@phdthesis{Witzinger2020,
  author    = {Witzinger, Linda},
  title     = {Rolle der Pyridoxal 5´-Phosphat Phosphatase PDXP im Vitamin B6-Metabolismus muriner Erythrozyten und Hippocampi},
  doi       = {10.25972/OPUS-21654},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-216546},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Die Phosphatase PDXP (auch bekannt als Chronophin) geh{\"o}rt zur Familie der HAD Phosphatasen, einer ubiquit{\"a}r exprimierten Enzymklasse mit wichtigen physiologischen Funktionen. PDXP zeigt Phosphatase-Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber seinem Substrat Pyridoxal 5´-Phosphat (PLP), der aktivierten Form von Vitamin B6. PDXP-defiziente M{\"a}use (Knockout-M{\"a}use) weisen im Vergleich zu Wildtypen verdoppelte PLP-Konzentrationen in Erythrozyten sowie im Gesamthirn auf. Vermutlich kommt PDXP daher eine wichtige Funktion in Erythrozyten und im Hirn zu. Ziel dieser Arbeit war es, erste Einblicke in diese Funktion(en) von PDXP zu erlangen. Hierzu wurden HPLC-basierte Analysen der erythrozyt{\"a}ren PLP-Konzentrationen in Wildtyp- sowie PDXP-defizienten M{\"a}usen durchgef{\"u}hrt. Dabei ließen sich die rund doppelt so hohen erythrozyt{\"a}ren PLP-Level in den KO-M{\"a}usen best{\"a}tigen. Zudem ist es gelungen, eine Methode zur Messung der endogenen Phosphatase-Aktivit{\"a}t von PDXP in Erythrozytenlysaten zu etablieren. So konnte im Wildtyp anhand der Verringerung der PLP-Konzentrationen pro Zeiteinheit eine erythrozyt{\"a}re PDXP-Aktivit{\"a}t nachgewiesen werden. Dazu waren die Inkubation mit Pyridoxin, sowie die Anwendung eines Inhibitors der PDXK notwendig. Eine bis dato vermutete Funktion der PDXP, zur Mobilisation von erythrozyt{\"a}rem PLP w{\"a}hrend Fastenzeiten, konnte ausgeschlossen werden. So zeigte der Vergleich der erythrozyt{\"a}ren PLP-Konzentrationen aus gefasteten mit normal gef{\"u}tterten Tieren in beiden Genotypen exakt dieselbe prozentuale PLP-Verringerung. W{\"a}hrend Nahrungszufuhr ließ sich jedoch eine Funktion der Phosphatase PDXP als „Converter" von Pyridoxin zu Pyridoxal erkennen. Ausgehend von PN konnte im Wildtyp ({\"u}ber die Zwischenprodukte PNP und PLP) eine PDXP-abh{\"a}ngige Dephosphorylierung von PLP zu PL erfolgen. So wies der Wildtyp eine rund vierfach h{\"o}here PL-Produktion auf, verglichen mit der PDXP-defizienten Maus. Die Phosphatase PDXP erwies sich als essenziell f{\"u}r die erythrozyt{\"a}re Konversion von Pyridoxin zu Pyridoxal. Dadurch erreicht der Organismus eine metabolische Flexibilit{\"a}t, die ihn bis zu einem gewissen Grad unabh{\"a}ngig von der Nahrungsauswahl macht. Zudem k{\"o}nnen Zellen oder Organe, denen durch das Fehlen der PNPO, die Konversion zu PLP nicht m{\"o}glich ist, mit PL versorgt werden. Aus der hohen Reaktivit{\"a}t von PLP mit umliegenden Nucleophilen ergibt sich eine gewisse Problematik f{\"u}r die Zelle im Umgang mit freiem PLP. So liegt der Großteil des erythrozyt{\"a}ren PLPs gebunden an Proteine (vor allem H{\"a}moglobin) vor. Anhand von Filtern (MWCO, 3000) ließ sich zwischen der hier definiert als „freien" und der „gebundenen" Form von PLP differenzieren. So konnten erste Erkenntnisse zur Rolle von PDXP als Determinator freier PLP-Konzentrationen in Erythrozyten und insbesondere im Hippocampus erlangt werden. Im Hippocampus ergaben sich insgesamt deutlich h{\"o}here Konzentrationen an freiem PLP als in den Erythrozyten und es bestand zudem ein Unterschied zwischen den Genotypen. So wiesen die KO-M{\"a}use ~1/3 h{\"o}here freie PLP-Konzentrationen im Vergleich zu den Wildtypen auf. Schließlich konnte ein Effekt des Tieralters auf den PLP-Metabolismus festgestellt werden. Sowohl in den Erythrozyten als auch im Hippocampus ergaben sich alterskorrelierte {\"A}nderungen ihrer PLP-Konzentrationen. Zudem zeigten Western Blot Analysen altersbedingte Unterschiede ihrer Vitamin B6-Enzymexpressionen. So wiesen {\"a}ltere Wildtypen im Hippocampus eine f{\"u}nffach erh{\"o}hte PDXP-Expression verglichen mit j{\"u}ngeren Tieren auf. In den Erythrozytenlysaten hingegen zeigten {\"a}ltere Tiere beider Genotypen eine rund vierfach geringere PNPO-Expression gegen{\"u}ber j{\"u}ngeren Tieren. Die mit dem Alter eintretende physiologische Verringerung der erythrozyt{\"a}ren PNPO-Expression w{\"u}rde somit f{\"u}r den Organismus einen Verlust seiner metabolischen Flexibilit{\"a}t bedeuten, die mit der Konversion von PN zu PL einhergeht.},
  subject      = {Vitamin B6},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Segerer2019,
  author    = {Segerer, Gabriela},
  title     = {Characterization of cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase AUM},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-123847},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are a large and ubiquitous family of at least 40 human members. Many of them have important physiological functions, such as the regulation of intermediary metabolism and the modulation of enzyme activities, yet they are also linked to diseases such as cardiovascular or metabolic disorders and cancer. Still, most of the mammalian HAD phosphatases remain functionally uncharacterized. This thesis reveals novel cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase PGP, also referred to as AUM. To this end, PGP was functionally characterized by performing analyses using purified recombinant proteins to investigate potential protein substrates of PGP, cell biological studies using the spermatogonial cell line GC1, primary mouse lung endothelial cells and lymphocytes, and a range of biochemical techniques to characterize Pgp-deficient mouse embryos. To characterize the cell biological functions of PGP, its role downstream of RTK- and integrin signaling in the regulation of cell migration was investigated. It was shown that PGP inactivation elevates integrin- and RTK-induced circular dorsal ruffle (CDR) formation, cell spreading and cell migration. Furthermore, PGP was identified as a negative regulator of directed lymphocyte migration upon integrin- and GPCR activation. The underlying mechanisms were analyzed further. It was demonstrated that PGP regulates CDR formation and cell migration in a PLC- and PKC-dependent manner, and that Src family kinase activities are required for the observed cellular effects. Upon integrin- and RTK activation, phosphorylation levels of tyrosine residues 1068 and 1173 of the EGF receptor were elevated and PLCγ1 was hyper-activated in PGP-deficient cells. Additionally, PGP-inactivated lymphocytes displayed elevated PKC activity, and PKC-mediated cytoskeletal remodeling was accelerated upon loss of PGP activity. Untargeted lipidomic analyses revealed that the membrane lipid phosphatidylserine (PS) was highly upregulated in PGP-depleted cells. These data are consistent with the hypothesis that the accumulation of PS in the plasma membrane leads to a pre-assembly of signaling molecules such as PLCγ1 or PKCs that couple the activation of integrins, EGF receptors and GPCRs to accelerated cytoskeletal remodeling. Thus, this thesis shows that PGP can affect cell spreading and cell migration by acting as a PG-directed phosphatase. To understand the physiological functions of PGP, conditionally PGP-inactivated mice were analyzed. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpDN/DN embryos between E9.5 and E11.5. However, embryonic lethality upon whole-body PGP inactivation was not caused by a primary defect of the (cardio-) vascular system. Rather, PGP inactivated embryos died during the intrauterine transition from hypoxic to normoxic conditions. Therefore, the potential impact of oxygen on PGP-dependent cell proliferation was investigated. Analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) generated from E8.5 embryos and GC1 cells cultured under normoxic and hypoxic conditions revealed that normoxia (~20\% O2) causes a proliferation defect in PGP-inactivated cells, which can be rescued under hypoxic (~1\% O2) conditions. Mechanistically, it was found that the activity of triosephosphate isomerase (TPI), an enzyme previously described to be inhibited by phosphoglycolate (PG) in vitro, was attenuated in PGP-inactivated cells and embryos. TPI constitutes a critical branch point between carbohydrate- and lipid metabolism because it catalyzes the isomerization of the glycolytic intermediates dihydroxyacetone phosphate (DHAP, a precursor of the glycerol backbone required for triglyceride biosynthesis) and glyceraldehyde 3'-phosphate (GADP). Attenuation of TPI activity, likely explains the observed elevation of glycerol 3-phosphate levels and the increased TG biosynthesis (lipogenesis). Analyses of ATP levels and oxygen consumption rates (OCR) showed that mitochondrial respiration rates and ATP production were elevated in PGP-deficient cells in a lipolysis-dependent manner. However under hypoxic conditions (which corrected the impaired proliferation of PGP-inactivated cells), OCR and ATP production was indistinguishable between PGP-deficient and PGP-proficient cells. We therefore propose that the inhibition of TPI activity by PG accumulation due to loss of PGP activity shifts cellular bioenergetics from a pro-proliferative, glycolytic metabolism to a lipogenetic/lipolytic metabolism. Taken together, PGP acts as a metabolic phosphatase involved in the regulation of cell migration, cell proliferation and cellular bioenergetics. This thesis constitutes the basis for further studies of the interfaces between these processes, and also suggests functions of PGP for glucose and lipid metabolism in the adult organism.},
  subject      = {Phosphoglykolatphosphatase},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kestler2017,
  author    = {Kestler, Christian},
  title     = {Untersuchungen {\"u}ber die Dimerisierung der HAD-Phosphatase Chronophin},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-149777},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {Phosphatasen der HAD (haloacid dehalogenase)-Familie sind weit verbreitet in allen Dom{\"a}nen des Lebens und erf{\"u}llen die verschiedensten zellul{\"a}ren Aufgaben, beispielsweise in Metabolismus und Zellregulation. Die HAD-Phosphatase Chronophin zeigt Phosphataseaktivit{\"a}t unter anderem gegen{\"u}ber Pyridoxal-5'-Phosphat (PLP), einem essentiellen Kofaktor vieler biochemischer Prozesse, und Phosphocofilin, einem Regulator des Aktinzytoskeletts. Chronophin dimerisiert {\"u}ber die Interaktion zweier identischer Untereinheiten zu einem Homodimer. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle dieser Dimerisierung, eines bei HAD-Phosphatasen weit verbreiteten Oligomerisierungszustandes, n{\"a}her zu untersuchen. Hierzu wurde die Dimerisierung erfolgreich durch den Austausch der Aminos{\"a}uren Alanin 194 und 195 zu Lysinen (Mutation A194K/A195K) gest{\"o}rt. Der Nachweis einer konstitutiv monomeren Chronophin-Mutante mittels Gr{\"o}ßenausschlusschromatographie, Rasterkraftmikroskopie, analytischer Ultra¬zentrifugation und Zellexperimenten wurde schließlich {\"u}ber die Struktur¬aufl{\"o}sung mittels R{\"o}ntgenstrukturanalyse best{\"a}tigt. Aktivit{\"a}tsmessungen der monomeren Mutante gegen{\"u}ber dem Substrat PLP zeigten eine deutliche Verminderung der Phosphataseaktivit{\"a}t. Die R{\"o}ntgenstrukturanalyse von Chronophin A194K/A195K im Vergleich mit Wildtyp-Chronophin enth{\"u}llte einen Mechanismus, wie die sogenannte Substratspezifit{\"a}tsschleife, die f{\"u}r die korrekte Positionierung des PLP sorgt, im Homodimer des Wildtyps durch Interaktionen mit dem zweiten Protomer stabilisiert wird. Diese Stabilisierung fehlt bei der monomeren Mutante und {\"a}ußert sich in einer ver{\"a}nderten Stellung der Substratspezifit{\"a}tsschliefe. Der Strukturvergleich von Chronophin mit weiteren HAD-Phosphatasen der selben strukturellen Untergruppe vom C2a-Typ l{\"a}sst eine allgemeine G{\"u}ltigkeit der hier beschriebenen allosterischen Kontrolle von Substratspezifit{\"a}t {\"u}ber Homodimerisierung bei HAD-Phosphatasen vermuten und k{\"o}nnte so neue Ansatzpunkte f{\"u}r m{\"o}glicherweise auch therapeutisch nutzbare Aktivit{\"a}tshemmungen liefern.},
  subject      = {Dimerisierung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Knobloch2014,
  author    = {Knobloch, Gunnar},
  title     = {Biochemical and structural characterization of chronophin},
  doi       = {10.25972/OPUS-11008},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-110088},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {The haloacid dehalogenase (HAD) family of phosphatases is an ancient, ubiquitous group of enzymes, and their emerging role in human health and disease make them attractive targets for detailed analyses. This thesis comprises the biochemical and structural characterization of chronophin, an HAD-type phosphatase, which has been shown to act on Ser3-phosphorylated cofiln-1, a key regulator of actin dynamics, and on the Ser/Thr-phosphorylated steroid receptor co-activator 3 (SRC-3). Besides being a specific phosphoprotein phosphatase, chronophin also acts on the small molecule pyridoxal 5'-phosphate (PLP, vitamin B6), implying that chronophin serves as a regulator of a variety important physiological pathways. The analysis of chronophin was performed on different levels, ranging from intrinsic regulatory mechanisms, such as the allosteric regulation via dimerization or the characterization of specificity determinants, to modes of extrinsic modulation, including the association with putative interacting proteins or the generation of chronophin-specific inhibitors. The association of the previously identified putative chronophin interactors calcium- and integrinbinding protein 1 (CIB1) and calmodulin was investigated using recombinantly expressed and purified proteins. These studies revealed that the interaction of chronophin with CIB1 or calmodulin is mutually exclusive and regulated by calcium. Neither CIB1 nor calmodulin had an effect on the in vitro chronophin phosphatase activity towards PLP or phospho-cofilin-1, but might regulate other functions of this important phosphatase. The role of chronophin dimerization was studied by generating a constitutively monomeric variant, which showed reduced PLP hydrolyzing activity. X-ray crystallographic studies revealed that dimerization is essential for the positioning of the substrate specificity loop in chronophin, unraveling a previously unknown mechanism of allosteric regulation through a homophilic interaction. This mechanism potentially applies to other enzymes of the C2a subfamily of HAD-type phosphatases, as all structurally characterized members show a conserved mode of dimerization. The general determinants of substrate specificity in the C2a subfamily of HAD phosphatases were investigated by performing domain swapping experiments with chronophin and its paralog AUM and subsequent biochemical analyses of the hybrid proteins. The X-ray crystallographic structure determination of the chronophin catalytic domain equipped with the AUM capping domain revealed the first partial structure of AUM. This structural information was then used in subsequent studies that analyzed the divergent substrate specificities of AUM and chronophin in an evolutionary context. Finally, a set of four chronophin inhibitors were generated based on the structure of PLP and characterized biochemically, showing moderate inhibitory effects with IC50-values in the micromolar range. These compounds nevertheless constitute valuable tools for future in vitro experiments, such as studies concerning the structure-function relationship of chronophin as a PLP phosphatase. In addition, the crystal structure of one inhibitor bound to chronophin could be solved. These results provide the basis for the further development of competitive chronophin inhibitors with increased specificity and potency.},
  subject      = {Phosphatasen},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Dudaczek2009,
  author    = {Dudaczek, J{\"u}rgen},
  title     = {Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35175},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Ziel der Dissertation „Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern" war es neue Oktapeptide zu finden, die die F{\"a}higkeit besitzen Phosphate und Ester zu Hydrolysieren. In der Natur ist bei den Katalysereaktionen die Sekund{\"a}rstruktur von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen dieser Arbeit zun{\"a}chst ein Modellsystem entwickelt, mit dem gezeigt werden konnte, dass es m{\"o}glich ist mit einfachen Bausteinen wie Diaminobutan und dem in der Gruppe von Schmuck entwickelten Guanidiniocarbonylpyrrol ein Molek{\"u}l zu entwickeln, welches eine stabile intramolekulare Schleife in polaren L{\"o}sungsmitteln ausbildet. Aufgrund der geringen Gr{\"o}ße des Molek{\"u}ls, konnte kein \&\#946;-Faltblatt gebildet werden. Dennoch konnte mit Hilfe der NMR-Spektroskopie gezeigt werden, dass in dem polaren L{\"o}sungsmittel Methanol eine stabile Schleifenbildung mit einer intramolekularen Komplexierung stattfindet. Nach erfolgreicher Synthese des oben beschriebenen Testsystems wurde als n{\"a}chster Schritt eine kombinatorische Organokatalysatorbibliothek mit 625 Mitgliedern aufgebaut. Die Struktur der Peptide kann man in drei Teile untergliedern. Der erste Teil ist die feste Phase, das Amino-TentaGel, an das nacheinander die einzelnen Aminos{\"a}uren gekuppelt wurden. An Stelle der Butylgruppe als Schleifenelement wurde Aib-D-Pro als \&\#946;-Turn Element eingesetzt. Den dritten Teil bilden die bei der Synthese der Oktapeptide eingesetzten Aminos{\"a}uren AA1, AA3, AA6, AA8, die ein \&\#946;-Faltblatt ausbilden sollten. Die kombinatorische Synthese der Bibliothek erfolgte nach der „Split and Mix" Methode. Zum Unterscheiden der einzelnen Mitglieder untereinander, wurde die feste Phase zusammen mit einem Radiofrequenzchip in IRORI MikroKans gegeben. Durch die unterschiedlichen Aminos{\"a}uren ist die Bibliothek f{\"u}r die Katalyse in polaren L{\"o}sungsmitteln wie Wasser konzipiert worden. Als exemplarische Katalysereaktionen wurden dabei zwei Hydrolysereaktionen (Phosphatspaltung und Esterspaltung) ausgesucht. Zun{\"a}chst wurde f{\"u}r beide Reaktionen ein Screening mit unterschiedlichen Bedingungen durchgef{\"u}hrt. Dabei hat sich gezeigt, dass bei der Phosphatspaltung nur dann die Reaktion katalysiert wurde, wenn das k{\"u}nstliche Argininanalogon, welches in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert wurde, vorhanden war. Der beste Katalysator hat die Reaktion 175-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei dem Screening der Esterspaltung hat sich herausgestellt, dass die Aminos{\"a}ure Histidin essentiell f{\"u}r die katalytische Aktivit{\"a}t ist. Der beste Katalysator bei der Esterspaltung hat die Hydrolyse des Esters 345-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei beiden Reaktionen hat sich gezeigt, dass die Sequenz der Katalysatoren sehr wichtig f{\"u}r die Katalyse ist. So verringert z.B. bei der Esterhydrolyse der Austausch zweier Aminos{\"a}uren eine Verringerung der Aktivit{\"a}t von dem Faktor 294 auf den Beschleunigungsfaktor 35. Auch konnten beide Katalysereaktionen in w{\"a}ssrigem gepufferten L{\"o}sung durchgef{\"u}hrt werden. Damit ist es m{\"o}glich gewesen neue Oktapeptide f{\"u}r die Katalyse von Phosphat- und Esterspaltung zu finden und diese erfolgreich im Screening als auch in L{\"o}sung zu untersuchen.},
  subject      = {Organokatalyse},
  language  = {de}
}