@article{DuschlJahnBertlingetal.1992, author = {Duschl, Albert and Jahn, Ute and Bertling, Claudia and Sebald, Walter}, title = {A comparison of assays for the response of primary human T-cells upon stimulation with interleukin-2, interleukin-4 and interleukin-7}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-86750}, year = {1992}, abstract = {The most commonly used assay to quantitate the response of peripheral T~cells upon stimulation with growth factors is determination of incorporated (JH]TdR. We compared thls test to three other methods: 1. direct countlog of cells with a Coulter type counter as reference assay, 2. a colorimetric assay using the tetrazolium dye 3-[ 4,S-dimethylthiazol-l-yl]-2,5diphenyl tetrazolium (MTT), which is a cheap and increasingly popular non-radioactive method and 3. incorporation of the thymidine analog 5-bromo-2'-deoxyuridine detection with a monoclonal antibody on cytospins. Primary human PHA-blasts from >30 healthy individuals were stimulated with IL-2, IL-4 aod IL-7 and assayed with up to four different methods. We discuss the advantages and disadvantages of the assays used and tbe effects of differences between cell preparations. We observed no significant variations between individuals for the dose dependence, but the relative emctency of IL4 compared to IL-2 and IL-7 was variable. This was probably due to the slower response observed upon stimulation with this factor.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} } @phdthesis{Hoffacker2001, author = {Hoffacker, Viola Josefa Maria}, title = {Abnormes Mikromilieu und gest{\"o}rte Thymopoese in Thymomen als Grundlage der Autoimmunisierung im peripheren Immunsystem}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1413}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Thymome sind die einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorl{\"a}uferzellen generieren, wobei die unreifen Thymozytenpopulationen in Thymomen im Vergleich zum Thymus abnorm vermehrt und die reifen Populationen vermindert sind. Zus{\"a}tzlich weist das Thymomgewebe im Vergleich zum Thymus weniger B-Zellen und Effektor-T-Zellen auf. Bisher ist unbekannt, welche Faktoren die ver{\"a}nderte intratumor{\"o}se Zusammensetzung der Zellpopulationen bedingen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Mikromilieufaktoren in Thymomen mit m{\"o}glichen Auswirkungen auf die intratumor{\"o}se Thymopoese zu identifizieren und deren Einfluß auf das periphere Immunsystem zu untersuchen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde nach Ursachen f{\"u}r die abnorme Thymozytenreifung und die Generierung autoreaktiver T-Zellen in Thymomen gesucht. Als potentielles Autoantigen, das die positive Selektion in Thymomen beeinflussen k{\"o}nnte, wurde das in Thymomen exprimierte Protein p153 als Neurofilament mittleren Molekulargewichtes (NF-M) identifiziert. Mittels T-Zell-Proliferationstests konnte gezeigt werden, daß intratumor{\"o}se T-Zellen von Thymompatienten mit Myasthenia gravis (MG) nach Stimulation mit dem mittleren Fragment dieses Proteins (NF-M-B) signifikant h{\"o}here Antworten aufwiesen als Thymozyten von Thymitispatienten oder Thymompatienten ohne MG. NF-M-B-reaktive T-Zellen waren charakteristisch f{\"u}r die paraneoplastische MG, wohingegen T-Zell-Antworten gegen ein Azetylcholinrezeptor (AChR)-Fragment bei allen MG-Patienten (Thymitis und Thymom) erh{\"o}ht waren. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, daß intratumor{\"o}ses NF-M eine autoantigene Determinante speziell f{\"u}r die paraneoplastische MG darstellt. Das Mikromilieu von Thymomen wurde außerdem mittels cDNA-Arrays und RT-PCR analysiert. Als differentiell exprimierte Gene sind besonders das "Heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) und der "B-cell growth factor 1" (BCGF 1) hervorzuheben. Die Expression von HB-GAM zeigte sowohl eine Abh{\"a}ngigkeit vom histologischen Thymomtyp (kortikal > gemischt / medull{\"a}r) als auch vom MG-Status der Patienten (MG+ > MG-).Umgekehrt wurde f{\"u}r den Faktor BCGF 1 eine signifikante Erh{\"o}hung in Thymomen ohne MG gefunden und keine Abh{\"a}ngigkeit vom histologischen Thymomtyp. Die Expression des Chemokins "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) war ebenfalls mit dem MG (+)-Status von Thymompatienten signifikant assoziiert. Diese Befunde machen eine Beteiligung von HB-GAM, BCGF 1 und I-TAC an der Pathogenese der paraneoplastischen MG wahrscheinlich. Im Gegensatz dazu wurde die Expression des Chemokins "Thymus-expressed chemokine" (TECK) weder durch den histologischen Thymomtyp noch durch den MG-Status der Patienten beeinflußt. TECK ist vermutlich auch in Thymomen daf{\"u}r verantwortlich, daß unreife Thymozyten nicht ins Blut gelangen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von FACS-Analysen und T-Zell-Proliferationsassays der Einfluß von Thymomen auf das periphere Immunsystem untersucht. Es zeigte sich, daß die ver{\"a}nderte Thymopoese und autoreaktive T-Zell-Funktion in Thymomen mit immunologischen Ver{\"a}nderungen im Blut korreliert waren. Der Anteil zirkulierender CD45RA+ CD8+ T-Zellen war bei Thymompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erh{\"o}ht, in {\"U}bereinstimmung mit einer intratumor{\"o}sen T-Zell-Reifung, die in Richtung der CD8+-Linie verschoben war. Auf funktioneller Ebene war die intratumor{\"o}s nachweisbare, thymomtypische T-Zell-Autoreaktivit{\"a}t gegen NF-M-B und alpha-AChR (301-398) gleichermaßen im Thymom und Blut zu finden. Diese funktionellen Studien unterst{\"u}tzen die Hypothese, daß die in Thymomen stattfindende Thymopoese das periphere T-Zell-Repertoire ver{\"a}ndert. Hinsichtlich des Importes von T-Zellen aus der Peripherie in das Thymom ergaben die funktionellen Assays dagegen, daß T-Zellen, die auf ein fremdes Antigen (Tetanus Toxoid) reagierten, nur innerhalb zirkulierender T-Zellen, nicht aber innerhalb intratumor{\"o}ser Thymozyten nachweisbar waren. Ebenso fanden sich erh{\"o}hte autoreaktive T-Zell-Antworten gegen andere Fragmente des NF-M-Proteins (NF-M-A und NF-M-C) sowie f{\"u}r ein Fragment der delta-Untereinheit des AChR nur im Blut von Thymompatienten. Diese Befunde sprechen daf{\"u}r, daß die Migration von Effektor-T-Zellen aus der Peripherie ins Thymom vermindert ist. W{\"a}hrend die Mechanismen f{\"u}r diese gest{\"o}rte T-Zell-Rezirkulation ins Thymom ungekl{\"a}rt sind, bestand eine Korrelation zwischen der Expression des B-Zell-spezifischen Chemokins BLC (B-Lymphocyte chemoattractant) und der Anzahl der B-Zellen, die immunhistochemisch in den entsprechenden Geweben dargestellt wurden. Dieser Befund kann auf eine Rolle von BLC bei der Migration reifer B-Zellen in Thymus- bzw. Thymomgewebe hinweisen. Zusammenfassend konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Mikromilieufaktoren benannt werden, die von potentieller pathogenetischer Relevanz f{\"u}r die gest{\"o}rte, nicht-tolerogene Thymopoese innerhalb von Thymomen sind. Zweitens konnte eindeutig gezeigt werden, daß die intratumor{\"o}se Thymopoese das periphere Immunsystem beeinflußt und bei MG-assoziierten Thymomen in Richtung auf ein h{\"o}heres autoreaktives Potential ver{\"a}ndert}, subject = {Thymom}, language = {de} } @phdthesis{Fichtner2020, author = {Fichtner, Alina Suzann}, title = {Alpaca, armadillo and cotton rat as new animal models for nonconventional T cells: Identification of cell populations and analysis of antigen receptors and ligands}, doi = {10.25972/OPUS-16910}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-169108}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {In this thesis, three species were investigated for the conservation of two non-conventional T cell systems, the CD1d/ iNKT cell system and the BTN3/ Vγ9Vδ2 T cell system. Non-conventional T cells are αβ or γδ T cells that do not fit into the classical mode of antigen recognition and adaptive responses. These T cells recognize antigens different from classical peptide antigens and are not restricted to the polymorphic MHC molecules but rather to non-polymorphic antigen-presenting molecules. The iNKT cell subset is restricted by the lipid antigen-presenting molecule CD1d and carries out immunomodulatory functions by rapid cytokine secretion. The molecular basis of this system, the semi-invariant iNKT TCR chains and CD1d were proven to be expressed and compared to homologs in human and rodents. Cotton rats possess multiple members of the AV14 and BV8 family and only one isoform of CD1d which is comparable to findings in the rat. Moreover, the reactivity of primary cells to glycolipid antigens could be shown, and an iNKT cell-like population was detected in primary cells using newly developed cotton rat CD1d oligomers. These were also applied to test the capacity of CD1d to present typical glycolipid antigens to iNKT TCR transductants. In addition, expression of cotton rat iNKT TCR α and β chains in TCR-negative cell lines was used to show successful pairing and detection of glycolipids in the context of CD1d. In summary, the conservation of a functional CD1d/iNKT cell system in the cotton rat could be shown, and tools were developed to study this cell subset in the course of infectious diseases. The Vγ9Vδ2 T cell subset is the major γδ T cell subset in human peripheral blood and has the unique ability to contribute to immune surveillance by detecting pyrophosphorylated metabolites of isoprenoid synthesis that indicate cell stress, transformation or infection. Up to this date, phosphoantigen-reactive γδ T cells have only been shown in primate species. However, evidence for the existence and functional conservation of the genes implied in the BTN3/Vγ9Vδ2 T cell system was found in several placental mammal species, and two candidate species were chosen for further investigation. The nine-banded armadillo, a valuable model for leprosy research, was shown to possess homologous genes to TRGV9, TRDV2 and BTN3. In this study, the expression of productive rearrangements of TRDV2 gene segments could be shown in peripheral blood samples, but no evidence was found for the expression of a functional TRGV9 rearrangement or BTN3 molecules. Moreover, determinants of phosphoantigen-reactive Vγ9Vδ2 T cells and functional BTN3 molecules were found to still be prevalent in armadillo genes. This makes the armadillo an interesting model to study the structural determinants that allow phosphoantigen recognition by a functional Vγ9Vδ2 T cell subset although this species is merely a witness for a functional system in a placental mammal ancestor. In contrast, alpacas were shown to express functional Vγ9Vδ2 T cells which conserved many features of the human counterpart. Expression of Vγ9Vδ2 pairings could be shown by single-cell PCR and functional phosphoantigenreactive pairings were observed. This phosphoantigen reactivity was also shown in PBMC cultures with a newly developed antibody specific for alpaca Vδ2Jδ4 chains. Moreover, a more detailed study of the alpaca TCR repertoire showed similarities to "γδ high" species like camelids and cattle which possess an extended family of TRDV genes. The γ and δ loci of alpaca TCR genes were drafted based on genomic information and cDNA studies and provide an overview for more detailed studies. Conservation of phosphoantigen recognition by the single BTN3 molecule of alpacas was shown in 293T knock out cell lines, and BTN3 detection on PBMCs was investigated with a newly developed alpaca BTN3-specific antibody. These findings prove the existence of a functional BTN3-dependent phosphoantigen-reactive Vγ9Vδ2 T cell subset and provide a basis for the future study of this cell system in a non-primate species. Moreover, as the first non-primate candidate species with the BTN3/Vγ9Vδ2 T cell system the alpaca is an important outgroup for research in this field. The use of a single BTN3 variant in contrast to three human isoforms that work together renders the alpaca a unique and to this date indispensable model for Vγ9Vδ2 T cells. In conclusion, this study provides an overview of the applicability of new animal models in the study of the non-conventional T cell subsets iNKT cells and Vγ9Vδ2 T cells and leads the way for a better understanding of structural and functional relationships.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} } @phdthesis{Hauff2009, author = {Hauff, Cornelia}, title = {Aspects of the mode of action of bispecific T cell engager (BiTE) antibodies}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48369}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Bispecific T cell engager (BiTE) display a novel design among the class of bispecific antibodies and hold great promise to fight diverse cancers. BiTE molecules consist of two different binding entities derived from two human IgG antibodies connected by a short peptide linker. Their binding arms are directed against the CD3e chain of the T cell receptor on T cells and against an antigen that is specific for (e.g., CD19 for lymphoma in MT103) or over-expressed on (e.g., EpCAM for epithelial cancer in MT110) tumor cells. Without requirement for pre- or co-stimulation, BiTE molecules efficiently redirect CD3+ T cells towards tumor cells expressing the relevant target antigen. Only a BiTE molecule simultaneously bound to both tumor cell and T cell activates the T cell to exert its cytolytic function resulting in tumor cell death. In T cells stimulated with both BiTE and target cells, elevated levels of caspase activation and increased expression of cytotoxic and signaling proteins are observed. These include cytolytic proteins granzyme B and perforin, activation markers CD69 and CD25 and adhesion molecules CD2 and LFA-1. Activated T cells secrete the usual mix of cytokines, among them pro-inflammatory cytokines IFN-g and TNF-a. The membrane of tumor cells expressing the relevant target antigen is perforated during the attack of BiTE-stimulated effector cells as can be concluded from adenylate kinase release from the cytosol of tumor cells. Ca2+-chelator EGTA completely blocked BiTE-mediated activation of caspases and tumor cell lysis. As perforin is strictly Ca2+-dependent, a major role for this pore-forming protein is assumed for the elimination of tumor cells via BiTE-stimulated T cells. Granzyme B and caspases are main players in BiTE-mediated elimination of tumor cells. Inhibitors of granzyme B or caspases reduce or block, respectively the activation of caspases. However, other signals of apoptosis (cleavage of PARP and fragmentation of DNA) were only reduced by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. Most interestingly, the lytic capacity of BiTE molecules was not impaired by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. It seems that there is no requirement for granzyme B and caspases to be present simultaneously. Instead the data presented provide evidence that they can be replaced one at a time by related proteins. Pre-incubation of effector cells with the glucocorticoids dexamethasone or methylprednisolone resulted in markedly decreased secretion of cytokines by T cells yet only a small reduction in the expression of activation markers and adhesion molecules on T cells and specific lysis of tumor cells upon BiTE stimulation. Soluble factors secreted in an undirected manner by BiTE-stimulated T cells do not mediate tumor cell death by themselves. Bystander cells negative for the antigen that is recognized by the BiTE molecule will not be compromised by BiTE activity. The cytokine TGF-b reduced proliferation as well as granzyme B and perforin expression of BiTE-stimulated T cells. Redirected lysis by BiTE-activated T cells was also decreased under the influence of TGF-b, however lysis was still performed at a reasonable rate (72 \% of target cells). TGF-b does not exert a deleterious effect on lytic potential of BiTE-stimulated T cells. The minimal anticipated biological effect level for the BiTE MT110 was determined for the entry of MT110 into phase I clinical studies. Experiments analyzing redirected lysis of tumor cells, expression of activation marker CD25 and cytokine release by T cells revealed a MABEL value of 50 pg/ml for MT110.}, subject = {Antik{\"o}rper}, language = {en} } @phdthesis{Lex2022, author = {Lex, Veronika}, title = {Auswirkung verschiedener Ausreifungscocktails auf die Kreuzpr{\"a}sentationsf{\"a}higkeit dendritischer Zellen}, doi = {10.25972/OPUS-25333}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-253334}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung optimaler DCs f{\"u}r die Generierung von therapeutischen Tumorvakzinen. Neben den essenziellen Eigenschaften der DCs wie der Migrationsf{\"a}higkeit, der Hochregulation kostimulatorischer Molek{\"u}le sowie der Zytokinaussch{\"u}ttung, ist auch die optimale Aufnahme von Tumor-spezifischen Antigenen und deren Pr{\"a}sentation besonders wichtig, um eine effiziente Immunantwort zur erm{\"o}glichen. Wichtigstes Ziel war es {\"u}ber einen optimalen Ausreifungscocktail der DCS eine effektive Antwort der zytotoxischen CD8\(^+\)-Zellen zu erzielen. Dies geschieht im Rahmen der Pr{\"a}sentation von z.B. exogenen Antigenen wie in unserem Falle eines CMV-Proteins {\"u}ber den Weg der sogenannten Kreuzpr{\"a}sentation. Hierzu wurde im Rahmen dieser Arbeit der in unserer Klinik etablierte zytokinbasierte Ausreifungscocktail (IL-1β, TNFα) mit einem Ausreifungscocktail, welcher Toll-like-Rezeptor-Agonisten mit PGE\(_2\) kombiniert, verglichen. Wir konnten erstmals zeigen, dass PGE\(_2\) nicht nur einen Einfluss auf die Ausreifung, Zytokinproduktion und somit Migrationsf{\"a}higkeit der DCs hat wie in der Literatur beschrieben, sondern auch auf die Kreuzpr{\"a}sentationsf{\"a}higkeit exogener Antigene. Das Weglassen von PGE\(_2\) im Cocktail 2 f{\"u}hrte zu einer signifikant besseren Kreuzpr{\"a}sentationsf{\"a}higkeit. Somit l{\"a}sst sich durch unsere Experimente auf eine hemmende Wirkung von PGE\(_2\) auf die T-Zell-Aktivierung {\"u}ber die Kreuzpr{\"a}sentation schließen. Als m{\"o}gliche Schlussfolgerung unserer Experimente sollte bei der Arbeit mit Antigenen, welche {\"u}ber Kreuzpr{\"a}sentation eine T-Zell-Antwort ausl{\"o}sen (Proteine, Tumorlysat, long-peptides) auf die Zugabe von PGE\(_2\) im Ausreifungscocktail verzichtet werden.}, subject = {Dendritische Zelle}, language = {de} } @phdthesis{Riano2016, author = {Ria{\~n}o, Rub{\´e}n Felipe}, title = {BTN3A1 in the immune response of Vγ9Vδ2 T cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-142084}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {Human Vγ9Vδ2 T cells are the main γδ T cell subset in the circulation, accounting for up to 5\% of the total peripheral blood lymphocyte population. They have been suggested to be important in response to tumors and infections. Their immune mechanisms encompass cell killing via cytotoxicity and secretion of pro-inflammatory cytokines such as IFNγ and tumor necrosis factor (TNF). The main stimulators of Vγ9Vδ2 T cells are isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), denominated phosphoantigens (PAg). A major advance in the understanding of PAg detection and Vγ9Vδ2 T cell activation has been the identification of the butyrophlin 3A (BTN3A) proteins as key mediators in these processes. In humans, three isoforms constitute the BTN3A family: BTN3A1, BTN3A2, and BTN3A3; and their genes are localized on the short arm of chromosome 6. The role of BTN3A1 has been highlighted by BTN3A-specific monoclonal antibody 20.1 (mAb 20.1), which has an agonist effect and causes proliferation, expansion, and activation of primary human Vγ9Vδ2 T cells. On the other hand, BTN3A-specific monoclonal antibody 103.2 (mAb 103.2) is antagonistic, inhibiting the Vγ9Vδ2 T cell response. The actual mechanism underlying both PAg- and mAb 20.1-mediated activation is not completely elucidated, but the importance of BTN3A1 is clear. The main objective of this dissertation was to characterize the role of BTN3A1 in the PAg-dependent and PAg-independent Vγ9Vδ2 T cell activation and to evaluate its contribution in the response to influeza A virus infected cells. This research work demonstrated, by using Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine cells (reporter cells), that human chromosome 6 (Chr6) is mandatory for PAg-induced stimulation, but not for stimulation with mAb 20.1. The reporter cells responded to mAb 20.1 in cultures with BTN3A1-transduced Chinese hamster ovary cells (CHO BTN3A1) as antigen presenting cells. Nevertheless, for PAg-dependent activation the presence of Chr6 in CHO BTN3A1 was mandatory. Although reporter cells expressing clonotypically different Vγ9Vδ2 TCRs showed similar PAg response, they clearly differed in the mAb 20.1 response. The reporter cell line transduced with Vγ9Vδ2 TCR D1C55 demonstrated essentially no response to mAb 20.1 compared to Vγ9Vδ2 TCR MOP cells. These findings were further supported by experiments performed with human PBMCs-derived Vγ9Vδ2 T cell clones. The results indicate heterogeneity in the PAg- and 20.1-dependent responses, in terms of CD25 and CD69 expression, among three different Vγ9Vδ2 T cells clones. Co-cultures of reporter cells with Raji RT1BI and PAg plus mAb 20.1 or single chain antibody 20.1 (sc 20.1) revealed no additive or synergistic activating effects. In contrast, mAb 20.1 or sc 20.1 inhibited the PAg-mediated activation of the reporter cells. The comparison of the relative contribution of the isoforms BTN3A2 and BTN3A3, in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, was undertaken by overexpression of these isoforms in CHO cells. The results showed that BTN3A2 contributes to both PAg- and mAb-induced Vγ9Vδ2 T cell activation. On the contrary, BTN3A3 does not support PAg-mediated γδ T cell response. Additionally, mutations in the proposed PAg- and mAb 20.1-binding sites of the extracellular BTN3A1 domain were generated by means of site-directed mutagenesis. These mutations revoked the mAb 20.1-induced Vγ9Vδ2 T cell activation, but not that induced by PAg. Finally, co-cultures of Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine reporter cells with influenza A/PR/8/34-infected cells, or infection of PBMCs with this virus strain indicated that BTN3A1 might be dispensable for the Vγ9Vδ2 T cell response against influenza A. The data of this research work points out that: i) in addition to BTN3A1, other Chr6-encoded genes are necessary for Vγ9Vδ2 T cell activation with PAg; ii) clonotypical (CDR3) differences influence the PAg- and mAb 20.1-mediated Vγ9Vδ2 T cell activation; iii) the PAg- and mAb 20.1-induced responses are not synergistic and interfere with each other; iv) BTN3A2 and BTN3A3 isoforms differ in the ability to support PAg- or mAb 20.1-dependent Vγ9Vδ2 T cell activation; v) the importance of the intracellular B30.2 domain of BTN3A1, in the Vγ9Vδ2 T cell activation, might be higher than that of the extracellular domain; and vi) in spite of the importance of BTN3A1 in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, it is possible that many molecules with redundant functions are involved in the elimination of influenza virus infection by these cells. In summary, it is possible to hypothesize a model in which BTN3A1 detects prenyl pyrophosphates in the cytoplasm via its B30.2 domain and in association with another protein(s). The binding of PAg to this domain induces a multimerization of BTN3A1 or a conformational change of its extracellular domain (mimicked by mAb 20.1). These modifications might be recognized by the Vγ9Vδ2 TCR or by an associated T cell protein. In the case that the TCR directly recognizes BTN3A1, the intensity of the response will depend on the Vγ9Vδ2 TCR clonotype. Future research will allow to gain a better understanding of BTN3A1, its interaction with other proteins, its actual role in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, and its importance in specific models of cancer or infection. This knowledge will be necessary to transform these cells into effective tools in the clinic.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} } @phdthesis{Trebing2014, author = {Trebing, Johannes}, title = {CD70-abh{\"a}ngige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-111592}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antik{\"o}rpers mit einer Fc-unabh{\"a}ngigen Zelltod-induzierenden Aktivit{\"a}t auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Dom{\"a}ne sowie aus einer TRAIL-Dom{\"a}ne bestehen. Der CD70-spezifische monoklonale Antik{\"o}rper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antik{\"o}rper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist f{\"u}r den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellul{\"a}rer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinit{\"a}t der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion f{\"u}hrt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). F{\"u}r die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Pr{\"a}ferenz f{\"u}r den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Pr{\"a}ferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellul{\"a}ren GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zus{\"a}tzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalit{\"a}tsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) best{\"a}tigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifit{\"a}t der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten l{\"o}slichen TRAIL-Trimeren waren nur die quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 h{\"o}her als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizit{\"a}tsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verst{\"a}rkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte gr{\"o}ßtenteils erst nach Oligomerisierung {\"u}berhaupt eine Bioaktivit{\"a}t bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verst{\"a}rkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizit{\"a}tsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizit{\"a}t der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verst{\"a}rkte (Abb. 15, 17). In {\"U}bereinstimmung mit der verst{\"a}rkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antik{\"o}rpers f{\"u}hrte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivit{\"a}t von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer st{\"a}rkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss. Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivit{\"a}t von l{\"o}slichem TRAIL {\"u}ber ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerw{\"u}nschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Dar{\"u}ber hinaus k{\"o}nnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die prim{\"a}r durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen {\"u}ber Funktionalit{\"a}t, Halbwertszeiten, sowie Effektivit{\"a}t und Vertr{\"a}glichkeit treffen zu k{\"o}nnen.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Herrmann2014, author = {Herrmann, Alexander Michael}, title = {CD8+ Lymphozyten mediierter Angriff auf Neuronen des ZNS: Relevanz von Granzym B und Perforin f{\"u}r akute elektrophysiologische Ver{\"a}nderungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-109124}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten spielen in vielen inflammatorischen, aber auch prim{\"a}r neurodegenerativen Erkrankungen eine wichtige Rolle. Daher besitzt die Fragestellung inwiefern CD8+ ZTL Neurone direkt sch{\"a}digen und ggf. welche mechanistischen Aspekte dieser Sch{\"a}digung zugrunde liegen, eine hohe Relevanz. Um diese Fragestellung eingehender zu beleuchten, wurde mit dem OT-I-System gearbeitet. Dieses gut vorcharakterisierte CD8+ T-Zell-Modell besitzt den Vorteil, dass diese transgenen Zellen nur eine Peptidsequenz des Ovalbumin (OVA) Protein als spezifisches Antigen erkennen. Zun{\"a}chst wurden in der vorliegenden Arbeit Co-Kultivierungs-Experimente durchgef{\"u}hrt. Hierzu wurden akut isolierte murine Hippokampus-Neurone unter verschiedenen Bedingungen mit OT-I Lymphozyten co-kultiviert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass unter Antigenpr{\"a}sentation der Neurone signifikant mehr Neurone in die Apoptose/Nekrose gef{\"u}hrt werden, als unter Kontroll-Bedingungen, in denen entweder kein Antigen oder ein Antigen, das nicht von OT-I Lymphozyten erkannt wird, pr{\"a}sentiert wird. Nachdem die Antigen-abh{\"a}ngigen zytotoxischen Effekte auf Neurone gezeigt werden konnten, wurde mithilfe elektrophysiologischer Techniken die mechanistischen und funktionellen Konsequenzen des direkten neuronalen/OT-I-vermittelten Zellkontakts untersucht. Bei diesem experimentellen Ansatz wurde durch elektrisches Auslenken eines Neurons nach Kontakt mit einem OT-I Lymphozyt die passiven elektrischen Parameter der Neuronenmembran gemessen. In diesen Messungen konnte gezeigt werden, dass nach unmittelbarem Kontakt eines Neurons mit einem OT-I Lymphozyt der neuronale Membranwiderstand reduziert wird bzw. die Leitf{\"a}higkeit der Zellmembran erh{\"o}ht wird. Diese {\"A}nderung der neuronalen Membran-Leitf{\"a}higkeit findet in einem Zeitraum von 10 min nach dem Zell-Zell-Kontakt statt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass dieser Einfluss von OT-I Lymphozyten auf Neurone strikt Antigen-abh{\"a}ngig ist. Zur Untersuchung des Mechanismus der OT-I T-Lymphozyten auf Neurone wurde das Augenmerk auf verschiedene T-Zell-induzierte Apoptosewegegelegt. Es konnte gezeigt werden, dass durch Blockieren der Fas/FasL-Interaktion mittels eines Antik{\"o}rpers kein Unterschied, weder in der neuronalen Apoptoserate nach Co-Kultivierung, noch eine {\"A}nderung der passiven neuronalen Membran-Leitf{\"a}higkeit auftritt. Weiterhin wurde die Rolle der von T-Zellen sezernierten Granula Perforin und Granzym B untersucht. Um den Einfluss dieser Granula aufzukl{\"a}ren, wurden OT-I Lymphozyten verwendet, die entweder defizient f{\"u}r Perforin oder Granzym B waren. In diesem experimentellen Ansatz wurde gezeigt, dass ausschließlich Perforin f{\"u}r die Erniedrigung des passiven neuronalen Membran-Widerstandes verantwortlich ist. Diese Erh{\"o}hung der neuronalen Membranleitf{\"a}higkeit f{\"u}hrte aber nicht direkt zum neuronalen Zelltod. Vielmehr wurde durch die einhergehende Depolarisation des Neurons die elektrische Aktivit{\"a}t der Zelle vermindert, sodass es zu einem sogenannten „electrical silencing" kommt. Dieser Umstand konnte auch in der Betrachtung der spontanen Netzwerkaktivit{\"a}t von Neuronenkulturen gezeigt werden. Hierf{\"u}r wurden hoch dichte Neuronenkulturen auf MEA-Chips kultiviert. Mit Hilfe dieser MEA konnten die Summenfeldpotentiale der Neuronenkulturen detektiert werden. Hierbei wurde beobachtet, dass nach Beladung der Neuronen mit dem spezifischen OT-I-Antigen und OT-I Zellen eine Verringerung der spontanen Netzwerkaktivit{\"a}t einhergeht. Auch in diesem Effekt konnte eine Antigen-Spezifit{\"a}t nachgewiesen werden. Da der Prozess der zellul{\"a}ren Apoptose mit einem Anstieg der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration einhergeht, und Perforin als Ca2+-durchl{\"a}ssiger unselektiver Porenbildner fungiert, wurden zur {\"U}berpr{\"u}fung der Hypothese calcium imaging-Experimente durchgef{\"u}hrt. Analog zu den elektrophysiologischen Messungen wurde gezeigt, dass nach direktem Zell-Zell-Kontakt zwischen Neuron und OT-I Lymphozyt eine Erh{\"o}hung der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration zu messen ist. Dass diese {\"A}nderung des neuronalen Ca2+-Einstroms durch Perforin-abh{\"a}ngige Membranporen hervorgerufen wird, konnte durch die Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten bewiesen werden. Unter Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten wurde keine {\"A}nderung der neuronalen Ca2+-Konzentration ermittelt. Weiterhin wurde in diesem experimentellen Ansatz gezeigt, dass auch der OT-I-vermittelte neuronale Ca2+-Anstieg strikt Antigen-abh{\"a}ngig ist.Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass MHC-I/Antigen-vermittelte CD8+ Lymphozyten-Interaktion mit einem Neuron zu „electrical silencing" des Neurons f{\"u}hrt. Dieser Prozess ist klar Perforin-abh{\"a}ngig, f{\"u}hrt jedoch nicht zum unmittelbaren Zelltod des Neurons.}, subject = {Antigen CD8}, language = {de} } @phdthesis{Matuschek2010, author = {Matuschek, Anja}, title = {Characterization of tolerogenic rat bone marrow-derived dendritic cells and regulatory T cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51708}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verf{\"u}gen {\"u}ber die F{\"a}higkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft f{\"u}r therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunit{\"a}t und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht f{\"u}r die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gew{\"u}nschte Immunhemmung in vivo auszul{\"o}sen und wie der m{\"o}glichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist f{\"u}r die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso {\"u}berraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorl{\"a}uferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an nat{\"u}rlich vorkommenden Treg mit einem Ph{\"a}notyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8\% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}len wie MHC-Klasse II Molek{\"u}l, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression {\"a}nderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verf{\"u}gen somit {\"u}ber einen robusten und gegen{\"u}ber Reifungssignalen {\"u}beraus resistenten Ph{\"a}notyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unf{\"a}hig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verz{\"o}gern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95\%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinaussch{\"u}ttung (IL-2 um 49\% und IFN-γ um 92\%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Molek{\"u}le zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}le PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC l{\"a}sst ebenfalls eine Bedeutung dieser Molek{\"u}le bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung l{\"o}slicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. {\"U}berst{\"a}nde einer 24-st{\"u}ndigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90\%. F{\"u}r diese Immunhemmung scheint das in diesen {\"U}berst{\"a}nden nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen {\"U}berst{\"a}nde reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50\%, doch f{\"u}hrte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Ver{\"a}nderungen auf molekularer Ebene festzustellen w{\"a}ren. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem k{\"o}nnen diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung na{\"i}ver TLymphozyten hemmen. Na{\"i}ve und aktivierte T-Lymphozyten k{\"o}nnen dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen l{\"a}sst, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verst{\"a}rkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus nat{\"u}rlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabh{\"a}ngig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der nat{\"u}rlich vorkommenden Treg zu erh{\"o}hen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Ph{\"a}notyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten l{\"a}sst, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC k{\"o}nnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empf{\"a}ngers zu untersuchen.}, subject = {Dendritische Zelle}, language = {en} } @phdthesis{Lee1999, author = {Lee, Kyeong-Hee}, title = {Cofilin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1681}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {1999}, abstract = {This study has identified cofilin, an actin binding protein, as a control element in the reorganization of the actin cytoskeleton which is highly relevant for T lymphocyte activation. Cofilin is regulated in its activity by reversible phosphorylation which is inducible by stimulation through accessory receptors such as CD2 and CD28. First it could be demonstrated that accessory receptor triggering induces the transient association of cofilin with the actin cytoskeleton and that only the dephosphorylated form of cofilin possesses the capacity to bind cytoskeletal actin in vivo. PI3-kinase inhibitors block both the dephosphorylation of cofilin and its association with the actin cytoskeleton. Importantly, cofilin, actin, PI3-kinase and one of its substrates, namely phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) which can bind to cofilin, co-localize within CD2-receptor caps. The cofilin/F-actin interaction has been identified as a crucial regulatory element for receptor cap formation and the strength of signal transduction. To this end, appropriately designed cell permeable non-toxic peptides that are homologous to actin binding motifs of the human cofilin sequence were introduced into untransformed human peripheral blood T lymphocytes. These peptides competitively and dose dependently inhibit the activation induced interaction of cofilin with the actin cytoskeleton in vivo. By this approach it was possible to study, for the first time, the functional consequences of this interaction in immunocompetent T cells. The present data demonstrate that inhibition of the actin/cofilin interaction in human T lymphocytes by means of these cofilin derived peptides abolishes receptor cap formation and strongly modulates functional T cell responses such as T cell proliferation, interleukin-2 production, cell surface expression of CD69, gIFN production, and CD95L expression. Importantly, receptor independent activation by PMA and calcium ionophore circumvents these peptide produced inhibitory effects on lymphocyte stimulation and places the cofilin/actin interaction to a proximal step in the cascade of signaling events following T cell activation via surface signals. The present results are novel since as yet no information existed regarding the molecular elements which link cell surface receptor stimulation directly to the resulting reorganization of the actin cytoskeleton.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} } @phdthesis{Foeger2000, author = {F{\"o}ger, Niko}, title = {Costimulatory function of CD44}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1186}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains.}, subject = {Antigen CD44}, language = {en} } @phdthesis{Bergfeld2018, author = {Bergfeld, Arne}, title = {Das pH-regulierte Protein 1 (Pra1) von \(Candida\) \(albicans\) moduliert CD4\(^+\) T-Zell-Antworten der Maus in vitro durch direkte Bindung an die T-Zell-Oberfl{\"a}che}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-169716}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Infektionen durch C. albicans auf den Schleimh{\"a}uten sind eine h{\"a}ufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schw{\"a}chung der T-Zellimmunit{\"a}t. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candid{\"a}mie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalit{\"a}t dar. Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfl{\"a}che des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den {\"U}berstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberfl{\"a}chenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann. Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 w{\"a}hrend der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erh{\"o}ht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden. Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkultur{\"u}berst{\"a}nde von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal f{\"u}r gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen. Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine {\"u}ber die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals {\"u}ber die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit. Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberfl{\"a}chenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsf{\"a}higkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- M{\"a}usen getestet, konnten jedoch als Rezeptor f{\"u}r Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die F{\"a}higkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschr{\"a}nkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen f{\"u}hrt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verst{\"a}rkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivit{\"a}t von Pra1 verst{\"a}rkt. W{\"a}hrend der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 w{\"a}hrend der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Ausl{\"o}sung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die {\"u}ber den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zus{\"a}tzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α.}, subject = {Candida albicans}, language = {de} } @phdthesis{Pletinckx2011, author = {Pletinckx, Katrien}, title = {Dendritic cell maturation and instruction of CD4+ T cell tolerance in vitro}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67375}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Effective T cell immunity was believed to occur by mature DC, whereas tolerogenicity was attributed strictly to immature DC phenotypes. However, intermediate DC maturation stages were identified conditioned by inflammatory mediators like TNF. Furthermore, the T cell tolerance mechanisms are dependent on distinct modes and intensities of co-stimulation. Therefore, in this study it was addressed how distinct DC maturation signatures instruct CD4+ T cell tolerance mechanisms. DC acquire antigens from apoptotic cells for self-peptide-MHC presentation and functionally adapt presumed tolerogenic DC phenotypes. Here, immature murine bone-marrow derived DC representing both inflammatory and conventional DC subsets adapted a maturationresistant DC signature upon apoptotic cell recognition but no additional tolerogenic features. Immature DC instruct CD4+ FoxP3+ regulatory T cells in a TGF-β prone micro-environment or generate anergic CD4+ T cells hampered in the TCR-induced proliferation and IL-2 secretion. Secondary stimulation of such anergic CD4+ T cells by immature DC increased primarily IL-10 production and conferred regulatory function. These IL-10+ regulatory T cells expressed high levels of CTLA-4, which is potently induced by immature DC in particular. Data in this work showed that anergic T cells can be re-programmed to become IL-10+ regulatory T cells upon ligation of CTLA-4 and CD28 signalling cascades by B7 costimulatory ligands on immature DC. In contrast, semi-mature DC phenotypes conditioned by the inflammatory mediator TNF prevented autoimmune disorders by induction of IL-10+ Th2 responses as demonstrated previously. Here, it was shown that TNF as an endogenous maturation stimulus and pathogenic Trypanosoma brucei variant-specific surface glycoproteins (VSG) induced highly similar DC gene expression signatures which instructed default effector Th2 responses. Repetitive administration of the differentially conditioned semi-mature DC effectively skewed T cell immunity to IL-10+ Th2 cells, mediating immune deviation and suppression. Collectively, the data presented in this work provide novel insights how immature and partially mature DC phenotypes generate T cell tolerance mechanisms in vitro, which has important implications for the design of effective DC-targeted vaccines. Unravelling the DC maturation signatures is central to the long-standing quest to break tolerance mimicked by malignant tumours or re-establish immune homeostasis in allergic or autoimmune disorders.}, subject = {Dendritische Zelle}, language = {en} } @phdthesis{Holzer2023, author = {Holzer, Marie-Therese}, title = {Der Einfluss von Th17-stimulierenden, Interleukin-17 und Interleukin-17-inhibierenden Faktoren auf in vitro Funktion und Ph{\"a}notyp regulatorischer T-Zellen bei gesunden Probanden und Patienten mit Juveniler Idiopathischer Arthritis}, doi = {10.25972/OPUS-31994}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-319940}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {In der nicht vollst{\"a}ndig gekl{\"a}rten Pathogenese der juvenilen idiopathischen Arthritis (JIA) spielen insbesondere Effektor-T-Zellen und regulatorische T-Zellen (Tregs), sowie das Kontinuum ihrer plastischen Zelltypen eine wichtige Rolle. Im arthritischen Milieu, das auch Interleukin-17 (IL-17) beinhaltet, verschiebt sich das Gleichgewicht dieser Zellen hin zur Inflammation. Ziel dieser Arbeit war es, die T-Zellbalance im peripheren Blut von JIA-Patienten mit gesunden Kontrollen (HC) zu vergleichen, sowie den Einfluss von IL-17, anti-IL-17 und eines Th17-stimulierenden, proinflammatorischen Zytokinmilieus auf Ph{\"a}notyp und Funktion der Tregs zu untersuchen. Es erfolgte die durchflusszytometrische Analyse des Lymphozytenpools von 16 JIA- und 10 HC-Probanden. Isolierte CD25+CD127-CD4+ Tregs wurden mit den genannten Stimuli kultiviert und danach durchflusszytometrisch ph{\"a}notypisch sowie in Co-Kultur mit peripheren mononukle{\"a}ren Zellen (PBMCs) auf ihre Suppressionsfunktion untersucht. Wir stellten erh{\"o}hte Proportionen von Th17-Zellen, Tregs und effector-like Tregs in JIA-Patienten fest. Bei Stimulation mit dem Th17-Cocktail zeigte sich eine verminderte Suppression der Effektor-Zellen durch Tregs bei zeitgleich vermehrter FoxP3-Expression insbesondere in JIA-Tregs. Secukinumab bewirkte eine Anpassung der FoxP3-Expression der Tregs in der Patientengruppe auf etwa das Niveau der gesunden Kontrollen. Insgesamt best{\"a}tigt diese Arbeit eine proinflammatorische Dysbalance bei JIA-Patienten mit Shift zu Th17-like Tregs als m{\"o}glicherweise pathologischen Ph{\"a}notyp. Ursache f{\"u}r die verminderte Suppression ist vermutlich eine gesteigerte Resistenz der Effektor-Zellen durch das Inflammationsmilieu. Die vermehrte FoxP3-Expression der JIA-Tregs ist am ehesten durch eine gesteigerte Zellaktivierung zu erkl{\"a}ren. Diese erh{\"o}hte Sensitivit{\"a}t der Tregs f{\"u}r inflammatorische Stimuli mit vermehrter Aktivierung ist ein m{\"o}glicher Ansatzpunkt f{\"u}r zuk{\"u}nftige Therapien. Die Adjustierung der FoxP3-Expression unter Secukinumab in der JIA-Gruppe auf Niveau der Kontrollen bildet daher einen denkbaren zus{\"a}tzlichen therapeutischen Effekt der IL-17A Blockade durch potenzielle intrinsische Stabilisierung des Ph{\"a}notyps der Tregs bei der JIA ab.}, subject = {Regulatorischer T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{RombachgebGrosso2024, author = {Rombach [geb. Grosso], Franziska}, title = {Der Interaktionsrezeptor des Masernvirus auf h{\"a}matopoetischen Zellen}, doi = {10.25972/OPUS-35339}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-353394}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2024}, abstract = {Das Masernvirus (MV) kann in Erkrankten eine schwere, langanhaltende Immunsuppression verursachen, wodurch Infektionen mit opportunistischen Pathogenen beg{\"u}nstigt werden. Diese basiert auf einer Paralyse der h{\"a}matopoetischen Zellen, welche das Virus durch Kontakt eines viralen Glykoproteinkomplexes zu einem unbekannten RezeptorX auf der Zell- Oberfl{\"a}che induzieren kann. Kerncharakterisitika hiervon sind unter anderem die Herabregulation der Akt-Kinase-Phosphorylierung, die Inhibition der zellul{\"a}ren Proliferation und die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase 2 (NSM2). In einem kinetischen Phosphoproteom konnten zwei potentielle Interaktionsrezeptoren des MV identifiziert werden: CD43 und P2X3. Das hochglykosylierte Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}l CD43 ist auf h{\"a}matopoetischen Zellen ubiquit{\"a}r exprimiert und reguliert in T-Zellen deren {\"U}berleben, Proliferation, Aktivierung, Migration und Adh{\"a}sion. P2X3 wird in h{\"a}matopoetischen Zellen nur in geringem Maße exprimiert. Seine funktionelle Bedeutung ist in diesem Kompartiment nicht bekannt. Beide Kandidaten wurden mittels CRISPR/Cas9 Verfahren einzeln oder kombiniert aus Jurkat-T-Zellen ablatiert, welche nachfolgend nach MV-Kontakt hinsichtlich der oben erw{\"a}hnten MV-modulierten Parameter getestet wurden. Zus{\"a}tzlich wurden iso- und allosterische P2X3-Inhibitoren an prim{\"a}ren und Jurkat-T-Zellen verwendet, um dessen Rolle in Ca2+-Mobilisierung und Proliferation nach T-Zell-Rezeptor Co-Stimulation zu analysieren. Die genetische Depletion beider Rezeptor-Kandidaten verringerte die Effekte des MV auf alle getesteten Parameter signifikant, was darauf hindeutet, dass beide Proteine entscheidend an der T-Zell-Suppression beteiligt sind. W{\"a}hrend die isosterische Inhibition von P2X3 keinen Effekt hatte, wurde die Proliferation prim{\"a}rer T-Zellen durch dessen allosterische Inhibition vor Co-Stimulation fast verdoppelt und die Effizienz der Ca2+-Mobilisierung in Jurkat- und prim{\"a}ren T-Zellen signifikant erh{\"o}ht. In P2X3-depletierten Jurkat-Zellen hingegen war die Ca2+-Mobilisierung nach Stimulation signifikant geringer als in WT-Zellen. In dieser Arbeit konnten zwei wichtige Mediatoren der MV induzierten T-Zell-Suppression identifiziert werden. Vor allem P2X3, dessen Expression, Regulation und funktionelle Bedeutung im h{\"a}matopoetischen Kompartiment noch nicht erforscht wurde, k{\"o}nnte ein vielversprechender Kandidat f{\"u}r eine antivirale Therapie darstellen, da ein klinisch getesteter P2X3-Inhibitor bereits verf{\"u}gbar ist.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Gassert2011, author = {Gassert, Evelyn}, title = {Die Bedeutung von Ceramiden f{\"u}r die Reorganisation des Zytoskeletts in T-Zellen, die Ausbildung einer immunologischen Synapse und die T-Zell-Aktivierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65123}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Ceramide sind biologisch aktive Sphingolipide, die verschiedene zellul{\"a}re Signalwege regulieren, meist im Zusammenhang mit der Induktion von Apoptose oder der Regulation des Zellzyklus. Dar{\"u}ber hinaus wurde in der Literatur beschrieben, dass Ceramide die Zytoskelettdynamik unterschiedlicher Zelltypen beeinflussen, die Bedeutung von Ceramiden f{\"u}r die Funktion von T-Zellen wurde allerdings bisher wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die exogene Akkumulation von Ceramiden ebenso wie die Generierung von Ceramiden durch bSMase die Adh{\"a}renz von T-Zellen an FN bzw. ICAM-1 beeintr{\"a}chtigt. Des Weiteren konnte eine verminderte T-Zell-Polarisierung auf FN sowie eine reduzierte Chemotaxis und Motilit{\"a}t ceramidmodifizierter T-Zellen in Antwort auf SDF-1 nachgewiesen werden. In {\"U}bereinstimmung mit der Unf{\"a}higkeit ceramidmodifizierter Zellen morphologisch zu polarisieren wird ferner die Relokalisation von Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}len und intrazellul{\"a}rer Proteine durch die Akkumulation von Ceramiden gest{\"o}rt. {\"U}berdies konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide mit dem Aktivierungsstatus von Akt und ERM-Proteinen interferieren, da eine verminderte stimulationsabh{\"a}ngige Phosphorylierung von Akt und ERM-Proteinen in ceramidmodifizierten Zellen nachgewiesen wurde. Ein wesentlicher Schritt im Verlauf der T-Zell-Aktivierung ist die Ausbildung einer immunologischen Synapse mit dendritischen Zellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass, obwohl ceramidreiche Membrandom{\"a}nen von der Kontaktstelle ausgeschlossen werden, Konjugatfrequenz und Architektur der IS durch die Induktion von Ceramiden nicht beeinflusst werden, da eine normale Verteilung von CD3 und des MTOC beobachtet wurde. Allerdings wird die Funktionalit{\"a}t der Konjugate durch die Induktion von Ceramiden beeintr{\"a}chtigt. Ceramidmodifizierte Zellen waren nur eingeschr{\"a}nkt in der Lage Orai1 und Stim1 zur Kontaktfl{\"a}che mit DCs zu translozieren. In {\"U}bereinstimmung mit diesen Befunden wurde auch ein verminderter Calcium-Einstrom sowie eine verminderte Proliferation infolge der Akkumulation von Ceramiden detektiert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide wesentliche Prozesse im Verlauf der T-Zell-Aktivierung beeinflussen, so dass die pathogeninduzierte Generierung von Ceramiden einen m{\"o}glichen Mechanismus darstellt, die Funktion von T-Zellen zu beeintr{\"a}chtigen.}, subject = {Ceramide}, language = {de} } @phdthesis{SchulzeLuehrmann2002, author = {Schulze-L{\"u}hrmann, Jan}, title = {Die H{\"a}matopoetische Progenitor Kinase (HPK) 1 und NFAT-Transkriptionsfaktoren unterst{\"u}tzen die Apoptose von T-Lymphozyten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3074}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Die Expression der H{\"a}matopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre" Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des h{\"a}matopoetischen Systems beschr{\"a}nkt. Die HPK1 wurde urspr{\"u}nglich als ein Aktivator des JNK-Signal{\"u}bertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und k{\"u}rzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. F{\"u}r die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine m{\"o}gliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signal{\"u}bertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signal{\"u}bertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die F{\"o}rderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Hom{\"o}ostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale {\"U}berexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) f{\"u}hrte. Die Expression einer HPK1-„antisense" (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgepr{\"a}gt, in denen die {\"U}berexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verst{\"a}rkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen f{\"u}hrt die HPK1-Expression zu einer verst{\"a}rkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die {\"U}berexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen f{\"u}hrte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In {\"U}bereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivit{\"a}t durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse f{\"u}hrten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: w{\"a}hrend der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signal{\"u}bertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es sp{\"a}ter zur Inhibierung der NFkB-Aktivit{\"a}t und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den {\"U}berlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verst{\"a}ndnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukle{\"a}ren Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) geh{\"o}ren zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminos{\"a}uren (aa) große DNA-Bindedom{\"a}ne und eine Calcineurin-Bindedom{\"a}ne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. {\"u}ber die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h f{\"u}hrt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der l{\"a}ngeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion prim{\"a}rer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst l{\"a}sst. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu {\"u}ben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{Gulde2022, author = {Gulde, Tobias Simon}, title = {Die molekulare Grundlage f{\"u}r die h{\"o}here Sensitivit{\"a}t regulatorischer CD4\(^+\) T-Zellen im Vergleich zu konventionellen CD4\(^+\) T-Zellen gegen{\"u}ber der Stimulation mit CD28 Superagonisten}, doi = {10.25972/OPUS-28396}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-283962}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {In Ratten und M{\"a}usen aktiviert der superagonistische anti-CD28 monoklonale Antik{\"o}rper (CD28SA) vorzugsweise regulatorische T-Zellen. In niedriger Dosierung f{\"u}hrt CD28SA zu einer fast ausschließlichen Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Diese Beobachtung konnte inzwischen auch f{\"u}r menschliche Zellen in Zellkultur best{\"a}tigt werden. In gesunden und freiwilligen Testpersonen deutet die Zytokin-Antwort nach Applikationen von niedrigen CD28SA-Dosen darauf hin, dass sich diese Beobachtung auch in-vivo bewahrheitet. Eine Gabe von CD28SA in niedriger Dosierung, die zu einer exklusiven Aktivierung von regulatorischen T-Zellen f{\"u}hrt, k{\"o}nnte somit in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten oder von entz{\"u}ndlichen Erkrankungen eingesetzt werden. Eine mechanistische Erkl{\"a}rung f{\"u}r dieses Ph{\"a}nomen blieb lange Zeit unklar. Die CD28SA-vermittelte T-Zell-Aktivierung ist abh{\"a}ngig von der Verst{\"a}rkung von basalen tonischen Signalen, die T-Zellen {\"u}ber ihren T-Zell-Rezeptor erhalten. Diese Tatsache f{\"u}hrte zu der Hypothese, dass die schwachen, tonischen Signale, die konventionelle CD4+ T-Zellen in Abwesenheit ihrer spezifischen Antigene {\"u}ber den T-Zell-Rezeptor erhalten, ein st{\"a}rkeres CD28 Signal f{\"u}r ihre Aktivierung ben{\"o}tigen als die selbstreaktiven regulatorischen T-Zellen, die ein st{\"a}rkeres Selbstpeptid-TCR Signal erhalten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Blockade von MHC-Klasse-II-Molek{\"u}len in M{\"a}usen, in-vitro und in-vivo, den Vorteil der regulatorischen T-Zellen gegen{\"u}ber den konventionellen T-Zellen bez{\"u}glich der Antwort auf niedrige CD28SA Dosierungen, aufhebt.}, subject = {Regulatorischer T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{Camara2014, author = {Camara, Monika}, title = {Die Rolle der CD8+ T Zellen in der Pathogenese der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis in der Lewis Ratte}, publisher = {Journal of Neuroimmunology (2013)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-98497}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Multiple Sclerosis (MS) and its corresponding animal model Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) are autoimmune diseases of the central nervous system (CNS). Besides CD4+ T cells specific for myelin-derived antigens CD8+ T cells additionally contribute to the pathogenesis of that disease. However, the role of CD8+ T cells during the induction phase of the disease outside the CNS has not been clarified so far. Thus the contribution of CD8+ T cells to the immunopathogenesis of EAE in the Lewis rat was investigated in this work. For that purpose active EAE was induced in normal Lewis rats and animals that were deficient for CD8+ T cells due to the application of CD8-specific monoclonal antibodies. The CD8-depleted animals showed diminished disease activity in comparison to control rats. Equally, CD8-knockout rats, characterized by the absence of functional CD8+ T cells, developed clearly reduced symptoms of the disease in comparison to wild type littermates. Reduced disease activity of the CD8-deficient animals was accompanied by reduced infiltration of T cells and macrophages into the CNS. In the draining lymph nodes activated gpMBP-specific CD4+ T cells could be detected in the absence of CD8+ T cells, but they produced less amounts of proinflammatory cytokines like interferon-gamma than CD4+ T cells of normal rats. Obviously in the active EAE, myelin-specific CD4+ T cells are not able to differentiate completely into effector cells and invade the CNS upon absence of CD8+ T cells. In contrast fully differentiated encephalitogenic CD4+ effector cells equally potently induced EAE upon transfer into either normal or CD8-deficient rats. Hence, the pathogenic potential of completely differentiated CD4+ effector cells does not depend on the presence of CD8+ T cells. With the help of a rat-IFN-gamma ELISpot interferon-gamma-producing gpMBP-specific CD8+ T cells were detected in animals immunized with gpMBP. To directly detect gpMBP-specific CD8+ T cells, RT1.Al-Ig dimeres were generated and loaded with different gpMBP-derived peptides. Indeed, CD8+ T cells specifically recognizing RT1.Al-Ig dimeres loaded with gpMBP125-133 could be detected in the draining lymph nodes of rats, immunized with gpMBP in CFA. The results of this work allow the conclusion that in the EAE of the Lewis rat interferon--producing CD8+ T cells interact with myelin-specific CD4+ T cells, thus licensing these cells to differentiate into CNS invading effector cells.}, subject = {Multiple Sklerose}, language = {de} } @phdthesis{Schwab2012, author = {Schwab, Steffen}, title = {Die Rolle regulatorischer T-Zellen bei der Masernviruspathogenese}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72979}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Tregs dienen zur Aufrechterhaltung der Balance im Immunsystem. Die Infektion, Aktivierung oder Induktion von Tregs durch Pathogene kann diese Balance empfindlich st{\"o}ren, eine Immunsuppression zur Folge haben und zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen oder Persistenzen beitragen. Das MV verf{\"u}gt nicht nur {\"u}ber vielf{\"a}ltige Mechanismen der Immunsuppression, w{\"a}hrend einer MV-Infektion herrschen zudem Bedingungen vor, welche die Zahl und Aktivit{\"a}t von Tregs beeinflussen k{\"o}nnten. Aufgrund der Expression von Reifungsmarkern auf Trn ist zudem eine pr{\"a}ferenzielle Infektion dieser Zellpopulation denkbar. MV-Infektionen k{\"o}nnen sowohl die akute MV-Enzephalitis, eine Autoimmunerkrankung, nach sich ziehen, als auch die Persistenz SSPE ausbilden. Ob diese Komplikationen mit spezifischen Aberrationen in der Menge und Aktivit{\"a}t von Tregs im Zusammenhang stehen, war bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auf unstimulierten Trn der Reifungsmarker und MV-Rezeptor CD150 exprimiert wird und es in Folge dessen in vitro zu einer pr{\"a}ferentiellen nicht produktiven Infektion und Depletion von Trn kommt. Ex vivo ließ sich ein deutlicher Depletionseffekt w{\"a}hrend der fr{\"u}hen akuten MV-Enzephalitis nachweisen, der nach Vaczinierung eines gesunden Probanden und Challenge eines immunisierten Affen nicht auftrat. Ob dieser Depletionseffekt urs{\"a}chlich f{\"u}r die Enzephalitis ist, oder es sich um einen Begleiteffekt handelt ließe sich an Modellorganismen durch mitogene Manipulation der Trn w{\"a}hrend einer MV-Infektion untersuchen. Auch bei SSPE kann es zu einer Depletion von Trn kommen, dies scheint jedoch nicht mit der Progression dieser Erkrankung im Zusammenhang zu stehen. Wahrscheinlich ist dagegen ein Zusammenhang mit der Induktion von Tregs. In MV-stimulierten Proben von SSPE-Patienten wurde im Mittel signifikant mehr IL-10 exprimiert als in den Kontrollen. In Proben seropositiver gesunder Spender wurde IL-10 in den ersten Stunden nach MV-Stimulation fast ausschließlich von induzierten Tregs exprimiert. Weitere Versuche sind n{\"o}tig, um die Evidenz zu steigern und zu ermitteln, ob auch in Patientenproben die fr{\"u}he IL-10 Expression nach MV-Stimulation von induzierten Tregs dominiert wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es sowohl bei der MV-Enzephalitis als auch bei SSPE zu signifikanten Wechselwirkungen mit Tregs kommt. Ob sich eine MV-Enzephalitis auch ohne Depletion von Trn ausbilden kann und ob die Ausbildung von SSPE erh{\"o}hte IL-10 Expression voraussetzt, werden weitere Untersuchungen ergr{\"u}nden m{\"u}ssen.}, subject = {Masern}, language = {de} } @phdthesis{Richarts2011, author = {Richarts, Maria Luise}, title = {Die Rolle T regulatorischer Zellen in der Pathogenese der Pr{\"a}eklampsie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76648}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Pr{\"a}eklampsie ist einer der Hauptgr{\"u}nde f{\"u}r maternale und fetale Mortalit{\"a}t und Morbidit{\"a}t. Obwohl die Aetiologie weitgehend unklar ist, wird angenommen, dass eine mangelnde Toleranz von Seiten des m{\"u}tterlichen Organismus gegen{\"u}ber dem Fetus und dadurch dessen sukzessive Abstossung urs{\"a}chlich sein k{\"o}nnte. T regulatorischen Zellen wurde in der Vergangenheit eine m{\"o}gliche Rolle in der Aufrechterhaltung einer gesunden Schwangerschaft mit erfolgreicher Integration des Fetus, eines durch die paternalen Antigene charakterisierten semi-haploiden Allografts, zugesprochen. In dieser Arbeit wurden T regulatorische Zellen am Ende des dritten Trimesters im peripheren Blut nicht-Schwangerer, gesunder Schwangerer sowie Schwangerer mit Pr{\"a}eklampsie untersucht. Zus{\"a}tzlich wurden T-regulatorische Zellen in decidualem Gewebe bestimmt. Aufgrund der verschiedenen Ergebnisse vorangegangener Studien und der Uneinigkeit {\"u}ber die Identifizierung T regulatorischer Zellen wurden T regulatorische Zellen in dieser Arbeit mittels der drei g{\"a}ngigsten Markerkombinationen (foxp3+, CD4+CD25hi sowie CD4+CD127loCD25+) charakterisiert. Im peripheren Blut gesunder Schwangerer gab es signifikant mehr T regulatorische Zellen als im peripheren Blut nicht-Schwangerer gemessen mit den Markerkombinationen CD4+CD25hi sowie CD4+CD127loCD25+. In Schwangerschaften mit Pr{\"a}eklampsie zeigten sich eine verminderte Frequenz von T regulatorischer Zellen verglichen mit gesunden Schwangerschaften f{\"u}r die Markerkombinationen foxp3+ und CD4+CD127loCD25+. Auf lokaler Ebene, der Decidua, wurde bei gesunden Schwangerschaften sowie Schwangerschaften mit Pr{\"a}eklampsie eine erh{\"o}hte Frequenz gegen{\"u}ber dem peripheren Blut gemessen. T-regulatorische Zellen scheinen also eine Rolle in der Aufrechterhaltung gesunder Schwangerschaften zu spielen, w{\"a}hrend sie in Schwangerschaften mit Pr{\"a}eklampsie vermindert sind.}, subject = {Praeklampsie}, language = {de} } @phdthesis{Knochenhauer2023, author = {Knochenhauer, Tim}, title = {Die Rolle von HIF-1α in T-Zellen bei kardiovaskul{\"a}ren Erkrankungen}, doi = {10.25972/OPUS-32275}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-322758}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Die Atherosklerose ist als Ursache kardiovaskul{\"a}rer Erkrankungen, welche die h{\"a}ufigste Todesursache weltweit darstellen, von großer klinischer und wissenschaftlicher Relevanz. Atherosklerose ist charakterisiert durch Einlagerungen von Lipiden in die Gef{\"a}ßwand, welche zur Ausbildung von Plaques f{\"u}hren. Als Folge wird eine chronische Entz{\"u}ndungsreaktion eingeleitet, die durch spezifische Immunzellen, unter anderem T-Lymphozyten, und komplexe molekulare Prozesse aufrechterhalten wird. Durch eine verminderte Sauerstoffdiffusionskapazit{\"a}t und eine hohe Zelldichte ist das Milieu in den Plaques hypoxisch. Zur zellul{\"a}ren Anpassung an ein solches hypoxisches Milieu werden Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIF) in den Immunzellen stabilisiert. Der Transkriptionsfaktor HIF-1 ist ein heterodimeres Protein, welches die Transkription bestimmter Zielgene initiiert, die den Zellen notwendige Adaptationen des Zellstoffwechsels an ein vermindertes Sauerstoffangebot erm{\"o}glichen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin zu untersuchen, inwiefern sich ein Ausschalten des Transkriptionsfaktor HIF-1α selektiv in T-Lymphozyten auf Atherosklerose und Myokardinfarkt auswirkt. Die funktionelle Bedeutung von HIF-1α in T-Zellen in der Pathogenese dieser Erkrankungen wurde an zwei Mausmodellen untersucht. Im Atherosklerose Modell wurde Biomaterial von LDLR-/- M{\"a}usen mit T-Zell spezifischem Knockout von HIF-1α nach achtw{\"o}chiger fettreicher Western-Typ Di{\"a}t untersucht. Histologisch zeigte sich eine vermehrte Plaqueauspr{\"a}gung und ein verminderter Makrophagenanteil in den Plaques. Durchflusszytometrisch und mittels qPCR konnten keine Unterschiede in der Lymphozytendifferenzierung in Milz und Lymphknoten dieser M{\"a}use nachgewiesen werden. Im Myokardinfarkt-Modell mit T-Zell spezifischem HIF-1α Knockout konnte in fr{\"u}heren Untersuchungen der Arbeitsgruppe eine vergr{\"o}ßerte Infarktzone mit eingeschr{\"a}nkter kardialer Funktion nachgewiesen werden. Histologisch konnte im Rahmen dieser Arbeit hierf{\"u}r kein zellmorphologisches Korrelat in Kardiomyozytengr{\"o}ße oder der Vaskularisation des Myokards gefunden werden. In Zukunft k{\"o}nnte HIF-1α in T-Lymphozyten ein m{\"o}glicher Angriffspunkt zur medikament{\"o}sen Pr{\"a}vention oder Therapie kardiovaskul{\"a}rer Erkrankungen sein.}, subject = {Hypoxie-induzierbarer Faktor}, language = {de} } @phdthesis{Mathes2014, author = {Mathes, Denise Sandra}, title = {Die Rolle von T-Lymphozyten im myokardialen Reperfusionsschaden}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-110802}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Der Myokardinfarkt (MI) geh{\"o}rt nach wie vor zu den f{\"u}hrenden Todesursachen weltweit. Eine Minimierung der Infarktgr{\"o}ße, die durch die Dauer der Isch{\"a}mie bestimmt wird, ist wesentlich f{\"u}r das {\"U}berleben und die Lebensqualit{\"a}t des Myokardinfarkt-Patienten. Die Reperfusion stellt aktuell eine zentrale klinische Intervention dar, um den myokardialen Schaden einzugrenzen. Dennoch f{\"u}hrt die Reperfusion per se zu zus{\"a}tzlichem Schaden am Herzen. Somit ist die Erforschung neuer Strategien zur Minimierung des myokardialen Reperfusionsschadens international von Interesse. Die Pathophysiologie des myokardialen Reperfusionsschadens ist vielschichtig und einige Komponenten sind auch heute in ihrer Wirkweise noch nicht vollst{\"a}ndig mechanistisch verstanden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von CD4+ T-Zellen und insbesondere deren Subpopulation der regulatorischen T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden und stellt neue, auf T-Zellen abzielende, Therapien in Erg{\"a}nzung zur myokardialen Reperfusion vor. Zun{\"a}chst wurde eine Infiltration von T-Zellen in das Myokard nach Isch{\"a}mie-Reperfusion (I/ R) untersucht. Nach der Isch{\"a}mie-Reperfusion wurden infiltrierende CD4+ T-Zellen als quantitativ f{\"u}hrend und aktiviert identifiziert und erwiesen sich in der Infarktgr{\"o}ßenbestimmung als relevante Mediatoren des Reperfusionsschadens. CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Treg) stellen eine Subpopulation von CD4+ T-Zellen mit immunsuppressiven Eigenschaften dar, die schnell und niederschwellig aktiviert werden k{\"o}nnen und kommen somit als zum Reperfusionsschaden beitragend in Frage. Mit Hilfe des DEREG (DEpletion of REGulatory T cells) -Mausmodells wurde gezeigt, dass regulatorische T-Zellen zum myokardialen Reperfusionsschaden beitragen; Treg-depletierte DEREG-M{\"a}use waren vor dem Reperfusionsschaden gesch{\"u}tzt und zeigten kleinere Infarktgr{\"o}ßen als die Kontrolltiere. Zudem wurde mittels Transferexperimenten gezeigt, dass f{\"u}r den Treg-vermittelten Reperfusionsschaden die Anwesenheit von CD25- konventionellen T-Zellen (Tconv) erforderlich ist. Regulatorische T-Zellen stellen also einen in der vorliegenden Arbeit identifizierten potentiellen Angriffspunkt zur Reduktion des myokardialen Reperfusionsschadens dar. Anhand von T-Zell-Rezeptor transgenen OT-II M{\"a}usen und MHC (Major Histocompatibility Complex) Klasse II Knockout (KO) Tieren wurde gezeigt, dass Autoantigenerkennung im myokardialen Reperfusionsschaden eine Rolle spielt. Zur vollen T-Zell-Aktivierung notwendig ist neben dem MHC Klasse II-Signalweg und Kostimulatoren auch das Molek{\"u}le CD154 (CD40L). Die Gabe eines inhibitorischen anti-CD154-Antik{\"o}rpers reduzierte die Infarktgr{\"o}ße in Wildtyp-Tieren sigifikant. Der myokardiale Reperfusionsschaden kann neben Zellen der adaptiven Immunit{\"a}t auch durch Neutrophile Granulozyten, Pl{\"a}ttchen oder Inflammation des Endothels verst{\"a}rkt werden. Knockout M{\"a}use mit einer Defizienz an CD4+ T-Zellen verf{\"u}gten {\"u}ber eine verbesserte Mikroperfusion. Mechanistisch war nach 24h Reperfusion die absolute Zellzahl an Neutrophilen Granulozyten im CD4 KO im Vergleich zu Wildtyp-M{\"a}usen unver{\"a}ndert; in Endothelzellen war die Regulation bestimmter Gene (VEGFα, TIMP-1 und Eng) nach I/ R im CD4 KO jedoch ver{\"a}ndert. Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit eine zentrale Rolle der Antigen-Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden. In Anwesenheit von CD4+Foxp3+ T-Zellen ist der Reperfusionsschaden erh{\"o}ht. Somit k{\"o}nnen CD4+Foxp3+ T-Zellen potentiell als Ziel f{\"u}r neuartige Therapien des Myokardinfarkts genutzt werden.}, subject = {Reperfusion}, language = {de} } @phdthesis{Paletta2015, author = {Paletta, Daniel Sylvester}, title = {Die Variabilit{\"a}t des Ratten iNKT TCR}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-114521}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Typ 1 NKT Zellen oder iNKT Zellen (invariante Nat{\"u}rliche Killer T Zellen) stellen eine Subpopulation der abT Zellen dar, die sich durch mehrere charakteristische Eigenschaften aus- zeichnet. Ihr Hauptmerkmal ist die Expression eines semi-invarianten T Zellrezeptors (TCR), der die Bindung von CD1d:Glycolipid Komplexen erm{\"o}glicht, wohingegen ‚klassische' T Zellen an Komplexe aus MHC (Haupthistokompatibilit{\"a}tskomplex) Molek{\"u}len und Peptiden binden. Die w{\"a}hrend der Reifung im Thymus durch Transkriptionsfaktoren festgelegte Voraktivierung der iNKT Zellen erm{\"o}glicht das unmittelbare Freisetzen von Cytokinen bei Antigenkontakt, wodurch iNKT Zellen die adaptive Immunantwort stark beeinflussen k{\"o}nnen: Sie tragen sowohl zur Regulation von Autoimmunerkrankungen als auch der Bek{\"a}mpfung von Krebs und Infektionen bei. Der iNKT TCR setzt sich aus einer invarianten a-Kette (AV14/AJ18 in der Maus bzw. AV24/AJ18 im Menschen) und einer charakteristischen Auswahl an b-Ketten (vorwiegend BV8S2, BV7 und BV2 in der Maus und BV11 im Menschen) zusammen. Das Cerebrosid a-Galactosylceramid (aGC, KRN7000) stellt eines der potentesten Antigene f{\"u}r iNKT Zellen dar. Die Pr{\"a}sentation dieser Antigenklasse erfolgt durch CD1d Molek{\"u}le, die, abgesehen von tiefen hydrophoben Bindungstaschen, strukturell MHC I Molek{\"u}len {\"a}hneln, jedoch nicht polymorph sind und außerhalb des MHC Locus codiert sind. Die, zwischen Maus und Mensch hochkon- servierte, Interaktion von iNKT TCR und CD1d:aGC Komplex zeichnet sich bei potenten Antigenen durch die eingeschr{\"a}nkte Nutzung der Antigenspezifit{\"a}t bestimmenden Regionen aus: CDR1a, CDR3a und CDR2b. Die den CDR3b definierende V-D-J Umlagerung der b-Kette stellt im iNKT TCR den Bereich der h{\"o}chsten Variabilit{\"a}t dar, beeinflusst jedoch nur die Bindung schw{\"a}cherer Antigene. Nat{\"u}rlich auftretende Variabilit{\"a}t innerhalb der a-Kette kann durch Abweichungen von der kanonischen V-J Umlagerung am Beginn des CDR3a entstehen und beeinflusst ebenfalls die Bindung des iNKT TCR. Die iNKT Zellpopulation in F344 Ratten {\"a}hnelt in Frequenz und Korezepotorexpression derjenigen des Menschen. Ratten besitzen ein CD1D Gen, welches hoch homolog zu denen der Maus ist und zwei dem BV8S2 Gensegment der Maus homologe BV Segmente (BV8S2 und BV8S4), die in F344 Ratten beide funktionell sind. Eine Besonderheit der Ratte ist jedoch das Auftreten einer AV14 Multigenfamilie von bis zu zehn Gensegmenten. Diese unterscheiden sich neben dem HV4 vor allem in ihren CDR2 Sequenzen und werden anhand dieser Unterschiede in zwei Gruppen (Typ 1 und 2) eingeteilt. Zus{\"a}tzlich wurde in der iNKT Zellpopulation eine hohe Frequenz an nat{\"u}rlich auftretenden A93G Substitutionen in der TCR↵ Kette beschrieben und es wurde gezeigt, dass, im Gegensatz zur Kreuzreaktivit{\"a}t zwischen iNKT TCR und CD1d von Maus und Mensch, iNKT Zellen der Ratte nicht an Maus CD1d binden. Die Besonderheiten des Ratten iNKT TCR und deren Auswirkungen auf die TCR Expression und Ligandenbindung der Ratten iNKT Zellpopulation wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht. Durch in dieser Arbeit durchgef{\"u}hrte in vitro Mutagenesestudien konnten Position 68 in der vierten Hypervariablen Schleife (HV4↵) und Position 93 zu Be- ginn des CDR3↵ als entscheidende Modulatoren der CD1d Bindung im iNKT TCR von Ratte und Maus identifiziert werden, wobei auch speziesspezifische Unterschiede aufgedeckt werden konnten. Die Spezieskreuzreaktivit{\"a}t des Ratten iNKT TCR selbst hing stark von einer A93G Substitution im TCRa ab. Bei Untersuchungen der b-Kette zeigte sich, dass sowohl BV Segmente als auch CDR3b Region die Ligandenbindung in differenziellem Zusammenspiel beeinflussen, was bei Paarung mit unterschiedlichen AV14 Segmenten verschieden ausgepr{\"a}gt sein konnte. Weiterhin wurden humane CD1d Dimere generiert und zum ersten Mal die Bindung von Ratten CD1d an humane iNKT TCR gezeigt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit das TCR Repertoire von iNKT Zellen der F344 Ratte und deren CD1d Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurde die bereits etablierte Methode der in vitro Expansion von iNKT Zellen aus der Rattenmilz weiterentwickelt, was die Langzeitkultur und -expansion der sortierten iNKT Zellpopulation erm{\"o}glichte. Bei Untersuchung der TCR Expression konnte gezeigt werden, dass die Auswahl der im Ratten iNKT TCR genutzten BV Gensegmente {\"a}hnlich limitiert ist wie in der Maus. Neben der dominanten Nutzung der BV8S4 und BV8S2 Gensegmente wurden haupts{\"a}chlich BV8S1, BV14 und BV7 gefunden. Bei Untersuchungen der CD1d Dimerbindung der iNKT Zellpopulation konnte der Einfluss der na- t{\"u}rlich auftretenden A93G Substitution in der iNKT TCRa Kette best{\"a}tigt werden. Außerdem zeigte sich hier ebenfalls der Einfluss des BV Gensegments auf die Ligandenbindung, wobei BV8S4 negative Zellen im Vergleich zu BV8S4 positiven Zellen eine st{\"a}rkere Ratten CD1d Dimerbindung zeigten.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{Storim2011, author = {Storim, Julian}, title = {Dynamic mapping of the immunological synapse in T cell homeostasis and activation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70114}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Polarity and migration are essential for T cell activation, homeostasis, recirculation and effector function. To address how T cells coordinate polarization and migration when interacting with dendritic cells (DC) during homeostatic and activating conditions, a low density collagen model was used for confocal live-cell imaging and high-resolution 3D reconstruction of fixed samples. During short-lived (5 to 15 min) and migratory homeostatic interactions, recently activated T cells simultaneously maintained their amoeboid polarization and polarized towards the DC. The resulting fully dynamic and asymmetrical interaction plane comprised all compartments of the migrating T cell: the actin-rich leading edge drove migration but displayed only moderate signaling activity; the mid-zone mediated TCR/MHC induced signals associated with homeostatic proliferation; and the rear uropod mediated predominantly MHC independent signals possibly connected to contact-dependent T cell survival. This "dynamic immunological synapse" with distinct signaling sectors enables moving T cells to serially sample antigen-presenting cells and resident tissue cells and thus to collect information along the way. In contrast to homeostatic contacts, recognition of the cognate antigen led to long-lasting T cell/DC interaction with T cell rounding, disintegration of the uropod, T cell polarization towards the DC, and the formation of a symmetrical contact plane. However, the polarity of the continuously migrating DC remained intact and T cells aggregated within the DC uropod, an interesting cellular compartment potentially involved in T cell activation and regulation of the immune response. Taken together, 3D collagen facilitates high resolution morphological studies of T cell function under realistic, in vivo-like conditions.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} } @phdthesis{Herz2012, author = {Herz, Stefan}, title = {Dynamische Ver{\"a}nderungen der Homing-Rezeptor-Expression humaner T-Zellen im peripheren Blut}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-93907}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Dieses Projekt soll zur Entwicklung eines Bluttests beitragen, um bei allogen stammzelltransplantierten (allo-SZT) Patienten eine drohende akute Graft-versus-Host Disease (aGVHD) vorhersagen und von einer Infektionskomplikation unterscheiden zu k{\"o}nnen. Die aGVHD und opportunistische Infektionen, wie etwa eine Zytomegalievirus- Infektion, stellen die Hauptrisiken der allo-SZT dar. Eine durch einen pr{\"a}diktiven Test verbesserte Vorhersage bzw. Differenzierung dieser beiden schweren omplikationen k{\"o}nnte zu einem breiteren Einsatz der allo-SZT f{\"u}hren. Eine Reihe von Erkenntnissen lassen die Vermutung zu, dass bestimmte Homing- Rezeptoren auf T-Zellen im peripheren Blut als Marker zur Vorhersage und Differenzierung zwischen einer aGVHD und Infektionskomplikationen dienen k{\"o}nnten. So wurde in Mausmodellen gezeigt, dass die Pathogenese der aGVHD ein streng zeitlich regulierter und organspezifischer Immunprozess ist. Alloreaktive T-Zellen m{\"u}ssen bestimmte Homing-Rezeptoren exprimieren, um in die Zielorgane der aGVHD (Gastrointestinaltrakt, Leber und Haut) einwandern zu k{\"o}nnen. Die Immunreaktion auf eine Infektion setzt ebenfalls voraus, dass in der adaptiven Immunantwort T-Zellen organ- und entz{\"u}ndungsspezifische Homing-Rezeptoren exprimieren. Eine zentrale Voraussetzung f{\"u}r einen prospektiven klinischen Test mit allo-SZT Patienten ist die Kenntnis der physiologischen Bandbreite der Oberfl{\"a}chenmarker auf T-Lymphozyten in Gesunden, um diese von pathophysiologischen Ver{\"a}nderungen unterscheiden zu k{\"o}nnen. Ziel dieser Arbeit war es daher, eine effiziente und zuverl{\"a}ssige Methode zu entwickeln, um das Homing-Rezeptor-Profil von humanen T-Zellen im peripheren Blut analysieren zu k{\"o}nnen. Dazu wurde ein urchflusszytometrie-Test mit 25 Oberfl{\"a}chenmarkern etabliert, die eine Rolle in der Pathogenese der aGVHD und bei Infektionen spielen k{\"o}nnten. Mit diesem Test wurde die Expression der Oberfl{\"a}chenmarker von 21 gesunden Probanden an 8 Zeitpunkten {\"u}ber einen Zeitraum von 3 Wochen analysiert. Die untersuchten Oberfl{\"a}chenmarker lassen sich dabei entsprechend ihrer Expressionsmuster in drei Kategorien einteilen, n{\"a}mlich (I) zeitlich stabile niedrige, (II) zeitlich stabile hohe und (III) dynamisch schwankende Expression. Aufbauend auf diesen Ergebnissen f{\"u}r gesunde Probanden wurde am Universit{\"a}tsklinikum W{\"u}rzburg eine prospektive klinische Studie an aGVHD-Patienten begonnen.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{Blank2009, author = {Blank, Gregor}, title = {Einfluss blockierender und stimulierender CD28-spezifischer monoklonaler Antik{\"o}rper auf die Reifung und Hom{\"o}ostase von T-Zellen der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37496}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die Kostimulation {\"u}ber den CD28 Oberfl{\"a}chenrezeptor spielt eine entscheidende Rolle sowohl in der Proliferation von T-Zellen, in deren Differenzierung zu Effektorzellen, als auch in der Entwicklung und Kontrolle von regulatorischen T-Zellen. Diese Schl{\"u}sselrolle macht CD28 zu einer interessanten Zielstruktur, um den Einfluss monoklonaler Antik{\"o}rper auf die Entwicklung und Hom{\"o}ostase von T-Zellen zu analysieren. Die hier verwendeten Antik{\"o}rper lassen sich funktionell in zwei verschiedene Kategorien einteilen: zum Einen in konventionelle Antik{\"o}rper (E18 mAk), welche die physiologische Rezeptor-Liganden Interaktion blockieren, und zum Anderen in superagonistische Antik{\"o}rper (D665 mAk), die in der Lage sind ruhende T-Zellen ohne eine Ligation des T-Zell Rezeptors voll zu aktivieren. In der vorliegenden Arbeit konnte in verschiedenen in-vitro und in-vivo Experimenten gezeigt werden, dass eine Behandlung mit dem CD28 Superagonisten keinen Einfluss auf die Differenzierung von T-Zellen im Thymus nimmt, und die Zusammensetzung der einzelnen Zellpopulationen in diesem Organ unbeeinflusst bleibt. Bei Verwendung blockierender anti-Maus CD28 mAk zeigte sich in s{\"a}mtlichen Untersuchungen eine beeintr{\"a}chtigte Entwicklung von regulatorischen T-Zellen innerhalb des Thymus, w{\"a}hrend die anderen Zellpopulationen unbeeinflusst blieben. Auch in Analysen peripherer Lymphknoten lag der Anteil regulatorischer T-Zellen nach Behandlung mit E18 mAk unter den Kontrollwerten. Durch eine chronische Blockade von CD28 mittels E18 mAk ließ sich die Gesamtanzahl an Tregs in peripheren Lymphknoten, Milz und Thymus drastisch senken, ohne dass es zu einem vollst{\"a}ndigen Verschwinden dieser Zellpopulation kam. Auch die absolute Zahl an CD4 positiven T-Zellen innerhalb der peripheren Lymphknoten, Milz und Thymus der behandelten Tiere lag deutlich unter der Kontrolle. Diese Beobachtungen waren 13 Wochen nach Beendigung der Antik{\"o}rper-Applikationen vollst{\"a}ndig reversibel und zu keinem Zeitpunkt des Experimentes ergaben sich klinische oder serologische Hinweise auf die Entwicklung von Autoimmunit{\"a}t trotz niedriger Treg- Zahlen {\"u}ber mehrere Wochen.}, subject = {Antigen CD28}, language = {de} } @phdthesis{Reuter2012, author = {Reuter, Dajana}, title = {Einfluss der Immunkompetenz auf die Etablierung und den Verlauf persistierender viraler Infektionen des zentralen Nervensystems (im Tiermodell Maus/Masernvirus)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71437}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Zu den gef{\"a}hrlichen Komplikationen der Masern geh{\"o}rt die selten vorkommende ZNS-Erkrankung subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE), die erst mehrere Jahre nach einer akuten Masernvirusinfektion auftritt. Die SSPE verl{\"a}uft immer t{\"o}dlich und bis heute gibt es keine spezifische Therapie gegen diese Erkrankung. Unsere Arbeitsgruppe hat ein Modell f{\"u}r eine persistierende, virale ZNS-Infektion entwickelt, in dem 2-Wochen-alte, immunologisch normale C57BL/6-M{\"a}use mit einem rekombinanten, neurotropen Masernvirus (MV), das das H{\"a}magglutinin eines an Nagern angepassten MV-Stammes enth{\"a}lt, intrazerebral (i.c.) infiziert werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle regulatorischer CD4+ CD25+ Foxp3+ T-Zellen (Treg) in diesem Mausmodell analysiert und untersucht, ob die persistierende ZNS-Infektion durch Manipulation peripherer Treg beeinflusst werden kann. Außerdem wurde ein IFN-y-ELISPOT-Assay etabliert, der CD8+ zytotoxische T-Zellen (CTL) identifiziert, die spezifisch f{\"u}r die MV-H{\"a}magglutinin-Epitope MV-H22-30 (RIVINREHL) bzw. MVH446-454 (SNHNNVYWL) sind. In Bezug auf das erstgenannte Epitop wurde desweiteren eine Pentamer-F{\"a}rbung etabliert, um CTLs mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu identifizieren, die H-2Db-gekoppelte MV-H22-30-Epitope erkennen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass sich trotz eines hohen Anteils Masern-spezifischer CTLs und nur sehr wenigen Treg im Gehirn eine persistierende ZNSInfektion ausbildet. Periphere Treg wurden w{\"a}hrend der persistierenden Phase der ZNS-Infektion expandiert bzw. depletiert und die Konsequenzen f{\"u}r die Virus-spezifische Immunantwort sowie das Ausmaß der persistierenden Infektion wurden analysiert. Die Expansion von Treg mit Hilfe des superagonistischen anti-Maus CD28 Antik{\"o}rpers D665 verursachte eine transiente Immunsuppression, die die Virus-Replikation sowie -Ausbreitung im Gehirn verst{\"a}rkte. Im Gegensatz dazu f{\"u}hrte die Depletion von Treg in DEREG-M{\"a}usen mittels Diphtherietoxin zu einem erh{\"o}hten Anteil Virus-spezifischer CTLs im Gehirn sowie zu einer Reduktion der persistierenden ZNS-Infektion. Diese Daten zeigen, dass Treg die F{\"a}higkeit besitzen, die Persistenz von MV im Gehirn zu kontrollieren und somit m{\"o}glicherweise Teil eines Therapiekonzeptes gegen ZNS-Infektionen mit dem Masernvirus sein k{\"o}nnen. Fr{\"u}here Studien unserer Arbeitsgruppe haben außerdem gezeigt, dass das durch IFN-y induzierbare Enzym Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) antivirale Aktivit{\"a}ten gegen MV aufweist. Dies wurde in dieser Doktorarbeit in vivo in unserem Mausmodell anhand von IDOk.o.-Tieren best{\"a}tigt, die nach i.c. Infektion nicht nur eine erh{\"o}hte Mortalit{\"a}tsrate aufwiesen sondern auch in den {\"u}berlebenden Tieren eine verst{\"a}rkte persistierende ZNS-Infektion zeigten.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Monjezi2018, author = {Monjezi, Razieh}, title = {Engineering of chimeric antigen receptor T cells with enhanced therapeutic index in cancer immunotherapy using non-viral gene transfer and genome editing}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-152521}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {The advances in genetic engineering have enabled us to confer T cells new desired functions or delete their specific undesired endogenous properties for improving their antitumor function. Due to their efficient gene delivery, viral vectors have been successfully used in T-cell engineering to provide gene transfer medicinal products for the treatment of human disease. One example is adoptive cell therapy with T cells that were genetically modified with gamma-retroviral and lentiviral (LV) delivery vectors to express a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) for cancer treatment. This therapeutic approach has shown remarkable results against B-cell malignancies in pilot clinical trials. Consequently, there is a strong desire to make CAR T cell therapy scalable and globally available to patients. However, there are persistent concerns and limitations with the use of viral vectors for CAR T cell generation with regard to safety, cost and scale of vector production. In order to address these concerns, we aimed to improve non-viral gene transfer and genome editing tools as an effective, safe and broadly applicable alternative to viral delivery methods for T-cell engineering. In the first part of the study, we engineered CAR T cells through non-viral Sleeping Beauty (SB) transposition of CAR genes from minimalistic DNA vectors called minicircles rather than conventional SB plasmids. This novel approach dramatically increased stable gene transfer rate and cell viability and resulted in higher yield of CAR+ T cells without the need of long ex vivo expansion to generate therapeutic doses of CAR+ T cells. Importantly, CD19-CAR T cells modified by MC-based SB transposition were equally effective as LV transduced CD19-CAR T cells in vitro and in a murine xenograft model (NSG/Raji-ffLuc), where a single administration of CD8+ and CD4+ CAR T cells led to complete eradication of lymphoma and memory formation of CAR T cells after lymphoma clearance. To characterize the biosafety profile of the CAR T cell products, we did the most comprehensive genomic insertion site analysis performed so far in T cells modified with SB. The data showed a close-to-random integration profile of the SB transposon with a higher number of insertions in genomic safe harbors compared to LV integrants. We developed a droplet digital PCR assay that enables rapid determination of CAR copy numbers for clinical applications. In the second part of the study, we ablated expression of PD-1, a checkpoint and negative regulator of T cell function to improve the therapeutic index of CAR T cells. This was accomplished using non-viral CRISPR/Cas9 via pre-assemble Cas9 protein and in vitro-transcribed sgRNA (Cas9 RNP). Finally, we combined our developed Cas9 RNP tool with CAR transposition from MC vectors into a single-step protocol and successfully generated PD-1 knockout CAR+ T cells. Based on the promising results achieved from antibody-mediated PD-1 blockade in the treatment of hematological and solid tumors, we are confident that PD-1 knockout CAR T cells enhance the potency of CAR T cell therapies for treatment of cancers without the side effects of antibody-based therapies. In conclusion, we provide a novel platform for virus-free genetic engineering of CAR T cells that can be broadly applied in T-cell cancer therapy. The high level of gene transfer rate and efficient genome editing, superior safety profile as well as ease-of-handling and production of non-viral MC vectors and Cas9 RNP position our developed non-viral strategies to become preferred approaches in advanced cellular and gene-therapy.}, subject = {Krebs }, language = {en} } @phdthesis{Akimzhanov2005, author = {Akimzhanov, Askar M.}, title = {Epigenetic repression of the NFATc1 transcription factor in human lymphomas}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12921}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {We examined the regulation of NFATc1 in different lymphomas and observed an inversed correlation between the methylation status and expression of NFATc1. Our data demonstrate that aberrant DNA methylation associated with chromatin remodeling within nfatc1 locus is a major mechanism for the repression of NFATc1 expression, suggesting that the DNA methylation-mediated transcriptional silencing of NFATc1 may be a critical event in the tumorogenesis of ALCLs and cHLs. Furthermore, the DNA methylation of human nfatc1 promoter region could be used as a novel biomarker of tumor progression. Our results indicate a close link between the loss of immunoreceptor signaling and NFATc1 expression in human lymphomas. For both ALCLs and cHLs, defects in immunoreceptor signaling have been described which result in a loss of receptor-mediated gene expression programs (Schwering et al., 2003; Bonzheim et al., 2004; Marafioti et al., 2004). In T cells, one indicator gene of these programs appears to be the nfatc1 gene whose expression is controlled by TCR signals (Chuvpilo et al., 2002a). In contrast, in T cells NFATc1 expression is unaffected by TCR signals, and NFATc2 was found to be expressed at normal levels in ALCLs and cHLs (L.K., unpubl. data). Moreover, the activity of NF-kappaB factors which can bind to certain NFAT binding sites and share a distantly-related DNA binding domain with NFATs is strongly elevated in cHL cells (Bargou et al., 1997; Hinz et al., 2001; Hinz et al., 2002) suggesting that NFATs and NF-kappaBs exert very different effects on generation and maintenance of Hodgkin's lymhomas. However, it should be mentioned that in Burkitt's and further B cell lymphomas in which NFATc1 proteins are strongly expressed and controlled by receptor signals (Kondo et al., 2003), they could exert a promoting function in tumor development. The genes of p53 family members p63 and p73 are prominent examples for mammalian genes whose products can act both as oncoproteins and tumor suppressor genes (Hibi et al., 2000; Stiewe and Putzer, 2002), and it is likely that more genes exist which encode both tumor suppressors and oncoproteins. It remains to be shown whether the nfatc1 gene is one of them.}, subject = {Lymphom}, language = {en} } @phdthesis{Schuh2001, author = {Schuh, Kai}, title = {Erzeugung und Analyse NF-ATp-defizienter M{\"a}use}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-117}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Ziel dieser Arbeit war es, NF-AT1-Gen-defiziente Mauslinien zu erzeugen und die Folgen dieser genetischen Manipulation in vivo zu untersuchen. Die Untersuchung sollte die durch die Gendefizienz erwarteten M{\"a}ngel w{\"a}hrend der Entwicklung (Embryogenese) und, im Besonderen, die Auswirkungen auf das Immunsytem und die Entwicklung und Differenzierung der T-Zellen aufzeigen. Zur Untersuchung der genomischen Organisation des Maus-NF-AT1-Gens wurde eine genomische l-Phagen-DNA-Bibliothek "gescreent" (durchgef{\"u}hrt von Dr. E. Jankevics, Universit{\"a}t von Riga, Lettland), die entsprechenden l-Phagen, die das NF-AT1-Gen enthielten, isoliert und die DNA pr{\"a}pariert. Nach Analyse der klonierten Phagen (Subklonierung und Sequenzierung) wurde eine Restriktionskarte der entsprechenden Bereiche erstellt und der "targeting-vector" erstellt. Der "targeting-vector" wurde durch Elektroporation in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) eingebracht und die Integration in das Genom ("Homologe Rekombination") durch Southern Blotting- bzw. PCR-Analyse untersucht. Manipulierte ES-Zellklone wurden in C57Bl/6-Blastozysten injiziert, diese in scheinschwangere Ammentiere transferiert und die Nachkommen nach Geburt anhand der Fellfarben klassifiziert. Nachkommen mit einem hohen Anteil hellen Fells wurden mit C57 Bl/6-Tieren verpaart und die Integration des manipulierten Zellklons in die Keimbahn wurde anhand der wildtypischen Fellfarbe und Genotypisierung nachgewiesen. Bez{\"u}glich des manipulierten NF-ATp-Gens heterozygote F1-Tiere wurden miteinander verpaart, um eine homozygote NF-ATp-defiziente M{\"a}use zu erhalten. Die Deletion des NF-ATp-Proteins wurde durch in Western-Blotting-Experimenten und EMSAs ("electrophoretic mobility shift assays") nachgewiesen. Die NF-ATp-/--Tiere zeigten keine augenscheinlichen Ver{\"a}nderungen w{\"a}hrend der Entwicklung und, bei jungen Tieren, keine offensichtlichen Ver{\"a}nderungen bei der Entwicklung des Immunsystems. In {\"a}lteren Tieren (> 6 Wochen) war eine Hyperproliferation der Zellen des Immunsystems zu beobachten, was mit einer Splenomegalie, einer verst{\"a}rkten Bildung von Keimzentren in lymphatischen Organen, vergr{\"o}ßerten Lymphknoten und einer verlangsamten Involution des Thymus einherging. Weitergehende Untersuchungen der Ursache dieser hyperproliferativen Erkrankung offenbarten eine verminderte klonale Deletion nach Aktivierung. Die Ursachen dieses {\"u}berraschenden Effekts sind wahrscheinlich vielf{\"a}ltig, da NF-AT-Faktoren an der Regulation der Expression vieler Gene beteiligt sind, u.a. des Apoptose-assoziierten CD95-Liganden. Da sich bez{\"u}glich der IL-2-Expression keine Unterschiede zwischen NF-ATp-defizienten Tieren und Kontrollen zeigten, jedoch eine erh{\"o}hte IL-2-Konzentration im Medium kultivierter NF-ATp-defizienter T-Zellen beobachtet wurde, wurde die Bindung von NF-ATp an putative NF-AT-Bindungssequenzen des CD25-Promotors, die transkriptionelle Aktivierung des Promotors mittels Luciferase-Assays und die Expression der IL-2R-alpha-Kette (CD25) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß (1.) NF-ATp an zwei Regionen des CD25-Promotors bindet, (2.) der CD25-Promotor durch NF-ATp transkriptionell stark stimuliert wird und (3.) T-Zellen NF-ATp-defizienter Tiere nach Stimulation eine verminderte CD25-Expression zeigen. In NF-ATp-defizienten Tieren war die Expression von CD25 moderat reduziert, was eine Erkl{\"a}rung f{\"u}r den abgeschw{\"a}chten Ph{\"a}notyp dieser Tiere - im Vergleich zu IL-2- oder CD25-defizienten Tieren - sein kann. Die hyperproliferativen Erkrankungen dieser verschiedenen Mauslinien weisen auf eine Beteiligung der NF-AT-/IL-2-/IL-2R-Signalwege nicht nur w{\"a}hrend der T-Zell-Aktivierung hin, sondern auch auf eine Beteiligung an Signalwegen, die zur anschließenden Inaktivierung und Apoptose der T-Lymphozyten n{\"o}tig sind.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Karunakaran2014, author = {Karunakaran, Mohindar Murugesh}, title = {Evolution of Vγ9Vδ2 T-cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-99871}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Human Vγ9Vδ2 T cells are the major subset of blood γδ T cells and account for 1-5\% of blood T cells. Pyrophosphorylated metabolites of isoprenoid biosynthesis are recognized by human Vγ9Vδ2 T cells and are called as phosphoantigens (PAg). Isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP) are among the few well studied PAg. IPP is found in all organisms while HMBPP is a precursor of IPP found only in eubacteria, plants and apicomplexaen parasite. Interestingly, the PAg reactive Vγ9Vδ2 T cells are so far identified only in human and higher primates but not in rodents. Hence, Vγ9Vδ2 T cells are believed to be restricted to primates. With regard to PAg recognition, a Vγ9JP recombined TCRγ chain and certain CDR3 motifs of the TCR chain are mandatory. The BTN3A1 molecule is essential for a response to PAg. BTN3 is a trans-membrane protein belonging to butyrophilin family of proteins. Though BTN3A1 was found to be essential for PAg presentation, the exact molecular basis of PAg presentation still remains unclear. This thesis presents new data on the evolution of Vγ9Vδ2 TCR and its ligands (BTN3) as well as the genetic basis of PAg presentation to Vγ9Vδ2 TCR. The comprehensive analysis of genomic database sequences at NCBI and other public domain databases revealed for the first time that Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes emerged and co-evolved along with the placental mammals. Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes are scattered across mammalian species and not restricted to primates. But interestingly, all three genes are highly conserved between phylogenetically distinct species. Moreover, the distribution pattern of Vγ9, Vδ2 TCR genes and BTN3 genes suggests a functional association between these genes representing the TCR - ligand relationship. Alpaca (Vicugna pacos), a member of the camelid family, is one among the 6 candidate non-primate species which were found to possess functional Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes. From peripheral lymphocytes of alpaca, Vγ9 chain transcripts with a characteristic JP rearrangement and transcripts of Vδ2 chains with a CDR3 typical for PAg-reactive TCR were identified. The transduction of αβ TCR negative mouse thymoma BW cells with alpaca Vγ9 and Vδ2 TCR chains resulted in surface expression of the TCR complex as it was deduced from detection of cell surface expression of mouse CD3. Cross-linking of alpaca Vγ9Vδ2 TCR transductants with anti-CD3ε led to IL-2 production which confirmed that alpaca Vγ9 and Vδ2 TCR chains pair to form a functional TCR. Besides the conservation of human like Vγ9 and Vδ2 TCR chains, alpaca has conserved an orthologue for human BTN33A1 as well. Interestingly, the predicted PAg binding sites of human BTN3A1 was 100\% conserved in deduced amino acid sequence of alpaca BTN3A1. All together alpaca is a promising candidate for further studies as it might have preserved Vγ9Vδ2 T cells to function in surveillance of stress and infections. This thesis also provides the sequence of Vγ9Vδ2 TCR of African green monkey (Chlorocebus aethiops), which was previously unknown. Moreover, our data indicates the lack of any species specific barrier which could hinder the PAg presentation by African monkey derived COS cells to human Vγ9Vδ2 TCR and vice versa of human cells to African green monkey Vγ9Vδ2 TCR which was in contradiction to previously reported findings. Apart from the above, the thesis also presents new data on the genetic basis of PAg presentation to Vγ9Vδ2 T cells, which revealed that human chromosome 6 is sufficient for the presentation of exogenous and endogenous PAg. By employing human/mouse somatic hybrids, we identified the role of human chromosome 6 in PAg presentation and in addition, we observed the lack of capacity of human chromosome 6 positive hybrids to activate Vγ9Vδ2 TCR transductants in the presence of the alkylamine sec-butylamine (SBA). Investigation of Chinese hamster ovary (CHO) cells containing the human chromosome 6 also yielded similar results. This suggests that aminobisphosphonates (zoledronate) and alkylamines employ different mechanisms for activation of Vγ9Vδ2 T cells although both have been described to act by inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase activity which is known to increase intracellular levels of the IPP. In conclusion, this thesis suggests that Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes controlling Vγ9Vδ2 TCR- ligand relationship emerged and co-evolved along with placental mammals; and also identified candidate non-primate species which could possess Vγ9Vδ2 T cells. Furthermore, it suggests alpaca as a promising non-primate species to investigate the physiological function of Vγ9Vδ2 T cells. With respect to PAg antigen presentation it was shown that chromosome 6 is essential and sufficient for exogenous and endogenous PAg presentation. Moreover, the alkylamine SBA and aminobisphosphonate zoledronate may engage different cellular mechanism to exert inhibition over IPP consumption. The thesis raises interesting questions which need to be addressed in future: 1) What are the environmental and evolutionary factors involved in preservation of Vγ9Vδ2 T cells only by few species? 2) What could be the functional nature and antigen recognition properties of such a conserved T cell subset? 3) What is the genetic and molecular basis of the differential capacity of human chromosome 6 bearing rodent-human hybridoma cells in activating Vγ9Vδ2 T cells in presence of SBA and aminobisphosphonates?}, subject = {Evolution}, language = {en} } @phdthesis{Uehlein2022, author = {Uehlein, Sabrina}, title = {Expression und Funktion von CD28 im Schwein}, doi = {10.25972/OPUS-24551}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-245512}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {Trotz zahlreicher Fortschritte im Verst{\"a}ndnis der Funktionsweise des kostimulatorischen Rezeptors CD28 in Mensch, Maus, Ratte und Makake ist nach wie vor wenig hier{\"u}ber in Bezug auf das Tiermodell Schwein bekannt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Expression von CD28 in Schweine-T-Zellen sowie die Regulierbarkeit der T-Zellaktivierung durch anti-pCD28 mAb. Die Ergebnisse zeigen, dass hierbei vor allem CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert betrachtet werden m{\"u}ssen. Grunds{\"a}tzlich unterscheiden sich die beiden T-Zellpopulationen in der CD28 mRNA Expression, im Expressionsverh{\"a}ltnis zwischen CD28 mRNA und Protein, sowie im proliferativen Ansprechen auf anti-pCD28mAb. So reagierten CD4+ im Vergleich zu CD8+ T-Zellen auf die kostimulatorische Inkubation mit anti-pCD28 mAb des Klons 3D11 sensibler. In direkt stimulatorischen Ans{\"a}tzen zeigte sich, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche anti-pCD28 mAb differentiell angesprochen werden k{\"o}nnen. Eine superagonistische Funktion konnte f{\"u}r CD4+ T-Zell aktivierende anti-pCD28 mAb in den bisherigen Versuchen noch nicht beobachtet werden. Letzteres ist hierbei vor allem f{\"u}r den Transfer von vielversprechenden Therapiestrategien vom Kleintier- zum Großtiermodell auf dem Weg zur Entwicklung neuer Therapieoptionen f{\"u}r Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit starker proinflammatorischer Aktivit{\"a}t und dem Myokardinfarkt von Bedeutung.}, subject = {Antigen CD28}, language = {de} } @phdthesis{Lin2004, author = {Lin, Chia-Huey}, title = {Functional characterization of rat CTLA-4 and CD25+CD4+ regulatory T cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8521}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Summary: In the present work, two important negative regulators of T cell responses in rats were examined. At the molecular level, rat CTLA-4, a receptor important for deactivating T cell responses, was examined for the expression pattern and in vitro functions. For this purpose, anti-rat CTLA-4 mAbs were generated. Consistent with the studies in mice and humans, rat CTLA-4 was detectable only in CD25+CD4+ regulatory T cells in unstimulated rats, and was upregulated in all activated T cells. Cross-linking rat CTLA-4 led to the deactivation of anti-TCR- and anti-CD28 stimulated (costimulation) T cell responses such as reduction in activation marker expression, proliferation, and cytokine IL-2 production. Although T cells stimulated with the superagonistic anti-CD28 antibody alone without TCR engagement also increased their CTLA-4 expression, a delayed kinetics of CTLA-4 upregulation was found in cells stimulated in this way. The physiological relevance of this finding needs further investigation. At the cellular level, rat CD25+CD4+ regulatory T cells were examined here in detail. Using rat anti-CTLA-4 mAbs, the phenotype of CD25+CD4+ regulatory T cells was investigated. Identical to the mouse and human Treg phenotype, rat CD25+CD4+ T cells constitutively expressed CTLA-4, were predominantly CD45RC low, and expressed high level of CD62L (L-selectin). CD25+CD4+ cells proliferated poorly and were unable to produce IL-2 upon engagement of the TCR and CD28. Furthermore, rat CD25+CD4+ cells produced high amounts of anti-inflammatory cytokine IL-10 upon stimulation. Importantly, freshly isolated CD25+CD4+ T cells from na{\"i}ve rats exhibited suppressor activities in the in vitro suppressor assays. In vitro, CD25+CD4+ regulatory T cells proliferated vigorously upon superagonistic anti-CD28 stimulation and became very potent suppressor cells. In vivo, a single injection of CD28 superagonist into rats induced transient accumulation and activation of CD25+CD4+ regulatory T cells. These findings suggest firstly that efficient expansion of CD25+CD4+ cells without losing their suppressive effects (even enhance their suppressive activities) can be achieved with the superagonistic anti- CD28 antibody in vitro. Secondly, the induction of disproportional expansion of CD25+CD4+ cells by a single injection of superagonistic anti-CD28 antibody in vivo implies that superagonistic anti-CD28 antibody may be a promising candidate in treating autoimmune diseases by causing a transient increase of activated CD25+CD4+ T cells and thus tipping ongoing autoimmune responses toward selftolerance.}, subject = {Ratte}, language = {en} } @phdthesis{Schreiber2009, author = {Schreiber, Peter Werner}, title = {Genexpressionsanalyse zur Histogenese epithelialer Thymustumoren am Beispiel des Autoimmun-Regulators AIRE}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37463}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Eine grundlegende Aufgabe unseres Immunsystems ist der Schutz unseres Organismus durch die Abwehr von Erregern. Im Zentrum jeder Immunantwort liegt die Unterscheidung zwischen dem „Selbst" (der Erkennung k{\"o}rpereigener Antigene) und dem „Nicht-Selbst" (der Erkennung k{\"o}rperfremder Antigene). Ein wichtiger Faktor in der Aufrechterhaltung der zentralen Toleranz ist das AIRE-Protein. In der Thymusmedulla, dem Ort der st{\"a}rksten AIRE-Expression, erfolgt die sog. negative Selektion der heranreifenden autoreaktiven T-Zellen. Es wird angenommen, dass AIRE durch Regulation der Pr{\"a}sentation von Selbst-Antigenen in mTECs und DCs die Thymozyten auf Autoreaktivit{\"a}t kontrolliert und potentielle Ausl{\"o}ser einer Autoimmunkrankheit eliminiert. Thymome sind epitheliale Tumoren des Thymus, die h{\"a}ufig mit Autoimmunph{\"a}nomenen, insbesondere paraneoplastischer Myasthenia gravis, einhergehen. Da bei Thymomen meist ein vollst{\"a}ndiger Verlust von AIRE sowohl auf Transkriptions- als auch Proteinebene vorliegt, lag es nahe, einen Zusammenhang mit dem Auftreten Thymom-assoziierter Autoimmunerkrankungen zu vermuten. Thymome wurden initial in einer histogenetischen Klassifikation aufgrund morphologischer Kriterien in „medull{\"a}re" und „corticale" Typen unterteilt. Dieses Konzept sollte in der vorgelegten Arbeit {\"u}berpr{\"u}ft werden. Durch Kombination verschiedener Gen-Expressions-Datens{\"a}tze wurden „medull{\"a}re Thymusgene" identifiziert und in 3 Gruppen (Gene ohne Beeinflussung durch AIRE bzw. Gene mit positiver bzw. negativer Regulation durch AIRE) unterteilt. Unter den hier identifizierten, durch AIRE positiv regulierten Genen fanden sich zahlreiche Gene mit potentieller Bedeutung f{\"u}r die Immunregulation bzw. die Entstehung experimenteller und humaner Autoimmunerkrankungen. Eine Analyse verschiedener Thymom-Subtypen ergab weder eine erkennbare „AIRE-Verlust-Signatur" noch eine medull{\"a}re Gensignatur in den „medull{\"a}ren" Typ A Thymomen. Die erhobenen Befunde w{\"a}ren aber mit einem Stammzellmodell der Thymomentstehung vereinbar, nach dem die unterschiedlichen Thymom-Subtypen aus unterschiedlich determinierten Stamm- oder Progenitorzellen mit verschiedenen Reifungsblockaden hervorgehen k{\"o}nnten.}, subject = {Thymuskrankheit}, language = {de} } @phdthesis{Hummel2015, author = {Hummel, Jonas Florian}, title = {H{\"u}llproteine endogener Retroviren interferieren mit der allostimulatorischen Aktivit{\"a}t dendritischer Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-118964}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Das humane Genom besteht zu ungef{\"a}hr 8 \% aus humanen endogenen Retroviren (HERVs), jedoch sind viele aufgrund von Mutationen oder Deletionen nicht mehr funktionell. Trotzdem wurden funktionelle HERV-Proteine gefunden, welche offene Leserahmen (ORFs) besitzen und f{\"u}r funktionelle H{\"u}ll-Glykoproteine wie z.B. Syncytin-1, Syncytin-2 und HML-2 kodieren. Diese HERV-H{\"u}llproteine beinhalten eine suppressive Dom{\"a}ne (SU) und induzieren m{\"o}glicherweise eine Immunsuppression diverser Immunzellen w{\"a}hrend einer gesunden Schwangerschaft. In dieser Arbeit wurden spezifisch die modulatorischen Eigenschaften verschiedener HERVH{\"u}llproteine (Syncytin-1, -2 und HML-2) auf Immunzellen untersucht. Wir konnten zeigen, dass die HERV-Bindungsrezeptoren ASCT-1, -2 und MFSD2A auf der Oberfl{\"a}che von T-Zellen und DCs exprimiert werden. F{\"u}r funktionelle Experimente wurden HERV-H{\"u}llproteine transgen in CHO-Zellen exprimiert, die als Effektorzellen in Ko-Kultur- Systemen verwendet wurden. Es konnte keine Hemmung der PMA/Ionomycin-stimulierten T-Zell-Proliferation durch die Effektorzellen gefunden werden. Dar{\"u}ber hinaus beeintr{\"a}chtigten die Effektorzellen nicht die Expression von Reifungsmarkern auf DCs nach LPS-Aktivierung, induzierten jedoch die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL- 12 und TNF-α. Dagegen inhibierten die konstitutiv HERV-H{\"u}llprotein-exprimierenden Chorionkarzinom-Zelllinien BeWo und JEG die PMA/Ionomycin-stimulierte T-Zell- Proliferation sehr effektiv. Die Chorionkarzinom-Zelllinien hatten ebenfalls keinen Einfluss auf die ph{\"a}notypische LPS-DC-Reifung, modulierten aber die LPS-DC-Zytokin-Antwort sehr effektiv zu einem suppressiven Profil durch eine Inhibition der pro-inflammatorischen Zytokine IL-12 und TNF-α sowie einen Anstieg von anti-inflammatorischem IL-10. BeWound JEG-Zellen, aber auch HERV-H{\"u}llprotein-exprimierende Effektorzellen ver{\"a}ndern die durch LPS-DC-stimulierte allogene T-Zell-Proliferation. Dies war mit einer verringerten Bildung von DC/T-Zell-Konjugaten sowie mit einer Hemmung der IFN-γ-Sekretion und der Ca2+-Mobilisation dieser T-Zellen assoziiert. Des Weiteren wurden eine reduzierte p-Tyrosin- Akkumulation und kein Ausschluss des F-Aktin-Signals in der immunologischen Synapse, der Kontaktstelle dieser DC/T-Zell-Konjugate, gefunden. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse vermuten, dass HERV-H{\"u}llproteine die T-Zell- Proliferation nicht direkt beeinflussen, sich aber modulierend auf DCs auswirken und dadurch mit deren allogene T-Zell-Proliferation interferieren.}, subject = {Syncytin}, language = {de} } @phdthesis{Rein2014, author = {Rein, Alice Felicitas}, title = {Identifizierung von durch PI3K-Inhibition induzierten Spleißvarianten in T-Zellen mittels Exon Array und die Effekte funktionell relevanter Gene auf T-Zell-Funktionen und Viabilit{\"a}t}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-103462}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Die Interaktion des Masernvirus mit T-Zellen st{\"o}rt die Aktivierung der TCR-Signalkaskade durch die Hemmung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), die zur Einstellung der T-Zell-Funktionen f{\"u}hrt und dadurch nachgeschaltete (downstream) Signalwege sowie den Eintritt in den Zellzyklus, aber auch die Genexpression reguliert. Infolgedessen k{\"o}nnen die Aktivit{\"a}t spleißregulatorischer Faktoren sowie die Spleißmuster von mRNAs ver{\"a}ndert werden, wie zum Beispiel bei der alternativ gespleißten SHIP1-Isoform SIP110, die eine T-Zell-inhibitorische Aktivit{\"a}t zeigt. Um alternativ gespleißte (AS) und differentiell regulierte (RG) Transkripte in T-Zellen infolge von PI3K-Inhibition zu erfassen, wurde ein Human Exon 1.0 ST Array an RNA-Proben von humanen T-Zellen, 24 h stimuliert und stimuliert/ PI3K-inhibiert, durchgef{\"u}hrt. Durch die Anwendung geeigneter bioinformatischer Algorithmen konnten spezifisch in PI3K-inhibierten Zellen angereicherte Transkripte nachgewiesen und in die Kategorien AS (2192 Gene) und RG (619 Gene) eingeteilt werden. Ausgew{\"a}hlte Gene wurde mittels RT-PCR und qPCR validiert, gefolgt von der funktionellen Annotation beider Genlisten. AS Gene konnten verst{\"a}rkt in ECM-Rezeptor Interaktionen, fokaler Adh{\"a}sion, Proliferation, Zytoskelettorganisation und Tumorsignalwegen gefunden werden, w{\"a}hrend RG Gene eher in der DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Stressantwort vertreten waren. Gene beider Gruppen konnten auf Signalwege bezogen werden, die essentiell f{\"u}r den TCR-Signalweg, die Zytoskelettdynamik und den Zellzykluseintritt waren. Das st{\"u}tzt die Annahme, dass die Außerkraftsetzung der PI3K-Sch{\"u}sselprozesse der T-Zell-Aktivierung sowohl auf der Ebene der RG als auch der AS Gene wirkt. {\"U}ber die Ingenuity Pathway Analyse konnten wir unsere Genlisten mit Genen vergleichen, die bereits auf solche Schl{\"u}sselprozesse und die Viabilit{\"a}t bezogen werden k{\"o}nnen. In der {\"U}berschneidung wurden z.B. die AS GTP-Austauschfaktoren Vav1 und Vav3 gefunden, die f{\"u}r die {\"U}bersetzung extrazellul{\"a}rer Signale in Zytoskelettdynamik, Proteinphosphatasen und Adapter von Bedeutung sind. Ausgew{\"a}hlte Gene (AS - FBXO6 und LAT2, RG - SLFN5) wurden aus PI3K-arretierten T-Zellen kloniert und deren Effekt auf grundlegende zellul{\"a}re Funktionen durch {\"U}berexpression in HEK293T-Zellen {\"u}berpr{\"u}ft. Die Fusionsproteine ver{\"a}nderten weder die Zellviabilit{\"a}t noch die Proliferation dieser Zellen. {\"U}ber einen auf siRNA basierenden Knockdown wurde {\"u}berpr{\"u}ft, ob das RG Gene SLFN5 als Suppressor auf die T-Zell-Aktivierung agiert. Der Knockdown in prim{\"a}ren T-Zellen zeigte keinen Einfluss auf die Zellviabilit{\"a}t, Proliferation und Polarisation. Jedoch konnte ein signifikanter Effekt auf die T-Zell-Adh{\"a}renz auf Fibronektin gezeigt werden, was darauf schließen l{\"a}sst, dass SLFN5 die T-Zell-Adh{\"a}renz negativ reguliert. Des Weiteren wurde die MV-induzierte Regulation selektierter Gene betrachtet und Unterschiede in der Regulation im Vergleich zur direkten PI3K-Inhibition festgestellt. Ein Grund daf{\"u}r k{\"o}nnte sein, dass das MV eine Inhibition auf vielen Ebenen induziert, anstelle der alleinigen PI3K-Inhibition. Abschließend wurde untersucht, ob ausgew{\"a}hlte Gene an der Regulation in verschiedenen T-Zelllinien beteiligt sind und als Tumorsuppressoren agieren k{\"o}nnten. FBXO6 als Regulator der CHK1-Stabilit{\"a}t wurde in den meisten Zelllinien nicht exprimiert. Die Annahme, dass eine Stress-induzierte defekte Ubiquitinierungsmaschinerie an der Resistenz von Tumorzellen auf Chemotherapeutika beteiligt ist, macht FBXO6 zu einem interessanten Kandidaten als Biomarker f{\"u}r Tumorsensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber Krebsmedikamenten. Diese Annahme bedarf jedoch weiterer Untersuchungen.}, subject = {Phosphatidylinositolkinase }, language = {de} } @phdthesis{Langenhorst2013, author = {Langenhorst, Daniela}, title = {Induktion und Aktivierung regulatorischer T-Zellen durch superagonistische Stimulation des CD28 Molek{\"u}ls}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-96700}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine ntscheidende Rolle beim Erhalt der Immunhom{\"o}ostase und bei der Kontrolle {\"u}berschießender Immunantworten. Sie k{\"o}nnen anhand ihres Entstehungsortes in im Thymus generierte nat{\"u}rliche Tregs (nTregs) und in der Peripherie generierte induzierte Tregs (iTregs) unterteilt werden. Ihr Ph{\"a}notyp wie auch ihre Funktion werden zu einem großen Teil durch den transkriptionellen Masterregulator Foxp3 kontrolliert. Das kostimulatorische Molek{\"u}l CD28 wird von nTregs f{\"u}r die Differenzierung ben{\"o}tigt und von Tregs und konventionellen T-Zellen (Tkons) f{\"u}r ihre Aktivierung. Superagonistische CD28 spezifische monoklonale Antik{\"o}rper (CD28SA) aktivieren T-Zellen im Gegensatz zu konventionellen anti-CD28 Antik{\"o}rpern ohne zus{\"a}tzliche Ligation des T-Zellrezeptors. Die in vivo Applikation des CD28SA bewirkt eine starke Aktivierung der Tregs und eine pr{\"a}ferentielle Expansion der Tregs gegen{\"u}ber Tkons. Dies erkl{\"a}rt die pr{\"a}ventive und therapeutische Wirkung der CD28SA Behandlung in verschiedenen Krankheitsmodellen bei Nagern. Die erste Anwendung des humanisierten CD28SA TGN1412 f{\"u}hrte in den Testpersonen jedoch zu einem unerwarteten „Cytokine-Release Syndrom". Daher wurde hier am Mausmodell der Zusammenhang zwischen Treg Aktivierung und systemischer Zytokinaussch{\"u}ttung n{\"a}her untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die CD28SA vermittelte Proliferation der T-Zellen abh{\"a}ngig vom CD28 Signal und von parakrinem Interleukin (IL)-2 ist. Durch die in vivo Depletion der Tregs vor der CD28SA Injektion wurde deutlich, dass es auch in M{\"a}usen nach CD28SA Stimulation zu einer systemischen Aussch{\"u}ttung pro-inflammatorischer Zytokine kommt, die jedoch, im Gegensatz zum humanen System, von Tregs effektiv kontrolliert werden kann. Um die ussch{\"u}ttung pro-inflammatorischer Zytokine zu verhindern, w{\"a}re eine zus{\"a}tzliche prophylaktische Behandlung mit Corticosteroiden m{\"o}glich, da diese auch in hohen Dosen die CD28SA vermittelte Aktivierung und Expansion der Tregs nicht beeinflussen. Neben der Expansion wird durch die Stimulation mit CD28SA auch die Produktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 in Tregs induziert und so eine genauere Untersuchung des Ursprungs und des Schicksals IL-10 produzierender Tregs erm{\"o}glicht. Diese Tregs exprimieren im Vergleich zu IL-10 negativen Tregs ein h{\"o}heres Niveau an Molek{\"u}len, die mit einer supprimierenden Aktivit{\"a}t verbunden sind. Zudem werden IL-10 Produzenten aufgrund der Ver{\"a}nderung im Expressionsmuster der Migrationsrezeptoren nach der Stimulation von einem lymphknotensuchenden CCR7+CCR5-CCR6- zu einem entz{\"u}ndungssuchenden CCR7-CCR5+CCR6+ Ph{\"a}notyp verst{\"a}rkt in Bereiche mit stattfindender Immunantwort rekrutiert. Schließlich sind IL-10 produzierende Tregs von CD28SA stimu2 lierten M{\"a}usen in vitro st{\"a}rker apoptoseanf{\"a}llig als die IL-10 negativen Tregs. Die Aktivierung der Tregs scheint somit die terminale Differenzierung zu einem IL-10 produzierenden Effektorph{\"a}notyp mit begrenzter Lebensdauer zu induzieren. Dies f{\"u}hrt auch zur Beendigung der Immunsuppression. Die Kombination aus schwachem TZR und starkem CD28 Signal, die die CD28SA Stimulation in naiven T-Zellen ausl{\"o}st, induziert zumindest in vitro abh{\"a}ngig von IL-2 und TGFβ effizient die Expression von Foxp3. Die so generierten iTregs haben, {\"a}hnlich wie konventionell in vitro erzeugte iTregs, in Bezug auf die Expression von Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}len und den Methylierungsstatus bestimmter Regionen des Foxp3 Gens einen Ph{\"a}notyp, der zwischen dem von Tkons und Tregs liegt. Da auch die supprimierende Aktivit{\"a}t der iTregs geringer ist als die der ex vivo Tregs bedarf es einer weiteren Optimierung des Stimulationsprotokolls, um diese Zellen f{\"u}r therapeutische Zwecke verwenden zu k{\"o}nnen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die superagonistische Stimulation des CD28 Molek{\"u}ls ein vielseitig einsetzbares Instrument ist. Einerseits k{\"o}nnen durch die CD28SA Stimulation Tregs polyklonal aktiviert und f{\"u}r therapeutische Zwecke mobilisiert werden und andererseits kann die besondere Art der T-Zellstimulation auch dazu genutzt werden, neue Aspekte von nTregs und iTregs zu untersuchen.}, subject = {Antigen CD28}, language = {de} } @phdthesis{Junker2021, author = {Junker, Lara P{\"a}ldsom Rosemarie}, title = {Klonale T-LGL-Zellen bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis}, doi = {10.25972/OPUS-23846}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-238462}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {Die Rheumatoide Arthritis ist eine h{\"a}ufig auftretende, chronisch entz{\"u}ndliche Systemerkrankung und wird bei bis zu einem Drittel der Patienten mit einer T-LGL-Leuk{\"a}mie diagnostiziert. Wie h{\"a}ufig klonale T-LGL-Zellen bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis auftreten, ist ungekl{\"a}rt. Ziel dieser Studie war es, die Oberfl{\"a}chenantigene der T-Lymphozyten in einem Patientenkollektiv mit Rheumatoider Arthritis zu bestimmen. Der Fokus lag dabei auf der Pr{\"a}valenz von klonalen T-LGL-Zellexpansionen und m{\"o}glichen Risikofaktoren. Hierf{\"u}r wurden zwischen November 2013 und August 2015 527 Patienten mit Rheumatoider Arthritis mittels Durchflusszytometrie untersucht. Zur Best{\"a}tigung der Klonalit{\"a}t erfolgte bei Patienten mit auff{\"a}lligem Immunph{\"a}notyp eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion)-Analyse. Bei 19 Patienten konnte eine klonale T-LGL-Zellexpansion festgestellt werden, was einer Pr{\"a}valenz von 3,6\% entspricht. Das Auftreten von klonalen T-LGL-Zellen war mit einer TNFα-Inhibitoren-Therapie (p=0,01) und deren Dauer assoziiert (p=0,01). Ob die klonalen T-LGL-Zellen Ausdruck der Autoimmunerkrankung oder Vorl{\"a}uferzellen einer T-LGL-Leuk{\"a}mie sind, bleibt offen. Die Patienten werden mit einer klonalen T-LGL-Zellexpansion unklarer Signifikanz beschrieben.}, subject = {Rheumatoide Arthritis}, language = {de} } @phdthesis{Mehling2000, author = {Mehling, Beatrix}, title = {Klonierung und Charakterisierung eines polymorphen MHC Kl. I-Molek{\"u}ls der LEW.1F-Ratte, das pr{\"a}ferentiell Va8.2-exprimierende CD8-T-Zellen expandiert}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1727}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Der MHC der Lewis.1F-Ratte (RT1f) stimuliert die pr{\"a}ferentielle Expansion von CD8-T-Zellen, die das V-Segment 8.2 (AV8S2) der TCR-alpha-Kette verwenden. Sowohl als Folge der positiven thymischen Selektion in der Lewis.1F-Ratte (LEW.1F) wie auch bei der RT1f-Alloerkennung. Es war Ziel dieser Arbeit, das MHC Kl. I-Molek{\"u}l der LEW.1F-Ratte, das diese pr{\"a}ferentielle Expansion von AV8S2-Zellen induziert, zu klonieren sowie die Kontaktpunkte der Interaktion zwischen dem MHC-Molek{\"u}l und AV8S2 zu kartieren. {\"U}ber RT-PCR wurde ein MHC-I-Gen der LEW.1F-Ratte (RT1.Af) isoliert, sequenziert und zusammen mit einem anderen MHC-I-Gen aus der LEW.1F-Ratte (A2f) analysiert, das von einer Arbeitsgruppe aus Babraham (Cambridge, UK) gefunden worden war. Durch einen Nukleotidsequenz-Vergleich von Af und A2f mit bekannten Ratte-MHC-I-Genen konnte gezeigt werden, daß die Sequenzen beider charakteristisch f{\"u}r Ratte-MHC-I-Gene sind. Beide Molek{\"u}le wurden stabil in L-Zellen, rCD80-transfizierte P815-Zellen und T-Zellhybridomen (THO35/1) exprimiert. Die serologische Charakterisierung mit 19 RT1f-reaktiven Alloantik{\"o}rpern ergab, daß sich die LEW.1F-Serologie alleine durch Af erkl{\"a}ren l{\"a}ßt. In einem Zytotoxizit{\"a}tstest mit LEW.1F-reaktiven zytotoxischen T-Lymphozyten, wurde Af spezifisch erkannt, A2f dagegen nicht. Serologie und Zytotoxizit{\"a}tstest zeigen, daß die RT1f-spezifische Alloerkennung das Af-Molek{\"u}l fokussiert, A2f unbedeutend scheint. M{\"o}glicherweise, da dieses Molek{\"u}l in der LEW.1F-Ratte nur schwach exprimiert ist. Die Interaktion von Af und A2f mit AV8S2-Zellen wurde mittels einer MLR (gemischte Lymphozytenreaktion) in der Alloerkennung untersucht: Af, nicht aber A2f, stimuliert die pr{\"a}ferentielle Expansion AV8S2-positiver CD8-T-Zellen in der Alloreaktion. Somit ist Af als das Molek{\"u}l identifiziert, daß die {\"U}berselektion von AV8S2-Zellen vermutlich auch in der thymischen Repertoire-Selektion induziert. Zur Kartierung der Af/AV8S2-Interaktion wurden Hybridmolek{\"u}le aus Aa und Af gentechnisch hergestellt: Aa und Af unterscheiden sich extrazellul{\"a}r nur in sieben Aminos{\"a}uren, die konzentriert auf zwei Regionen des MHC-Molek{\"u}ls liegen: "Region I" (AS 62, 63, 65, 69, 70) und "Region II" (167, 169). Aa stimuliert keine pr{\"a}ferentielle AV8S2-Zell-Expansion, daher muß die charakteristische Kombination dieser sieben Aminos{\"a}uren f{\"u}r die pr{\"a}ferentielle Interaktion mit AV8S2-positiven CD8-T-Zellen ausschlaggebend sein. Durch MLRs mit Hybrid-exprimierenden Stimulatorzellen wurde gezeigt, daß beide Regionen zur pr{\"a}ferentiellen Expansion AV8S2-exprimierender CD8-T-Zellen beitragen. Durch den Vergleich mit anderen Daten unseres Labors konnte dargelegt werden, daß die beta-Kette zur pr{\"a}ferentiellen Interaktion von AV8S2-Zellen mit Af keinen spezifischen Beitrag leistet. Ebenso unbeteiligt ist die Komplementarit{\"a}t-bestimmende Region 2 (CDR2) der alpha-Kette. Die charakteristischen Sequenzen von CDR1alpha und CDR3alpha dagegen sind f{\"u}r die pr{\"a}ferentielle Expansion von AV8S2-positiven CD8-T-Zellen durch Af essentiell.}, subject = {Antigen CD8}, language = {de} } @phdthesis{PenaMosca2024, author = {Pe{\~n}a Mosca, Mar{\´i}a Josefina}, title = {Local regulation of T-cell immunity in the intestinal mucosa}, doi = {10.25972/OPUS-35266}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-352665}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2024}, abstract = {After priming in Peyer's patches (PPs) and mesenteric lymph nodes (mLN) T- cells infiltrate the intestine through lymphatic draining and homing through the bloodstream. However, we found that in mouse models of acute graft-versus-host disease (GvHD), a subset of alloreactive T-cells directly migrates from PPs to the adjacent intestinal lamina propria (LP), bypassing the normal lymphatic drainage and vascular trafficking routes. Notably, this direct migration occurred in irradiated and unirradiated GvHD models, indicating that irradiation is not a prerequisite for this observed behavior. Next, we established a method termed serial intravascular staining (SIVS) in mouse models to systematically investigate the trafficking and migration of donor T- cells in the early stages of acute GvHD initiation. We found that the direct migration of T-cells from PPs to LP resulted in faster recruitment of cells after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). These directly migrating T-cells were found to be in an activated and proliferative state, exhibiting a TH1/TH17-like phenotype and producing cytokines such as IFN-γ and TNF-α. Furthermore, we observed that the directly migrating alloreactive T-cells expressed specific integrins (α4+, αE+) and chemokine receptors (CxCR3+, CCR5+, and CCR9+). Surprisingly, blocking these integrins and chemokine-coupled receptors did not hinder the direct migration of T- cells from PPs to LP, suggesting the involvement of alternative mechanisms. Previous experiments ruled out the involvement of S1PR1 and topographical features of macrophages, leading us to hypothesize that mediators of cytoskeleton reorganization, such as Coro1a, Dock2, or Cdc42, may play a role in this unique migration process. Additionally, we observed that directly migrating T-cells created a local inflammatory microenvironment, which attracts circulating T-cells. Histological analysis confirmed that alloreactive PPs-derived T-cells and bloodborne T-cells colocalized. We employed two experimental approaches, including either photoconversion of T-cells in PPs or direct transfer of activated T-cells into the vasculature, to demonstrate this colocalization. We hypothesize that cytokines released by migrating T-cells, such as IFN-γ and TNF-α, may play a role in recruiting T-cells from the vasculature, as inhibiting chemokine-coupled receptors did not impair recruitment.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} } @phdthesis{Mueller2006, author = {M{\"u}ller, Nora}, title = {Masern Virus Interferenz mit T-Zell-Aktivierung : Einfluß auf Zytoskelettdynamik, Mobilit{\"a}t und Interaktion mit Dendritischen Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17953}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Der Kontakt humaner T-Zellen mit dem MV Glykoproteinkomplex interferiert mit der CD3/CD28 stimulierten Aktivierung von PI3/Akt-Kinase Signalwegen. Damit verbunden ist der ineffiziente Transport PH-Dom{\"a}nen-enthaltender Proteine in Membran-rafts, wie der Akt-Kinase und Vav, den Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rho GTPasen. Es konnte gezeigt werden, dass infolge des MV-Kontaktes die CD3/CD28 stimulierte Aktivit{\"a}t der Rho GTPasen Cdc42 und Rac1 inhibiert ist. Dagegen war in MV-behandelten Zellen eine leichte RhoA Aktivierung festzustellen. Rho GTPasen spielen eine kritische Rolle in der Regulation von Zytoskelettorganisation von T-Lymphozyten. {\"U}bereinstimmend damit wurde gezeigt, dass der Kontakt mit MV die CD3/CD28 costimulierte Aktivierung und Polymerisation des F-Aktins inhibiert. Damit verbunden ist die reduzierte F{\"a}higkeit MV-behandelter T-Zellen auf Fibronektin- und mit CD3/CD28 Antik{\"o}rpern-beschichteten Objekttr{\"a}gern zu polarisieren. Die Ausbildung F-Aktin-getriebener morphologischer Ver{\"a}nderungen, wie Filopodien, Lamellipodien und Uropodien, ist drastisch reduziert. Rasterelektronenmikroskopische Auf-nahmen zeigten in nicht-stimulierten und CD3/CD28 costimulierten MV-behandelten T-Zellen einen nahezu kompletten Verlust an Mikrovilli und Lamellipodien. Die Bindung von MV induziert die Dephosphorylierung des F-Aktin-bindenden Proteins Cofilin und der ERM-Proteine. Es konnte demonstriert werden, dass der MV-Kontakt die Ausbildung einer reifen immunologischen Synapse st{\"o}rt. Trotz der morphologischen Ver{\"a}nderungen konjugieren MV-behandelte T-Zellen mit DCs. Die Anzahl MV-behandelter T-Zellen, die mit DCs inter-agieren, ist vergleichbar mit der mock-behandelter T-Zellen. Allerdings zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion der DC/T-Zell-Kontaktzone, dass in MV-behandelten T-Zellen die zentrale Akkumulation und Clusterbildung des CD3-Molek{\"u}ls gest{\"o}rt ist und keine monozentrische Synapse ausbildet wird. Desweiteren erfolgt die Relokalisation des MTOC in T-Zellen in Richtung der DC unvollst{\"a}ndig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der MV Glykoproteinkomplex mit essentiellen Schritten einer erfolgreichen T-Zell-Aktivierung w{\"a}hrend der APC/T-Zell-Interaktion interferiert.}, subject = {Masernvirus}, language = {de} } @phdthesis{Blank2009, author = {Blank, Marc}, title = {Mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Apoptose in T-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-41332}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 {\"U}berexpression resultiert in einer Resistenz gegen{\"u}ber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide k{\"o}nnen die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage {\"u}ber die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die {\"a}ußere Mitochondrienmembran zu sch{\"a}digen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu f{\"u}hren. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, f{\"u}hren so {\"u}ber eine Erh{\"o}hung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden M{\"o}glichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegen{\"u}ber GC-induzierter Apoptose f{\"u}hrt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. W{\"a}hrend die {\"U}berexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, f{\"u}hrte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegen{\"u}ber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Dar{\"u}ber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout M{\"a}usen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in h{\"a}matopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter M{\"a}use genutzt wurden, best{\"a}tigt werden. W{\"a}hrend der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im h{\"a}matopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo.}, subject = {Glucocorticosteroidrezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Bischof2000, author = {Bischof, Astrid}, title = {Mechanismen der TZR-abh{\"a}ngigen und -unabh{\"a}ngigen Aktivierung prim{\"a}rer T-Zellen der Ratte durch CD 28}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-875}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Zur Aktivierung ruhender T-Zellen sind zwei Signale erforderlich: Eines wird antigen-abh{\"a}ngig {\"u}ber den T-Zellrezeptor (TZR) gegeben, ein zweites erfolgt {\"u}ber kostimulatorische Rezeptoren. Unter den bekannten kostimulatorischen Molek{\"u}len ist CD28 das potenteste. Die mitogene Aktivit{\"a}t einiger monoklonaler Antik{\"o}rper (mAb) spezifisch f{\"u}r CD28 der Ratte, die alle ruhenden prim{\"a}ren Ratten-T-Zellen ohne TZR-Ligation zu Proliferation und IL-2-Produktion anregen k{\"o}nnen, erlaubte, die Signalwege nach dieser direkten CD28-Stimulation und nach Kostimulation zu analysieren und zu vergleichen. Die erzielten Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Signalwege nach Kostimulation mit TZR-Beteiligung und direkter CD28-Stimulation hin und zeigen, daß direkte CD28-Stimulation nicht die Signaltransduktion durch den TZR imitiert. Daher unterst{\"u}tzt CD28 als kostimulatorisches Molek{\"u}l nicht nur TZR-vermittelte Signaltransduktion, sondern fungiert auch als eigenst{\"a}ndiges Signalmolek{\"u}l, das spezifische mitogene Signale generiert. Diese Eigenschaft von CD28 k{\"o}nnte f{\"u}r die Art der induzierten Immunreaktion von Bedeutung sein, da das Verh{\"a}ltnis der St{\"a}rke von TZR- und CD28-Signal die funktionelle Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen bestimmt.}, subject = {Antigen CD28}, language = {de} } @phdthesis{JarickneeOttmueller2020, author = {Jarick [n{\´e}e Ottm{\"u}ller], Katja Julika}, title = {Migration of allogenic T cells in intestinal lymphoid structures during acute Graft-versus-Host Disease}, doi = {10.25972/OPUS-17875}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178758}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {T cell infiltration into the intestine occurs after priming and activation in the mesenteric lymph nodes and Peyer's patches and subsequent trafficking via the blood circulation. We hypothesized that additionally to the vascular trafficking route, a fraction of T cells in the Peyer's patches directly migrate into the adjacent lamina propria of the small intestine. To test this hypothesis, we employed a mouse model of acute Graft-versus-Host Disease to study the direct T cell migration from the Peyer's patches to the adjacent lamina propria. First, we analyzed the border of Peyer's patches on histological sections and found that the Peyer's patch is not enclosed by a capsule or basement membrane. Thus, the tissue architecture allows for direct access to the surrounding tissue. With whole-mount light sheet fluorescence microscopy we quantified a three-dimensional gradient of T cells around Peyer's patches on day 2.5 and day 3 after transplantation. This gradient evened out at day 4 and day 6 when high numbers of T cells started to evenly infiltrate the intestine from the blood circulation. We confirmed that gradient-forming T cells around Peyer's patches resided within the tissue parenchyma of the lamina propria and not inside lymphatic vessels. To positively prove that the recently activated donor T cells around Peyer's patches have egressed directly from that patch, we established a protocol for intravital photoconversion of T cells inside Peyer's patches. 12 h after photoconversion inside a single Peyer's patch, photoconverted T cells resided only around this particular Peyer's patch and not elsewhere in the small intestine. This indicated that the T cells did not infiltrate via the blood but migrated to the adjacent lamina propria of the small intestine. Dynamic intravital two-photon microscopy revealed that these T cells next to the Peyer's patch migrated in a random pattern. This suggested that these cells did not follow a positive chemoattractive gradient once they had reached the lamina propria. Laser-capture microdissection combined with RNA sequencing of the mucosa near the Peyer's patch identified a wide range of migration-promoting factors. These included chemokines, co-stimulatory receptors and migration-associated intracellular molecules, which are candidates to promote this direct migration from Peyer's patches. Altogether, we demonstrate for the first time that additionally to the vascular trafficking route, a fraction of T cells migrates directly from the Peyer's patch to the surrounding mucosa. This mechanism implies so far unrecognized regional specification of Peyer's-patch-primed T cells. Our findings may impact treatment strategies to avoid intestinal inflammation or foster immunity after oral vaccination.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} } @phdthesis{Scheller2023, author = {Scheller, Lukas}, title = {Migrationsf{\"o}rdernde Faktoren im intestinalen T-Zell-Homing w{\"a}hrend der akuten Graft-versus-Host Erkrankung}, doi = {10.25972/OPUS-29290}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-292909}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Die akute Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD), insbesondere die Darm GvHD, stellt weiterhin eine der Hauptursachen f{\"u}r Mortalit{\"a}t und Morbidit{\"a}t nach allogener SZT dar. Aktivierte, alloreaktive Spender T-Zellen infiltrieren dabei {\"u}ber die Blutbahn die intestinale Lamina Propria. Erst k{\"u}rzlich konnten wir zeigen, dass neben der vaskul{\"a}ren Migration ein Teil der Spender T-Zellen auch direkt aus den PP in die angrenzende Lamina Propria migrieren. Um Faktoren, die diese direkte Migration f{\"o}rdern, zu untersuchen und die direkt migrierenden T-Zellen genauer zu charakterisieren, verwendeten wir ein MHC-inkompatibles Mausmodell zur Induktion einer akuten GvHD. Durch RNA Sequenzierung und Massenspektrometrie lasermikrodissezierter Darmschleimhautproben konnte eine starke Expression der Chemokine CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 und CCL5 w{\"a}hrend der akuten intestinalen GvHD aufgezeigt werden. Neben CCL4 und XCL1 wiesen verschiedene Faktoren der T-Zellaktivierung, wie CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, sowie Faktoren der zytoskelettalen Reorganisation, wie Dock2, Coro1α und Parvin-γ, eine vermehrte Expression insbesondere nahe der PP auf. Die Expression der migrationsf{\"o}rdernden Faktoren Coro1α und Parvin-γ in Spender T-Zellen nahe der PP konnte anschließend mittels histologischen Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen best{\"a}tigt werden. Durchflusszytometrische Analysen konnten weiterhin eine vermehrte Expression von CCR5, CCR9 und Intgerin α4β7 auf den vornehmlich Tbet+ Spender T-Zellen nahe der PP nachweisen. Funktionelle in vitro Migrationsversuche zeigten abschließend, dass in vivo aktivierte Spender T-Zellen eine gerichtete Migration in Richtung auf CXCL11 und zu sp{\"a}terem Zeitpunkt auch auf CCL4 vollziehen k{\"o}nnen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die Bedeutung zahlreicher Chemokine f{\"u}r das sequenzielle T-Zell-Homing w{\"a}hrend der akuten intestinalen GvHD. Neben der insbesondere durch Faktoren der zytosekeletalen Reorganisation vermittelten amoeboiden Migration kann auch eine mesenchymale Fortbewegung {\"u}ber Faktoren wie CCR5, CCR9 und Integrin α4β7 die direkte Migration der T-Zellen f{\"o}rdern. Den direkt migrierenden vornehmlich TH1 polarisierten Zellen folgen weitere, CD27 und Integrin αLβ2 exprimierende, zytotoxische T-Zellen aus der Blutbahn. Die direkt migrierenden Zellen k{\"o}nnten als Initiator und Potentiator der intestinalen T-Zell Infiltration wirken und m{\"u}ssen f{\"u}r zuk{\"u}nftige therapeutische Strategien nicht nur der Darm GvHD, sondern der intestinalen Inflammation im Allgemeinen mitber{\"u}cksichtigt werden.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{Li2010, author = {Li, Jian-Qiang}, title = {Modulating the expression of enzymes of isoprenoid synthesis: effects on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and tumor cell growth}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46388}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {This study focuses on phosphoantigen specific Vg9Vd2 T cells which only exist in human and non-human primates. This population accounts for 1\%-5\% of peripheral blood T-lymphocytes but their frequency can rise to 50\% of total blood T cells upon infection. Vg9Vd2 T cells can be activated by nonpeptide compounds with critical phosphate moieties which are termed as phosphoantigens. These include isopentenyl pyrophosphate (IPP), a key compound of isoprenoid synthesis in all organisms, and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), a direct precursor of IPP in DOXP pathway which only exist in eubacteria, plants, apicomplexaen parasites. Its activity as phosphoantigen is at least 1000 fold higher than that of IPP. However, direct structural evidence of phosphoantigen binding to the TCR is missing so far. Moreover, Vg9Vd2 T cells have potent anti-tumor activity e.g. against the B-cell lymphoma Daudi, whose Vg9Vd2 T cell activating properties have been suggested to result from sensing of abnormal intracellular IPP levels by the Vg9Vd2 TCR or Vg9Vd2 TCR binding to other postulated ligands such as an ectopically expressed F1-ATPase or UL-16 binding protein 4 (ULBP4). Aminobisphosphonates and alkymines were hypothesized to activate Vg9Vd2 T cells indirectly by inhibiting the IPP consuming enzyme farnysyl pyrophosphates synthesis (FPPS) although off target effects of these drugs or a direct interaction with the Vg9Vd2 TCR could not be excluded. This thesis presents new approaches for the mechanistic analysis of Vg9Vd2 T cell activation. By employing retroviral transduction of FPPS specific shRNA, it shows that specific shRNA reduces expression of FPPS and is sufficient to convert hematopoietic and non-hematopoietic tumor cell lines into Vg9Vd2 T cell activators. FPPS knockdown cells activated Vg9Vd2 T cells as measured by increased levels of CD69 and CD107a, kill of FPPS knockdown cells and induction of IFN-\&\#947; secretion. The IPP-synthesis-inhibiting drug mevastatin reduced Vg9Vd2 T cell activation by FPPS knockdown cells or aminobisphosphonate treated cells but not activation by the phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (BrHPP). A reduced growth of the FPPS knockdown cells has not been observed which is different to what has been reported for aminobisphosphonate treated cells. Finally, the human B-cell lymphoma RAJI has been transduced with Tetracyclin-inducible FPPS specific shRNA and proven to gain and loose the capacity to activate Vg9Vd2 TCR transductants upon doxycylin provision or removal. Another approach for the analysis of Vg9Vd2 T cell activation is Vg9Vd2 TCR transduced mouse cell lines with specificity for phosphoantigens. In contrast to the previously used Vg9Vd2 TCR transduced Jurkat cells, these cells do not present phosphoantigens, and are therefore specially suited for analysis of phosphoantigen presentation. The response of the new TCR transductants to presumed Vg9Vd2 TCR ligands/activators such as phosphoantigens, aminobisphosphonates or FPPS knockdown cells, depended strongly on the expression of a rat/mouse CD28 molecule by the transductants and its ligation by the (CD80) counter receptor on the ligand-presenting cell. The response is likely to reflect recognition of cognate Vg9Vd2 TCR antigens since mutations in the TCR-\&\#948; chain CDR2 and 3 abolished this response but activation by TCR or CD3 specific antibodies. A major difference between TCR transductants and primary gd T cells, was the lacking response of TCR transductants to Daudi or IPP. In addition their sensitivity to other soluble phosphoantigens was about 100 fold weaker than that of primary cells, stimulation of both cell type to CD80 expressing FPPS knock down or aminobisphosphonates was similar. Finally, the transductants have also been used to analyze effects of over-expression or knockdown of enzymes of isoprenoid synthesis such as 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase or HMGR), mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MVD), isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI), geranyl-geranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) but no clear effects have been found. In conclusion, this thesis supports the concept of Vg9Vd2 T cells being sensors of a dysregulated isoprenoid metabolism and established new tools to study ligand recognition and TCR mediated activation of this T cell population. These tools will be most useful to address following questions: 1) How does the dysregulation of isoprenoid metabolism affect tumor growth? 2) What is the correlation between the modulation of IPP levels and the Vg9Vd2 TCR binding or expression of other postulated ligands? 3) Are there any mevalonate pathway enzymes other than FPPS and HMGR, which play an important role in Vg9Vd2 T cells activation? 4) What is/are the putative phosphoantigen-presenting molecule(s)?}, subject = {Primaten}, language = {en} } @phdthesis{Dennstaedt2020, author = {Dennst{\"a}dt, Fabio Stefan}, title = {Modulation CD4+ humaner Treg- und Tconv-Zellen durch Inhibition der sauren Sphingomyelinase in vitro}, doi = {10.25972/OPUS-20542}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-205420}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Die saure Sphingomyelinase (ASM) stellt durch die Umwandlung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin ein zentrales, fein reguliertes Enzym im Sphingolipidmetabolismus dar. Dadurch nimmt es Einfluss auf verschiedene zellul{\"a}re Mechanismen wie Signalvermittlung, Endo- und Exozytose und Zellaktivierung. Dementsprechend weitreichend ist auch die Bedeutung der ASM bei verschiedenen Krankheiten wie Arteriosklerose, Depression oder Neoplasien. Auch auf das Immunsystem, insbesondere auf die Signalvermittlung durch T-Zellen innerhalb des adaptiven Immunsystems, nimmt die saure Sphingomyelinase Einfluss. Aufbauend auf fr{\"u}heren Forschungsarbeiten zur pharmakologischen und genetischen Hemmung der ASM im Mausmodell untersuchten wir, welche Auswirkungen die Hemmung dieses Enzyms in humanen Zellkulturen auf die Population regulatorischer und konventioneller T-Zellen haben. Hierzu verwendeten wir die beiden selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Sertralin und Citalopram; zwei antidepressiv wirksame Medikamente, die durch eine Verdr{\"a}ngung der ASM von der lysosomalen Membran eine hemmende Wirkung aus{\"u}ben. Wir konnten zeigen, dass diese beiden Substanzen sowohl in Maus-T-Zellen, als auch in humanen T-Zellen, in der Lage sind, die Aktivit{\"a}t der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. Durch Kultivierung von Immunzellen der Maus zusammen mit den Inhibitoren konnte dar{\"u}ber hinaus eine Erh{\"o}hung der Treg-Zellfrequenz erreicht werden. Verschiedene Zellkulturexperimente mit humanen PBMCs zeigten weiterhin, dass unter gewissen Umst{\"a}nden so auch eine Vermehrung regulatorischer T-Zellen im Menschen m{\"o}glich ist, und dass dies mutmaßlich durch Einbindung der ASM im CD3/CD28-Signalweg bedingt ist. In mit AntiCD3-Antik{\"o}rper stimulierten experimentellen Ans{\"a}tzen kam es jedoch nur bei einzelnen Individuen, die als Responder identifiziert werden konnten, zu einer Treg-Zellvermehrung. Umgekehrt kam es durch externe Zugabe von C6-Ceramid zu einer Verringerung des Anteils an regulatorischen T-Zellen. Des Weiteren wurden verschiedene Ver{\"a}nderungen im Expressionsverhalten von Treg- und Tconv-Zellen bez{\"u}glich CD25, CD69 und CTLA-4 in Anwesenheit der ASMInhibitoren beobachtet. Weiterhin best{\"a}tigte sich, dass die pharmakologische Hemmung der sauren Sphingomyelinase auch Auswirkungen auf die Effektorfunktion von T-Zellen hat. W{\"a}hrend die Proliferation der Zellen weitgehend unbeeintr{\"a}chtigt blieb, kam es zu einer verringerten Sekretion der Zytokine IFN-gamma, TNF, IL-5 und IL-10. In ihrer Gesamtheit sprechen diese Ergebnisse daf{\"u}r, dass Inhibitoren der sauren Sphingomyelinase beg{\"u}nstigend auf Krankheitsgeschehen mit {\"u}berschießender oder dysregulierter Aktivit{\"a}t des Immunsystems einwirken k{\"o}nnten. Immunmodulatorischen Wirkungen durch Inhibition der ASM erkl{\"a}ren m{\"o}glicherweise auch Einfl{\"u}sse auf das Immunsystem, die f{\"u}r verschiedene Antidepressiva beschrieben wurden. Insgesamt ist die Bedeutung der sauren Sphingomyelinase innerhalb der Regulation des adaptiven Immunsystems jedoch noch ein weitgehend ungekl{\"a}rtes Thema mit vielen offenen Fragen. Daher ist auch in Zukunft weitere klinische und experimentelle Forschung erforderlich, um zu kl{\"a}ren, welchen Einfluss dieses Enzyms auf Immunzellen hat und wie sich dieser auch klinisch anwenden l{\"a}sst.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{Patra2005, author = {Patra, Amiya Kumar}, title = {Modulation of the NFAT signaling pathway by protein kinase B (PKB) ; a perspective study in the context of thymocyte development and T cell function}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13315}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {To analyze the role of protein kinase B(PKB)on developmental and functional aspects of T cells, we have generated transgenic mouse lines expressing a constitutively active form of PKB (myrPKB) in early stages of T cell development.Peripheral CD4+ T cells from PKB tg mice are hyperreactive, more efficient in producing th1 and th2 cytokines and show faster and CD28 co-stimulation independent cell cycle progression.Interestingly PKB tg T cells are resistant to CsA treatment in proliferation and cytokine production.Further analysis show PKB tg CD4+ T cells have a drastically reduced nuclear translocation of NFAT proteins and this is due to a direct interaction between PKB and NFAT. To study whether the negative regulatiopn of NFATs by PKB affects T cell development, we analyzed double tg mice expressing both, a constitutively active version of calcineurin (dCam) and myrPKB. dCam tg mice have a severe block in thymocyte development at the DN3 stage.But in the dCam/PKB double tg mice this developmental block is significantly rescued.This rescue of thymocyte development by PKB is due to the expression of RAG1 and subsequent TCRb chain expression. CsA treatment of neonatal thymic lobes from dCam mice restores normal thymocyte development, indicating involvement of NFATs in the severe block in dCam thymocyte development.Confocal studies clearly established that compared to dCam DN cells there is a significant reduction in the nuclear levels of NFATc1 and NFATc3 in dCam/PKB cells.Downregulation of nuclear NFAT levels by myrPKB thus seems to be an essential parameter in dCam cells to proceed with normal differentiation. In summary, the data from PKB tg peripheral CD4+ T cells and dCam/PKB double tg thymocytes clearly establish PKB as an important modulator of T cell development and function and PKB as a novel negative regulator of NFAT activation.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} } @phdthesis{Strack2010, author = {Strack, Johanna}, title = {Morphologische Studie zur altersabh{\"a}ngigen Expression von Autoimmunregulator AIRE im gesunden und entz{\"u}ndlich ver{\"a}nderten Thymus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48017}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die Entdeckung der Autoimmunkrankheit APECED f{\"u}hrte zur Entdeckung des verantwortlichen Gens AIRE (autoimmune regulator), das einen Einblick in die Verhinderung oder Entstehung von Autoreaktivit{\"a}t im Thymus bietet. Durch Aktivierung des AIRE-Gens und Expression des AIRE-Proteins werden organspezifische Selbstantigene in medull{\"a}ren Thymusepithelzellen exprimiert und entweder direkt oder nach Transfer auf dendritsche Zellen unreifen T-Zellen pr{\"a}sentiert. Durch Elimination autoreaktiver Zellen entsteht Toleranz gegen{\"u}ber den k{\"o}rpereigenen Geweben. Da das Immunsystem bei steigendem Alter tiefgreifende Ver{\"a}nderungen erf{\"a}hrt, die zum Teil durch die Thymusinvolution bedingt sind, ist es von Interesse, den Verlauf von AIRE {\"u}ber verschiedene Altersstufen hinweg zu untersuchen. Zielsetzungen dieser Arbeit waren daher die quantitative und r{\"a}umliche Untersuchung der AIRE+ -Zellen im Alter und im Kontext einer prototypischen organspezifischen Autoimmunerkrankung, der Myasthenia gravis. Diese Fragestellungen wurden bei Normalthymi, entz{\"u}ndlich ver{\"a}nderten Thymi mit assoziierter Myasthenie und an B1-Thymomen untersucht. Als Ergebnis konnte erarbeitet werden, dass der Gehalt an AIRE+ -Zellen mit dem Alter abnimmt, wobei bis in die neunte Lebensdekade noch AIRE+ -Zellen vorhanden waren. Der Gehalt an AIRE+ Zellen stellte sich als st{\"a}rker mit dem Lebensalter korreliert dar als beispielsweise die Thymusfl{\"a}che. AIRE scheint damit ein mit der Thymusinvolution eng assoziiertes Gen zu sein. Es fand sich eine hochsignifikante Co-Lokalisation von AIRE+ Zellen und Hassall-K{\"o}rperchen, die besonders durch die Untersuchungen von Typ B1 Thymomen mit und ohne Hassall-K{\"o}rperchen best{\"a}tigt werden konnte. In {\"U}bereinstimmung mit aktuellen Forschungsergebnissen in Mausmodellen fand sich kein Zusammenhang zwischen der Anzahl oder der r{\"a}umlichen Anordnung regulatorischer T-Zellen und AIRE+ -Zellen. Myoidzellen nahmen mit zunehmendem Alter ebenfalls ab. Ihre Rolle in der Entstehung der Myasthenie ist bei Patienten mit early und late onset wahrscheinlich unterschiedlich; die abnehmende Zahl an Myoidzellen stellt m{\"o}glicherweise vor allem bei Patienten mit late onset einen Risikofaktor dar.}, subject = {Thymus}, language = {de} }