a}mme in das Zytosol von antigenpr{\"a}sentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterst{\"u}tzt. Die {\"U}bertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Molek{\"u}le durch die autolysierenden Listerien f{\"u}hrte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Pr{\"a}sentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zellul{\"a}re Immunit{\"a}t unter Beteiligung von T-Ged{\"a}chtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die {\"U}bertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellul{\"a}ren adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Ged{\"a}chtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA {\"u}bertrugen, l{\"o}sten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Tr{\"a}gerstamm Lm \&\#61508;trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei h{\"o}her Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollst{\"a}ndigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch st{\"a}rker attenuierter autolysierender Lm St{\"a}mme als {\"U}bertr{\"a}ger des Ovalbumins (Lm Mutanten \&\#61508;trpS hlyW491A und \&\#61508;(trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide erm{\"o}glichten die OVA-Pr{\"a}sentation {\"u}ber MHC-Klasse-I-Molek{\"u}le mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm \&\#61508;trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Pr{\"a}sentation des OVAs {\"u}ber MHC-Klasse-I-Molek{\"u}le durch die autolysierende Mutante \&\#61508;trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm \&\#61508;(trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5\&\#61620;107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Tr{\"a}ger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm \&\#61508;trpS eine sehr geringe Lebersch{\"a}digung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm \&\#61508;(trpS aroA aroB) St{\"a}mmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellul{\"a}r verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare H{\"a}ufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm \&\#61508;(trpS aroA aroB) OVA-Tr{\"a}gerst{\"a}mme. Die Strategie der {\"U}bertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpr{\"a}sentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpr{\"a}sentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten f{\"u}r die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der urspr{\"u}nglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die urspr{\"u}ngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 f{\"u}r die {\"U}bertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien f{\"u}hrte.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schuetz2006,
  author    = {Sch{\"u}tz, Wolfgang},
  title     = {Postmeiotische Expression und funktionelle Charakterisierung von Lamin B3 in der Spermatogenese der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17110},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Die Lamine geh{\"o}ren zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernh{\"u}lle eukaryontischer Zellen. In S{\"a}ugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernh{\"u}lle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enth{\"a}lt eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellul{\"a}ren Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien w{\"a}hrend der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernh{\"u}lle und {\"u}berraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina w{\"a}hrend der S{\"a}uger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in S{\"a}ugern das erste Beispiel f{\"u}r ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen f{\"u}hrt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenf{\"o}rmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Ver{\"a}nderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale St{\"a}bchendom{\"a}ne in Lamin B3 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Dar{\"u}ber hinaus zeigte das Protein eine stark erh{\"o}hte L{\"o}slichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching" (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching" (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Molek{\"u}le eine hohe Mobilit{\"a}t aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze St{\"a}bchendom{\"a}ne begr{\"u}ndet ist. Die Ergebnisse f{\"u}hren zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernh{\"u}lle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung f{\"u}r einige Vorg{\"a}nge in der Spermiogenese sein k{\"o}nnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminos{\"a}uren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde {\"u}ber einen „Pull-Down-Assay" nach m{\"o}glichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie geh{\"o}ren zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und sp{\"a}teren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch {\"u}berpr{\"u}ft werden, w{\"u}rde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernh{\"u}lle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es f{\"u}r die Kernh{\"u}llenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem w{\"a}re es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Dom{\"a}ne von Lamin B3.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ritter2006,
  author    = {Ritter, Christian Oliver},
  title     = {Langzeitverlauf der linksventrikul{\"a}ren Hypertrophie von M{\"a}useherzen nach Aortenbanding - nichtinvasive Charakterisierung mittels schneller hochaufl{\"o}sender in vivo Magnetresonanztomographie -},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20940},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Diese Arbeit zeigt den zeitlichen Verlauf der geometrischen und funktionellen kardialen {\"A}nderungen w{\"a}hrend chronischer Druckinduktion des M{\"a}useherzens nach kontrollierter Banding-Operation der Aorta thoracalis im Langzeitverlauf von insgesamt 26 Wochen. Als Kontrollgruppe dienten Tiere, die sich zum gleichen Zeitpunkt einer Pseudo-Operation (Sham-Operation) unterzogen. Zur Erfassung der kardialen Funktionsparameter sowie der Dynamik wurde schnelle hochaufl{\"o}sende MR-Kinobildgebung in einem 7 Tesla Magneten mit Hilfe eines Mikroskopie-Gradientensystems unter Isofluran-Narkose durchgef{\"u}hrt. Erfasst wurden hierbei die Parameter enddiastolisches Volumen (EDV), endsytolisches Volumen (ESV), Schlagvolumen (SV), Auswurffraktion (EF), Herzminutenvolumen (HMV), Herzindex (CI), linksventrikul{\"a}re (LV) Masse, LV-Massenindex, LV-Wanddicke endsytolisch und enddiastolisch sowie LV-Entleerungs- und F{\"u}llungsrate. Zus{\"a}tzliche Zeit-Volumen-Kurven wurden berechnet. Zu jedem Untersuchungszeitpunkt wurde eine histologische Aufarbeitung des linken Ventrikels durchgef{\"u}hrt. Die Kardiomyozytengr{\"o}ße wurde nach einer H{\"a}malaun-Eosin-(HE)-F{\"a}rbung planimetrisch lichtmikroskopisch bestimmmt. Der Grad der einsetzenden Fibrose wurde mit einer Picro-Sirius-Rot(PSR)-F{\"a}rbung und nachfolgender Mikroskopie mit zirkul{\"a}r polarisiertem Licht bestimmt. Es zeigten sich die typischen linksventrikul{\"a}ren Ver{\"a}nderungen der druckinduzierten Hypertrophie, die sich in vier Stufen einteilen l{\"a}sst: Akutphase bis sieben Tage nach Operation, Kompensationsphase bis zwei Wochen nach Operation, Umbauphase bis sieben Wochen nach Operation und die Dekompensationsphase ab sieben Wochen nach Operation. Die Kollagendichte hatte sich zum Beispiel 26 Wochen nach Operation verdoppelt im Vergleich zur Erstuntersuchung. Die zeitliche, funktionelle und histologische Erfassung der linksventrikul{\"a}ren Hypertrophie ist eine wichtige Grundlage f{\"u}r die Planung weiterer Studien, besonders in Hinblick auf den Einsatz von Modellen mit transgenen Tieren sowie Tieren mit Gen-Knockout. Vorteil der kardialen mikroskopischen Magnetresonanztomographie (MRT) ist der Einsatz als Kontrollmethode der Auswirkungen der genetischen Manipulation nahezu direkt nach der Geburt. Entscheidend ist die umfassende kardiovaskul{\"a}re Ph{\"a}notyp-Charakterisierung der Maus als Schl{\"u}ssel f{\"u}r die Anwendung der experimentell gewonnen Erkenntnisse zum weiteren Verst{\"a}ndnis der Morphologie und funktionellen Abl{\"a}ufe des Herzen sowie der sich daraus ableitenden Therapiem{\"o}glichkeiten am menschlichen Herzen. Eine Anwendung dieser Bildgebungsmethode an der Maus ist in der Zukunft zum Beispiel auch denkbar f{\"u}r die Untersuchung von Remodeling-Prozessen nach Myokard-Infarkt, regionaler Herzmuskelfunktion unter Verwendung der Stress-Cinematographie, MR-Tagging- sowie Phasenkontrast-Bildgebung und der myokardialen First-Pass-Perfusionsbildgebung in Kombination mit dem sp{\"a}ten Kontrastmittel-Enhancement nach Myokardinfarkt.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gogishvili2006,
  author    = {Gogishvili, Tea},
  title     = {Immunotherapy of allergic disorders in a mouse model of allergic airway inflammation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19304},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Allergische Erkrankungen sind St{\"o}rungen, bei denen es zu Immunfehlregulationen kommt und die bei empf{\"a}nglichen Individuen zur Entstehung von Allergen spezifischen T-Helfer 2 (TH2) Immunantworten f{\"u}hren. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die f{\"u}r Soforttypallergien charakteristischen TH2 Immunantworten sowohl durch nat{\"u}rlich vorkommende CD4+CD25+ regulatorische T Zellen (Treg) als auch durch Antigen induzierte IL-10-secreting CD4+ regulatorische T Zellen kontrolliert werden k{\"o}nnen. Weiterhin gibt es Hinweise, dass eine erfolgreiche Allergen spezifische Immuntherapie {\"u}ber die Induktion von IL-10 sezernierenden T reg Zellen vermittelt wird. In ersten Teil der Arbeit wird die Effizienz einer Allergen spezifischen Immuntherapie (SIT) in einem Mausmodel f{\"u}r allergische Atemwegsentz{\"u}ndung demonstriert. Als Allergieparameter wurden Allergen spezifisches IgE im Serum, verschiedene TH1 und TH2 Cytokine in der brochoalveol{\"a}ren Lavage Fl{\"u}ssigkeit und nach in vitro Restimulation in Milzzellen untersucht. Weiterhin wurden Histologien von Lungengewebe angefertigt, um das eosinophile Entz{\"u}ndungsinfiltrat und die Asthma typische Becherzellmetaplasie darzustellen. Weiterhin wurden durch FACS Untersuchungen regulatorische T Zellen nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass im Mausmodell die intranasale Applikationsform der SIT die allergischen Symptome effizienter bek{\"a}mpfen konnte, als die beim Menschen etablierte subcutane Applikationsform. Um Mechanismen zu definieren die eine SIT effizienter machen k{\"o}nnten wurde ein IL-4/IL13 Inhibitor (QY) als Adjuvans f{\"u}r die SIT benutzt. F{\"u}r den Zytokininhibitor konnte gezeigt werden, dass bei einer Applikation w{\"a}hrend der allergischen Sensibilisierung die Entstehung einer TH2 Immunantwort und die Ausbildung allergischer Symptome verhindert wird. Die Applikation des Inhibitors zusammen mit einer SIT zeigte jedoch keine zus{\"a}tzlichen signifikanten antiallergischen Effekte im Vergleich zur Durchf{\"u}hrung der SIT als Monotherapie. Diese Ergebnisse deuten m{\"o}glicherweise daraufhin , dass der bekannte Wechsel einer TH2 Immunantwort zu einer TH1 Antwort w{\"a}hrend der SIT nicht der Schl{\"u}sselmechanismus zu einer erfolgreichen Behandlung ist. Insbesondere weil unter der SIT auch in unserem Mausmodell die Induktion von IL-10 sezernierenden CD4+ T regulatorischen Zellen mit der Suppression der allergischen Atemwegsentz{\"u}dnung vergesellschaftet waren, so dass m{\"o}glicherwiese diese Zellen f{\"u}r den Therapieerfolg relevant sind . Um die Rolle regulatorischer T Zellen im Allergiemodell n{\"a}her zu beleuchten wurde im 2. Teil der Arbeit ein monoklonaler superagonistischer anti-CD28 Antik{\"o}rper benutzt, von dem bekannt ist dass T regulatorische Zellen in vivo induziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation des Antik{\"o}rpers w{\"a}hrend der allergischen Sensibilisierung die Etablierung einer TH2 Immunantwort verst{\"a}rkte. Im Gegensatz dazu wurden durch die therapeutische Applikation des anti CD28 Antik{\"o}rpers in einer etablierten Allergie, IL-10 sezernierende CD4+CD25+ T Zellen induziert, welches mit einer Abschw{\"a}chung der gemessenen Allergieparameter einherging.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Porsche2006,
  author    = {Porsche, Christian},
  title     = {Neuronale Plastizit{\"a}t im Hippocampus der Maus : Die Rolle von Neurotrophine und Cytokinen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21968},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Neurotrophe Faktoren haben ein breites Aufgabenfeld und spielen eine wichtige Rolle als {\"U}berlebensfaktoren embryonaler Neurone, bei Proliferation und Differenzierung im Nervensystem sowie als Modulatoren synaptischer Plastizit{\"a}t. Im ersten Themenkomplex der vorliegenden Arbeit wurden neurotrophe Faktoren als Modulatoren synaptischer Plastizit{\"a}t und ihr Einfluß auf die BDNF-Regulation im Hippocampus untersucht. Dabei wurde zun{\"a}chst das selbsthergestellte polyclonale BDNF-Immunserum f{\"u}r die Anwendung in der Immunhistochemie und im Western Blot optimiert, doch es konnten bez{\"u}glich BDNF keine Ver{\"a}nderungen in Hippocampi CNTF-defizienter M{\"a}use gegen{\"u}ber Wildtyp-Tieren festgestellt werden. Die Ergebnisse der Voruntersuchungen, die im Hippocampus CNTF-defizienter Tiere verminderte BDNF-Level gezeigt hatten, konnten somit nicht verifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an CNTF-defizienten M{\"a}usen eine eingeschr{\"a}nkte LTP und LTD nachgewiesen. Zum besseren Verst{\"a}ndnis der - laut LTP-Untersuchungen - ver{\"a}nderten Situation an der hippocampalen CA1-Synapse bei CNTF-defizienten Tieren wurden elektronenmikroskopische Bilder dieser Region angefertigt, deren Auswertung keine augenscheinlichen Unterschiede ergab. Im Stratum radiatum der CA1-Region war zudem keine spezifische CNTF-F{\"a}rbung nachweisbar. Zur Kl{\"a}rung der Frage, ob es IGF-vermittelt nach Training zu hippocampaler BDNF-Hochregulation kommt, wurden Laufradexperimente mit wildtypischen und konditionalen IGF1-Rezeptor-knockout M{\"a}usen durchgef{\"u}hrt und die jeweiligen BDNF-Level untersucht. Dabei wurde BDNF durch Laufradtraining in beiden Genotypen in {\"a}hnlichem Maße hochreguliert, was f{\"u}r alternative Wege der BDNF-Hochregulation spricht. Der zweite Themenkomplex befasste sich mit dem Einfluß neurotropher Faktoren auf die Proliferation und Differenzierung in Hippocampus und Cortex. BrdU-Inkorporationsexperimenten zeigten in der K{\"o}rnerzellschicht des Gyrus dentatus gesteigerte Proliferationsraten bei CNTF-defizienten und CNTF\&LIF-defizienten M{\"a}usen, wobei LIF-defiziente Tiere keine ver{\"a}nderten Proliferationsraten zeigten. Untersuchungen an Kulturen cortikaler Vorl{\"a}uferzellen best{\"a}tigten die Hypothese, wonach cortikale Vorl{\"a}uferzellen zun{\"a}chst Neurone bilden, die einen Faktor sezernieren, der auf die cortikalen Vorl{\"a}uferzellen wirkt und sie zur Bildung von Astrozyten veranlasst. Es konnte gezeigt werden, dass CT-1 der Hypothese folgend in vitro und in vivo f{\"u}r die Einleitung der Astrozytogenese im Cortex verantwortlich ist.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Valchanova2006,
  author    = {Valchanova, Stamatova Ralitsa},
  title     = {Functional analysis of the murine cytomegalovirus genes m142 and m143},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20215},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Human cytomegalovirus (HCMV) infection causes clinical symptoms in immunocompromised individuals such as transplantant recipients and AIDS patients. The virus is also responsible for severe complications in unborn children and young infants. The species specificity of HCMV prevents the direct study of mechanisms controlling the infection in animal models. Instead, the murine cytomegalovirus (MCMV) is used as a model system. Human and murine CMVs have large double-stranded DNA genomes, encoding nearly 170 genes. About 30\% of the genes are committed to essential tasks of the virus. The remaining genes are involved in virus pathogenesis or host interaction and are dispensable for virus replication. The CMV genes are classified in gene families, based on sequence homology. In the present work, the function of two genes of the US22 gene family was analyzed. The MCMV genes m142 and m143 are the only members of this family that are essential for virus replication. These genes also differ from the remaining ten US22 gene family members in that they lack 1 of 4 conserved sequence motifs that are characteristic of this family. The same conserved motif is missing in the HCMV US22 family members TRS1 and IRS1, suggesting a possible functional homology. To demonstrate an essential role of m142 and m143, the genes were deleted from the MCMV genome, and the mutants were reconstituted on complementing cells. Infection of non-complementing cells with the deletion mutants did not result in virus replication. Virus growth was rescued by reinsertion of the corresponding genes. Cells infected with the viral deletion mutants synthesized reduced amounts of viral DNA, and viral late genes were not expressed. However, RNA analyses showed that late transcripts were present, excluding a role of m142 and m143 in regulation of gene transcription. Metabolic labelling experiments showed that total protein synthesis at late times postinfection was impaired in cells infected with deletion mutants. Moreover, the dsRNA-dependent protein kinase R (PKR) and its target protein, the translation initiation factor 2\&\#945; (eIF2\&\#945;) were phosphorylated in these cells. This suggested that the m142 and m143 are required for blocking the PKR-mediated shut-down of protein synthesis. Expression of the HCMV gene TRS1, a known inhibitor of PKR activation, rescued the replication of the deletion mutants, supporting the observation that m142 and m143 are required to inhibit this innate immune response of the host cell.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kampfinger2007,
  author    = {Kampfinger, Katja},
  title     = {Nachweis einer Mismatch-Reparatur-Defizienz in L5178Y Tk+/--3.7.2C-Mauslymphomzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26023},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizit{\"a}tsermittlung. F{\"u}r die {\"U}berpr{\"u}fung der Gentoxizit{\"a}t stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verf{\"u}gung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den f{\"u}r die Testung notwendigen Ver{\"a}nderungen weitere Ver{\"a}nderungen zu tragen, die zu Reaktionen f{\"u}hren k{\"o}nnen, wie sie in den Prim{\"a}rzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale absch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-t{\"a}tspr{\"u}fung am h{\"a}ufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Ver{\"a}nderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrit{\"a}t des Genoms zu gew{\"a}hrleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch {\"a}ußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die gesch{\"a}digten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu {\"u}berleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Sch{\"a}den und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomsch{\"a}den bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, w{\"a}hrend andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen f{\"u}r alkylierende Agenzien beschrieben ist, f{\"u}hrte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Ph{\"a}notyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Ph{\"a}notyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen gepr{\"u}ft und best{\"a}tigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte f{\"u}r den gezeigten MMR-defizienten Ph{\"a}notyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Ver{\"a}nde-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese f{\"u}hrt nach 260 Aminos{\"a}uren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminos{\"a}uren zu einem Abbruch der Aminos{\"a}uresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information f{\"u}r den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedom{\"a}ne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die f{\"u}r den C-Terminus hingegen, der f{\"u}r die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit f{\"u}r die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erkl{\"a}ren kann. Daraus folgt f{\"u}r den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizit{\"a}tstests, dass die Ber{\"u}cksichtigung ihrer MMR-Defizienz die M{\"o}glichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Afify2007,
  author    = {Afify, Samar},
  title     = {Drug targeting delivery systems for treatment of Raf-1 induced lung tumors in mice},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22249},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {The aim of the present study was to design different dosage forms as carrier systems to deliver sorafenib to the lung of BXB-23 transgenic mice using different routes of administration. Three dosage forms were used one of them was an oil-in-water emulsion and the oral route was chosen for this experiment. The other delivery system was a liposome preparation for intratracheal instillation. In this case the oral route was considered as a control experiment. The last dosage form was PLGA microspheres. Before sorafenib administration it was important to develop a HPLC method to assess sorafenib absorption after its administration and to determine its concentrations in mouse serum. The HPLC method allowed sorafenib quantification in small volumes (30 µl) of mouse serum and tissues. The developed HPLC method was validated resulting in satisfactory selectivity, good linearity, good accuracy and precision over the concentration range examined. Sorafenib was successfully incorporated in a fat emulsion (o/w) using a traditional method resulting in a white homogenous emulsion and no particle aggregation was observed. Sorafenib exhibited antitumor activity on the lung adenoma in BXB-23 transgenic mice when administered orally (2 mg sorafenib per mouse) in the emulsion preparation. The determined effect was an approximately 29 \% reduction in the tumor area of the adenoma foci and a proliferation reduction. In order to improve the pharmacological effects of sorafenib on the lung adenoma in BXB-23 mice, the targeting of sorafenib directly to the site of action (the lung) was an attractive concept. For this purpose the intratracheal route was used. Since sorafenib administration by instillation required incorporation of sorafenib in a dosage form suitable for its lipophilic nature, a liposome suspension was the second dosage form used. A lyophilization method was employed for sorafenib liposome preparation utilizing dilauroylphosphatidylcholine (DLPC) which is safe and tolerable for the lung. Incorporation of sorafenib in the liposomes did not influence the particle size and its distribution. The sorafenib liposomes showed high encapsulation efficiency, good stability at 4 °C for one month and satisfactory in vitro release properties and inhibited Raf-1 mediated activation of ERK in cell culture assay. In a pharmacokinetic experiment sorafenib loaded liposomes were instilled directly into the lung. The results revealed that a significant level of sorafenib was achieved in the lung tissues after 2 hours and then reduced after 48 h and remained nearly constant for one week. On the other hand, only traces of sorafenib were found in the mice serum up to 48 h. Subsequently, the pharmacological activity of sorafenib (1 mg per mouse) was studied when delivered in a liposomal suspension intratracheally to treat the lung adenoma of BXB-23 mice. The data of this experiment demonstrated that sorafenib intratracheal instillation resulted in a reduction of tumor area of adenoma foci (67 \%) and an elevation of the percent of apoptotic cells. In contrast, prolongation of the treatment period did not further enhance sorafenib activity on the lung adenoma. This previous finding suggested a development of multidrug resistance (MDR) by the adenoma foci cells against sorafenib instillation, which was examined by immunohistochemistry staining. The percent of MDR positive cells was higher after two and three weeks sorafenib liposome instillation treatment than that after one week treatment. The last dosage form used for sorafenib was microspheres, which were prepared by emulsion-diffusion-evaporation method using biodegradable PLGA 50:50 resulting in a white lyophilized powder. The system was characterized physicochemically and revealed a good microspheres yield, high encapsulation efficiency, a homogenous particle size distribution and slow in vitro release of sorafenib. The other strategy studied in the present research project was gene delivery to target the lung bearing tumor of BXB-23 mice using a non-viral vector (polyethylenimine). Polyethylenimine (PEI) was used to investigate its efficiency in transfecting lung bearing tumor of BXB-23 mice model and its ability to transfect the adenoma foci cells. LacZ, which encodes Beta-galactosidase was used in the present study as a reporter gene and was complexed with PEI before delivered intravenously. A high LacZ expression in the alveolar region with some expression in the adenoma foci was observed. On contrary, a low LacZ expression in the alveoli and in the adenoma foci was achieved after instillation of the same polyplex intratracheally.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Meyer2008,
  author    = {Meyer, Klaus},
  title     = {Erh{\"o}hte Anf{\"a}lligkeit von Creatinkinase-defizienten Mausherzen gegen{\"u}ber Isch{\"a}mie und Reperfusionschaden bei ver{\"a}nderter Calcium-Hom{\"o}ostase},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35015},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Durch die Konzeption des Versuchsaufbaus und der Wahl der Komponenten konnte die aktuelle Arbeit an intakten isolierten M{\"a}useherzen zeigen, dass unter weitgehend physiologischen in-vitro-Bedingungen die M{\"o}glichkeit besteht, mit Hilfe des Biolumineszenzproteins Aequorin Messungen der intrazytoplasmatischen Ca2+- Konzentration w{\"a}hrend eines einzelnen Herzschlages mit einer Frequenz von 420 Schl{\"a}gen pro Minute zu gewinnen und diese gleichzeitig in die linksventrikul{\"a}re Funktion integrieren zu k{\"o}nnen. Das wesentliche Ergebnis dieser Arbeit ist dabei, dass w{\"a}hrend moderater Arbeitsbelastung der Verlust eines effizienten CK-Systems transgener CK-defizienter- Herzen (CKM/Mito-/) hinsichtlich des intramyokardialem Calciumstoffwechsels und der linksventrikul{\"a}ren Funktion durch Adaptionsmechanismen offensichtlich gut kompensiert wird. Allerdings wird in Situationen des Ungleichgewichtes zwischen Energieversorgung und Energieverbrauch, ausgel{\"o}st durch Isch{\"a}mie und anschließende Reperfusion, eine signifikante Verschlechterung der linksventrikul{\"a}ren Funktion und gleichzeitig der Ca2+-Hom{\"o}ostase sichtbar, was einen weiteren Beweis f{\"u}r die enge Beziehung zwischen myokardialer Energetik und des Ca2+-Haushaltes insbesondere in CK-defizienten Herzen unter metabolischem Stress darstellt. Schließlich zeigt die simultane Aufzeichnung des Ca2+-Signals und die Druckentwicklung des linken Ventrikels, dass es schon vor der Entwicklung der isch{\"a}mischen Kontraktur zur intrazytoplasmatischen Ver{\"a}nderung der Ca2+-Hom{\"o}ostase kommt, die durch eine unzureichende Bereitstellung durch ATP ausgel{\"o}st wird und maßgeblich durch das Fehlen eines effizienten Energietransportsystem in Form der Kreatinkinase bedingt sein k{\"o}nnte.},
  subject      = {Kreatin Kinase},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kriegebaum2009,
  author    = {Kriegebaum, Claudia},
  title     = {Spatio-temporal Expression Patterns of the Serotonin Synthesis Enzymes TPH1 and TPH2 and Effects of Acute Stress},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40839},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Several lines of evidence implicate a dysregulation of tryptophan hydroxylase (TPH)-dependent serotonin (5-HT) synthesis in emotions and stress and point to their potential relevance to the etiology and pathogenesis of various neuropsychiatric disorders. However, the differential expression pattern of the two isoforms TPH1 and TPH2 which encode two forms of the rate-limiting enzyme of 5-HT synthesis is controversial. Here, a comprehensive spatio-temporal analysis clarifies TPH1 and TPH2 expression during pre- and postnatal development of the mouse brain and in adult human brain as well as in peripheral organs including the pineal gland. Four different methods (real time PCR, in situ hybridization, immunohistochemistry and Western blot analysis) were performed to systematically control for tissue-, species- and isoform-specific expression on both the pre- and posttranslational level. TPH2 expression was consistently detected in the raphe nuclei, as well as in fibres in the deep pineal gland and in the gastrointestinal tract. Although TPH1 expression was found in these peripheral tissues, no significant TPH1 expression was detected in the brain, neither during murine development, nor in mouse and human adult brain. Also under conditions like stress and clearing the tissue from blood cells, no changes in expression levels were detectable. Furthermore, the reuptake of 5-HT into the presynaptic neuron by the serotonin transporter (SERT) is the major mechanism terminating the neurotransmitter signal. Thus, mice with a deletion in the Sert gene (Sert KO mice) provide an adequate model for human affective disorders to study lifelong modified 5-HT homeostasis in interaction with stressful life events. To further explore the role of TPH isoforms, Tph1 and Tph2 expression was studied in the raphe nuclei of Sert deficient mice under normal conditions as well as following exposure to acute immobilization stress. Interestingly, no statistically significant changes in expression were detected. Moreover, in comparison to Tph2, no relevant Tph1 expression was detected in the brain independent from genotype, gender and treatment confirming expression in data from native animals. Raphe neurons of a brain-specific Tph2 conditional knockout (cKO) model were completely devoid of Tph2-positive neurons and consequently 5-HT in the brain, with no compensatory activation of Tph1 expression. In addition, a time-specific Tph2 inducible (i) KO mouse provides a brain-specific knockdown model during adult life, resulting in a highly reduced number of Tph2-positive cells and 5-HT in the brain. Intriguingly, expression studies detected no obvious alteration in expression of 5-HT system-associated genes in these brain-specific Tph2 knockout and knockdown models. The findings on the one hand confirm the specificity of Tph2 in brain 5-HT synthesis across the lifespan and on the other hand indicate that neither developmental nor adult Tph2-dependent 5-HT synthesis is required for normal formation of the serotonergic system, although Tph1 does not compensate for the lack of 5-HT in the brain of Tph2 KO models. A further aim of this thesis was to investigate the expression of the neuropeptide oxytocin, which is primarily produced in the hypothalamus and released for instance in response to stimulation of 5-HT and selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). Oxytocin acts as a neuromodulator within the central nervous system (CNS) and is critically involved in mediating pain modulation, anxiolytic-like effects and decrease of stress response, thereby reducing the risk for emotional disorders. In this study, the expression levels of oxytocin in different brain regions of interest (cortex, hippocampus, amygdala, hypothalamus and raphe nuclei) from female and male wildtype (WT) and Sert KO mice with or without exposure to acute immobilization stress were investigated. Results showed significantly higher expression levels of oxytocin in brain regions which are involved in the regulation of emotional stimuli (amygdala and hippocampus) of stressed male WT mice, whereas male Sert KO as well as female WT and Sert KO mice lack these stress-induced changes. These findings are in accordance with the hypothesis of oxytocin being necessary for protection against stress, depressive mood and anxiety but suggest gender-dependent differences. The lack of altered oxytocin expression in Sert KO mice also indicates a modulation of the oxytocin response by the serotonergic system and provides novel research perspectives with respect to altered response of Sert KO mice to stress and anxiety inducing stimuli.},
  subject      = {Serotonin},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Hochgraefe2009,
  author    = {Hochgr{\"a}fe, Katja},
  title     = {Cre-loxP based mouse models to study prionpathogenesis in the motor nervous system},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-45967},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Prion diseases such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal neurodegenerative disorders characterized by brain lesions and the accumulation of a disease-associated protein, designated PrPSc. How prions proceed to damage neurons and whether all or only subsets of neurons have to be affected for the onset of the clinical disease is still elusive. The manifestation of clinical prion disease is characterized by motor dysfunctions, dementia and death. Furthermore loss of motor neurons (MN) in the spinal cord is a constant finding in different mouse models of prion disease, suggesting that MN are vulnerable cells for triggering the onset of clinical symptoms. To determine whether the protection of MN against prion induced dysfunctions is an approach for holding the disease at the sub-clinical level, we established a novel conditional model for Cre-mediated expression of a dominant-negative PrP mutant (PrPQ167R) in the cells of interest. Dominant-negative PrP mutants provide protection of prion induced dysfunctions by inhibiting prion replication. Transgenic mice were generated carrying a floxed LacZ marker gene followed by the coding sequence of PrPQ167R under control of the human ubiquitin C promoter. Two Cre strains have been used to direct PrPQ167R expression either to a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or to various neuronal cell populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were infected with mouse-adapted prions via different inoculation routes (intranerval, intracerebral and intraperitoneal) and monitored for effects on incubation time and pathology. Tg floxed LacZ-PrPQ167R/NF-L-Cre mice showed about 15\% prolonged survival upon intraperitoneal low dose prion infection, whereas survival of Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre mice was comparable to control littermates. The results suggest that the protection of spinal MN prolongs the incubation period but is not sufficient to completely inhibit clinical prion disease. In a second approach, Cre was transferred into the hind limb muscles of transgenic mice via a double-stranded adeno-associated virus vector (dsAAV2-Cre). The goal of this strategy was to target a broader cell population and thus to enhance expression levels of protective PrPQ167R in the spinal cord of Tg floxed-LacZ-PrPQ167R mice. After intramuscular (i.m.) application of dsAAV2-Cre, exhibiting a physical titer of 5x1010 GP/ml, recombinant transgenic DNA was detected only in the muscle tissue, pointing out that functional Cre-recombinase was expressed at the side of virus application. However, dsAAV2-Cre did neither induce recombination of transgenic DNA in the spinal cord or brain nor expression of dominant-negative PrPQ167R. In conclusion the dsAAV2-Cre vectors system needs further improvement to achieve efficient transport from muscle tissue to the central nervous system (CNS). 105 7 SUMMARY The lymphoreticular system (LRS) is an early site of prion replication. In splenic tissue prion infectivity is associated with follicular dendritic cells (FDC) as well as with Band T-lymphocytes. However, it is still unknown if those cell types are able to replicate the infectious agent or if other PrP-expressing cell types are engaged. To investigate if neurons and in particular MN are involved, transgenic mice carrying one allele of floxed Prnp (lox2+=\&\#56256;\&\#56320;) and either one allele of Hb9-Cre or NF-L-Cre were generated on a Prnp0=0 background. Therefore a conditional PrP knockout was established in a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or in various neuronal populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were inoculated with prions to study the accumulation of PrPSc and prion infectivity in spleen and spinal cord at an early time point after infection. The findings show that PrPSc accumulation in mice with MN-specific PrP depletion (lox2+=\&\#56256;\&\#56320;/ Hb9-Cre) was comparable to control littermates, while pan-neuronal PrP deficient mice (lox2+=\&\#56256;\&\#56320;/NF-L-Cre) were not able to accumulate PrPSc in splenic tissue until 50 days post inoculation. Moreover spleens of lox2+=\&\#56256;\&\#56320;/NF-L-Cre mice exhibited a clearly reduced prion infectivity titer, suggesting that accumulation of prions in the spleen is dependent on PrP expression in the nervous tissue.},
  subject      = {Prionkrankheit},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Gruenig2009,
  author    = {Gr{\"u}nig, Sebastian},
  title     = {Vergleich zwischen physiologisch vs. pathologischer linksventrikul{\"a}rer Hypertrophie - Eine Studie an drei Mausmodellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48103},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Herzerkrankungen sind die Haupttodesursache in den westlichen Nationen. Unter den Herzerkrankungen spielt die linksventrikul{\"a}re Hypertrophie mit Entwicklung einer Herzinsuffizienz eine tragende Rolle. In der g{\"a}ngigen Praxis ist es schwierig ein durch k{\"o}rperliches Training physiologisch hypertrophiertes Herz von einem pathologisch hypertrophierten Herz zu unterscheiden. Da sich immer mehr Menschen einem intensiven k{\"o}rperlichen Training unterziehen, hat die Differentialdiagnose im klinischen Alltag erhebliche therapeutische Konsequenzen. Noch herrscht Unklarheit dar{\"u}ber, ob eine physiologische Herzhypertrophie per se nicht auch pathologisch ist. In der vorliegenden Arbeit wurden drei experimentelle Mausmodelle der linksventrikul{\"a}ren Hypertrophie miteinander verglichen: 1. Pathologische Herzhypertrophie durch chronisch adrenergen Streß, bedingt durch 15 fache {\"U}berexpression des kardialen ß1- Adrenorezeptor 2. Pathologische Herzhypertrophie durch chronische Druckbelastung mittels Aortenkonstriktion (Aortenbanding) 3. Physiologische Herzhypertrophie durch Lauftraining in einem K{\"a}figinternen Laufrad. Wir konnten zeigen, dass es bei beiden Formen der linksventrikul{\"a}ren Hypertrophie einerseits zu einer signifikanten Kardiomyozytenhypertrophie kommt, sich beim Vergleich mit den pathologischen Formen der Herzhypertrophie bei der physiologischen Form aber andererseits keine signifikanten Ver{\"a}nderungen der volumetrischen Parameter zeigen. Bei den pathologischen Formen der Herzhypertrophie kommt es zu einer interstitiellen Fibrose, die durch Erh{\"o}hung der Wandsteifigkeit zu einer Einschr{\"a}nkung der diastolischen Relaxation (dp/dtmin) und systolischen Kontraktion (dp/dtmax) des linken Ventrikels f{\"u}hrt. Unsere Studie unterstreicht zudem die Hypothese, dass die Hypertrophie des Sportlers einen physiologischen Anpassungsmechanismus an eine chronische oder intermittierende Druckbelastung darstellt, wenn auch die linksventrikul{\"a}re Hypertrophie f{\"u}r sich alleine ein wichtiger Pr{\"a}diktor f{\"u}r kardiale Ereignisse ist.},
  subject      = {Herzhypertrophie},
  language  = {de}
}
@article{KraftSchwarzPochetetal.2010,
  author    = {Kraft, P. and Schwarz, T. and Pochet, L. and Stoll, G. and Kleinschnitz, Christoph},
  title     = {COU254, a specific 3-carboxamide-coumarin inhibitor of coagulation factor XII, does not protect mice from acute ischemic stroke},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-68103},
  year      = {2010},
  abstract  = {Background: Anticoagulation is an important means to prevent from acute ischemic stroke but is associated with a significant risk of severe hemorrhages. Previous studies have shown that blood coagulation factor XII (FXII)- deficient mice are protected from pathological thrombus formation during cerebral ischemia without bearing an increased bleeding tendency. Hence, pharmacological blockade of FXII might be a promising and safe approach to prevent acute ischemic stroke and possibly other thromboembolic disorders but pharmacological inhibitors selective over FXII are still lacking. In the present study we investigated the efficacy of COU254, a novel nonpeptidic 3-carboxamide-coumarin that selectively blocks FXII activity, on stroke development and post stroke functional outcome in mice. Methods: C57Bl/6 mice were treated with COU254 (40 mg/kg i.p.) or vehicle and subjected to 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) using the intraluminal filament method. After 24 h infarct volumes were determined from 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride(TTC)-stained brain sections and functional scores were assessed. Hematoxylin and eosin (H\&E) staining was used to estimate the extent of neuronal cell damage. Thrombus formation within the infarcted brain areas was analyzed by immunoblot. Results: Infarct volumes and functional outcomes on day 1 after tMCAO did not significantly differ between COU254 pre-treated mice or untreated controls (p > 0.05). Histology revealed extensive ischemic neuronal damage regularly including the cortex and the basal ganglia in both groups. COU254 treatment did not prevent intracerebral fibrin(ogen) formation. Conclusions: COU254 at the given concentration of 40 mg/kg failed to demonstrate efficacy in acute ischemic stroke in this preliminary study. Further preclinical evaluation of 3-carboxamide-coumarins is needed before the antithrombotic potential of this novel class of FXII inhibitors can be finally judged.},
  subject      = {Schlaganfall},
  language  = {en}
}