@phdthesis{Schaefer2012,
  author    = {Schaefer, Benjamin},
  title     = {Computergest{\"u}tzte Untersuchungen zur Inhibition und Dynamik der ß-Ketoacyl-ACP-Synthase I (KasA) aus Mycobacterium tuberculosis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74635},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit beschreibt die Durchf{\"u}hrung computergest{\"u}tzter Untersuchungen an den Wildtyp-Kristallstrukturen dieses Enzyms - einerseits zur Suche nach neuen Inhibitoren im Rahmen von virtuellen Screening- (VS-) Studien, andererseits zur Charakterisierung der strukturellen Flexibilit{\"a}t mit Hilfe von Molekulardynamik- (MD-) Simulationen. F{\"u}r ein erstes VS wurde zun{\"a}chst eine Datenbank von mehreren Millionen kommerziell erh{\"a}ltlichen Verbindungen mit Arzneistoff-{\"a}hnlichen physikochemischen Eigenschaften erstellt. Als Ausgangspunkt der Screening-Studie diente ein Teildatensatz, welcher mit Hilfe eines auf dem nativen Bindemodus des KasA-Inhibitors Thiolactomycin (TLM) beruhenden Pharmakophormodells erhalten wurde. Diese Verbindungen wurden in die Bindetasche von KasA gedockt und die Qualit{\"a}t der erhaltenen Posen in einem Re- und Konsensus-Scoring-Verfahren bewertet. Schließlich wurden 14 Substanzen k{\"a}uflich erworben und im Rahmen einer Fluoreszenz-Bindungsstudie experimentell getestet. F{\"u}r sechs Molek{\"u}le war gegen{\"u}ber KasA eine schwache, zu TLM vergleichbare Aktivit{\"a}t zu verzeichnen. Eine zweite VS-Studie befasste sich mit der Bewertung der Bindungsaffinit{\"a}t synthetisch leicht zug{\"a}nglicher Derivate von GS95, einem gegen{\"u}ber dem KasA-Wildtyp aktiven Molek{\"u}l mit einer 1-Benzyluracil-Grundstruktur. Anhand geeigneter Synthesebausteine wurde eine virtuelle Datenbank von insgesamt 16 Derivaten erstellt, welche in die Bindetasche des Enzyms gedockt wurden. F{\"u}r die vorhergesagten Bindemodi erfolgte dann eine Absch{\"a}tzung der freien Bindungsenthalpie. Nach einer Bewertung der Orientierungen auf Basis der errechneten ΔG-Werte sowie einer visuellen Analyse wurden schließlich elf Verbindungen synthetisiert und im Fluoreszenz-Experiment getestet, wobei f{\"u}r alle Uracilderivate eine Aktivit{\"a}t zu beobachten war. Die Kd-Werte fallen jedoch {\"a}hnlich hoch aus wie bei GS95. Zur Untersuchung der Strukturdynamik des KasA-Wildtyps wurden drei MD-Simulationen des homodimeren Proteins von je 15 ns L{\"a}nge durchgef{\"u}hrt. Mit Hilfe von 2D-RMSD-Berechnungen und einer hierarchischen Clusteranalyse wurden aus den drei Simulationen insgesamt zehn repr{\"a}sentative Snapshots entnommen, welche die im Rahmen der Simulationszeit von insgesamt 90 ns produzierte strukturelle Vielfalt der Bindetasche von KasA wiedergeben. Wie die Analysen zeigen, wird ein dualer Charakter hinsichtlich der Flexibilit{\"a}t der unmittelbaren Taschenreste beobachtet. Hierbei zeigt Phe404 eine besonders ausgepr{\"a}gte strukturelle Vielfalt; diese Beobachtung deckt sich mit der gatekeeper-Rolle der Aminos{\"a}ure zwischen der Malonyl-Bindetasche und dem Acyl-Bindekanal, welcher f{\"u}r die Unterbringung der wachsenden Fetts{\"a}urekette im Enzym w{\"a}hrend der Katalyse verantwortlich zeichnet. Dar{\"u}ber hinaus erkl{\"a}rt die hohe Flexibilit{\"a}t von Phe404 m{\"o}glicherweise die recht schwache Bindungsaffinit{\"a}t von TLM gegen{\"u}ber dem Wildtyp von KasA, da die gatekeeper-Aminos{\"a}ure nur in der geschlossenen Form einen stabilisierenden Effekt auf den Liganden aus{\"u}bt. Besondere Bedeutung kommt hierbei einem Wassermolek{\"u}l zu, welches als eine Art molekularer Schalter f{\"u}r die Flexibilit{\"a}t von Phe404 betrachtet werden kann und somit die Fixierung von TLM in der Bindetasche maßgeblich beeinflusst. Des Weiteren wurden innerhalb der Tasche hohe Besetzungsraten f{\"u}r je ein Wassermolek{\"u}l identifiziert. Die aus den MD-Simulationen gewonnenen Erkenntnisse wurden anschließend zur Aufstellung von Empfehlungen f{\"u}r das Design neuartiger KasA-Inhibitoren verwendet. Des Weiteren wurde die Dynamik des oben erw{\"a}hnten Acyl-Bindekanals, welcher sich aus den Aminos{\"a}uren 115-147 zusammensetzt, n{\"a}her charakterisiert. Hierbei wurden die Reste 115-119 und insbesondere Leu116 als zweiter gatekeeper identifiziert, welcher die {\"O}ffnung des Acyl-Bindekanals zur Oberfl{\"a}che des Proteins reguliert und somit eine entscheidende Funktion bei der Unterbringung der langkettigen Fetts{\"a}uresubstrate {\"u}bernimmt. Schließlich wurden zwei repr{\"a}sentative Bindetaschenkonformationen aus den MD-Simulationen hinsichtlich einer Verwendung in strukturbasierten VS-Studien n{\"a}her untersucht. Mit Hilfe von hot spot Analysen und unter Ber{\"u}cksichtigung oben genannter Empfehlungen f{\"u}r das Design neuartiger KasA-Inhibitoren wurden verschiedene Pharmakophormodelle erstellt, welche nach Durchsuchung der zu Anfang dieses Kapitels erw{\"a}hnten virtuellen Molek{\"u}ldatenbank zwischen 149 und 420 verschiedene hit-Strukturen lieferten. Folglich scheint eine Adressierung der beiden Konformationen durch arzneistoffartige Verbindungen prinzipiell m{\"o}glich. Unter den erhaltenen Verbindungen herrscht eine hohe strukturelle Vielfalt; außerdem unterscheiden sich diese im Allgemeinen deutlich von den Molek{\"u}len aus den vorangegangenen VS Studien, was das Potential der beiden Bindetaschenkonformationen zur Identifizierung von potentiellen KasA-Inhibitoren mit neuartigen Grundstrukturen zum Ausdruck bringt.},
  subject      = {Tuberkelbakterium},
  language  = {de}
}