@phdthesis{JakobRodamer2014,
  author    = {Jakob-Rodamer, Verena},
  title     = {Development and validation of LC-MS/MS methods to determine PK/PD parameters of anti-infectives},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-109215},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {In the present thesis the development and validation of bioanalytical LC-MS/MS methods for the quantification of erythromycin A, erythromycin ethylsuccinate, roxithromycin, clarithromycin, 14 hydroxy clarithromycin, flucloxacillin, piperacillin and moxifloxacin in human plasma and human urine (piperacillin) is introduced. All methods were applied to analyze human plasma and urine samples from clinical trials and therefore, have been validated according to international guidelines. The methods were reliable in these studies and fulfilled all regulatory requirements known at the time of the study conduct. Moreover, the validation data of the macrolides were compared on three different mass spectrometers (API III Plus, API 3000™, API 5000™). The new innovations in the ion source (horizontal versus vertical electrospray), the ionpath (skimmer, QJet) and the diameter of the orifice resulted in better sensitivity and a larger linearity range for the majority of the analytes. Sensitivity was improved up to a factor of 12 (for clarithromycin) between API III Plus to API 3000™ and up to a factor of 8 (for erythromycin and roxithromycin) between API 3000™ and API 5000™, keeping the accuracy and precision data at about the same level. The high sensitivity was a benefit for example for the flucloxacillin study, because concentrations from all subject samples were detectable up to approximately eight half-lives, i.e. no concentrations needed to be reported below the quantification limit. Also the linearity range were extended from two orders of magnitude to up to four orders of magnitude, which increases the likelihood to allow to analyze all samples from a pharmacokinetic study in the same run. This is especially useful if a large concentration range needs to be analysed, for example, if the method shall be applied in an ascending dose study. Then, all low concentrations from the beginning of the study can be determined, as well as all high concentrations, without the need to dilute and analyse single samples repeatedly. The pharmacokinetic data were compared to previously reported literature data and correlated graphically with MIC values of popular microorganisms which might be a starting point for further PK/PD investigations. The PK/PD theory is a very helpful tool for prediction of the efficacy of given drugs against certain micro-organisms. Depending on the pharmacodynamic processes, e. g. the mode of action, three classes of drugs have been identified. In the same way this applies to adverse effects, which need to be minimised by reducing plasma concentrations. These coherences are not well-investigated, yet, and are not discussed further in this thesis. Still, a lot of research has to be done in this interdisciplinary field to minimise uncertainty in single values, like an AUC/MIC. These include: Improve accuracy and precision of bioanalytical methods determining total and free concentration data in biological matrices for calculation of AUC and Cmax These parameters are related to the MIC in pharmacodynamic considerations. Since the determination of the MIC often underlies significant variations and also differences between microbiological laboratories, the determination of concentrations of anti-infectives is particular important, being achievable by scientific exact techniques. Finally, from the volume of distribution of antibiotics can be used to derive information about intracellular concentrations and effectivity of antiinfectives.},
  subject      = {Antimikrobieller Wirkstoff},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Heinig2014,
  author    = {Heinig, Katja},
  title     = {Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung von posttranslationalen Modifikationen bei pathologischen freien Antik{\"o}rperleichtketten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-108275},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {In dieser Arbeit wurden die freien Antik{\"o}rperleichtketten von Patienten mit Multiplen Myelom bzw. mit Multiplen Myelom und AL-Amyloidose auf das Auftreten von posttranslationalen Modifikationen mit der Hilfe von MS/MS-Spektren analysiert. Beide Patientengruppen zeichnen sich durch eine {\"U}berproduktion von monoklonalen Antik{\"o}rperleichtketten aus, wobei diese bei Multiplen-Myelom-Patienten l{\"o}slich und bei den AL-Amyloidose-Patienten unl{\"o}slich vorliegen. Zur Vorbereitung der massenspektrometrischen Messungen wurden die FLCs aus den Knochenmarks{\"u}berst{\"a}nden der Patienten isoliert. Daf{\"u}r wurde eine 2-Schritt-Aufarbeitungsmethode etabliert, bei der mit Hilfe einer Affinit{\"a}tschromatographie und einer pr{\"a}parativen SDS-PAGE die FLCs aus einer komplexen Matrix isoliert werden konnten. Mit Hilfe der MS/MS-Messungen konnten Sulfonierungen, Methylierungen, Acetylierungen, Oxidierungen und eine O-Glykosylierung identifiziert werden. In einem weiteren Schritt wurden mittels Varianzanalyse Sequenzen von AL-Amyloidose- und Multiplen-Myelom-Patienten sowie von Kontrollprobanten hinsichtlich der Verteilung der Aminos{\"a}uren statistisch analysiert. Dabei konnten mehrere Stellen im FLC-Peptid identifiziert werden, an denen bestimmte Aminos{\"a}uren in Abh{\"a}ngigkeit der Subgruppe signifikant unterschiedlich vorkommen.},
  subject      = {Massenspektrometrie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Werner2014,
  author    = {Werner, Katharina Julia},
  title     = {Adipose Tissue Engineering - In vitro Development of a subcutaneous fat layer and a vascularized adipose tissue construct utilizing extracellular matrix structures},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-104676},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Each year millions of plastic and reconstructive procedures are performed to regenerate soft tissue defects after, for example, traumata, deep burns or tumor resections. Tissue engineered adipose tissue grafts are a promising alternative to autologous fat transfer or synthetic implants to meet this demand for adipose tissue. Strategies of tissue engineering, especially the use of cell carriers, provide an environment for better cell survival, an easier positioning and supplemented with the appropriate conditions a faster vascularization in vivo. To successfully engineer an adipose tissue substitute for clinical use, it is crucial to know the actual intended application. In some areas, like the upper and lower extremities, only a thin subcutaneous fat layer is needed and in others, large volumes of vascularized fat grafts are more desirable. The use and interplay of stem cells and selected scaffolds were investigated and provide now a basis for the generation of fitted and suitable substitutes in two different application areas. Complex injuries of the upper and lower extremities, in many cases, lead to excessive scarring. Due to severe damage to the subcutaneous fat layer, a common sequela is adhesion formation to mobile structures like tendons, nerves, and blood vessels resulting in restricted motion and disabling pain [Moor 1996, McHugh 1997]. In order to generate a subcutaneous fat layer to cushion scarred tissue after substantial burns or injuries, different collagen matrices were tested for clinical handling and the ability to support adipogenesis. When testing five different collagen matrices, PermacolTM and StratticeTM showed promising characteristics; additionally both possess the clinical approval. Under culture conditions, only PermacolTM, a cross-linked collagen matrix, exhibited an excellent long-term stability. Ranking nearly on the same level was StratticeTM, a non-cross-linked dermal scaffold; it only exhibited a slight shrinkage. All other scaffolds tested were severely compromised in stability under culture conditions. Engineering a subcutaneous fat layer, a construct would be desirable with a thin layer of emerging fat for cushioning on one side, and a non-seeded other side for cell migration and host integration. With PermacolTM and StratticeTM, it was possible to produce constructs with ASC (adipose derived stem cells) seeded on one side, which could be adipogenically differentiated. Additionally, the thickness of the cell layer could be varied. Thereby, it becomes possible to adjust the thickness of the construct to the surrounding tissue. In order to reduce the pre-implantation time ex vivo and the costs, the culture time was varied by testing different induction protocols. An adipogenic induction period of only four days was demonstrated to be sufficient to obtain a substantial adipogenic differentiation of the applied ASC. Thus, seeded with ASC, PermacolTM and StratticeTM are suitable scaffolds to engineer subcutaneous fat layers for reconstruction of the upper and lower extremities, as they support adipogenesis and are appropriately thin, and therefore would not compromise the cosmesis. For the engineering of large-volume adipose tissue, adequate vascularization still represents a major challenge. With the objective to engineer vascularized fat pads, it is important to consider the slow kinetics of revascularization in vivo. Therefore, a decellularized porcine jejunum with pre-existing vascular structures and pedicles to connect to the host vasculature or the circulation of a bioreactor system was used. In a first step, the ability of a small decellularized jejunal section was tested for cell adhesion and for supporting adipogenic differentiation of hASC mono-cultures. Cell adhesion and adipogenic maturation of ASC seeded on the jejunal material was verified through histological and molecular analysis. After the successful mono-culture, the goal was to establish a MVEC (microvascular endothelial cells) and ASC co-culture; suitable culture conditions had to be found, which support the viability of both cell types and do not interfere with the adipogenic differentiation. After the elimination of EGF (epidermal growth factor) from the co-culture medium, substantial adipogenic maturation was observed. In the next step, a large jejunal segment (length 8 cm), with its pre-existing vascular structures and arterial/venous pedicles, was connected to the supply system of a custom-made bioreactor. After successful reseeding the vascular structure with endothelial cells, the lumen was seeded with ASC which were then adipogenically induced. Histological and molecular examinations confirmed adipogenic maturation and the existence of seeded vessels within the engineered construct. Noteworthily, a co-localization of adipogenically differentiating ASC and endothelial cells in vascular networks could be observed. So, for the first time a vascularized fat construct was developed in vitro, based on the use of a decellularized porcine jejunum. As this engineered construct can be connected to a supply system or even to a patient vasculature, it is versatile in use, for example, as transplant in plastic and reconstruction surgery, as model in basic research or as an in vitro drug testing system. To summarize, in this work a promising substitute for subcutaneous fat layer reconstruction, in the upper and lower extremities, was developed, and the first, as far as reported, in vitro generated adipose tissue construct with integrated vascular networks was successfully engineered.},
  subject      = {Tissue Engineering},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Mandel2014,
  author    = {Mandel, Philipp},
  title     = {Entstehung von oxidativen Stressmarkern in DNA und RNA nach der Behandlung mit den Hormonen Angiotensin II und Aldosteron in vitro und in vivo : Vergleich von drei Analysemethoden zum Nachweis von 8-Oxo-2'-desoxyguanosin in LLC-PK1-Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-111190},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {The detection of oxidative stress markers has gained increasing importancy in the early investigation of diseases like diabetes, cancer or hypertension. 8 oxo 2' deoxyguanosine (8-oxodG) is the main marker, which is used for the intracellular detection of oxidative stress levels. However, the oxidative stress markers 8 oxoguanine (8-oxoGua), a product of the DNA base excision repair and 8 oxoguanosine (8-oxoGuo), a marker for oxidative damaged RNA have received less attention up to now. The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) plays an important role in the regulation processes of the blood pressure system. During hypertension angiotensin II (Ang II) and aldosterone (Aldo) are released in high concentrations over a longer period leading to non-physiological effects of the RAAS hormones. Subsequently, an increase of the intracellular oxidative stress level in kidney cells can be measured. The aim of this thesis is the in vitro and in vivo detection of the oxidative damage in DNA and RNA by measuring oxidative stress markers, especially 8-oxodG which is triggered by Ang II and Aldo. In vitro experiments were carried out in LLC-PK1, a cell line originated from porcine kidney cells. It could been shown that Ang II and Aldo led to a dose-dependent increase of DNA damage in the cells. A time-dependent increase was detected for the first 30 minutes of the treatment. For the rest of the experimental set up (4 h) the level of detected DNA damage remained constant. The FPG comet assay and the immunocytochemical staining showed a significant increase of 8-oxodG in the cells, whereas the HPLC-MS/MS measurement only detected a small increase of 8-oxodG in the DNA. The FPG enzyme, which recognises also other oxidized purines besides 8-oxodG, which led to an overestimation of 8-oxodG in the comet assay. Also, the 8 oxodG antibody, which was used in the immunocytochemical analysis, detected higher amounts of 8-oxodG most likely due to its side reactions with other oxidized DNA structures. One of the main advantages of the last mentioned methods is the direct measurement in damaged cells, whereas the HPLC-MS/MS requires an isolation of the DNA. During this isolation process the oxidative stress markers can be oxidized and the detection can become imprecise. The main purpose of the in vivo experiments was the detection of the oxidative stress marker 8-oxoGua, 8-oxodG and 8-oxoGuo in the urine of test animals. The treatment of C57BL/6 mice and Sprague Dawley (SD) rats with the RAAS hormones led to an increase of the blood pressure, higher DNA damage due to oxidative stress as well as an increased excretion rate of oxidative stress markers. The inhibition of the angiotensin II type 1- or mineralocorticoid receptor and a mutation of the AT1a gene could show, that the DNA damage is independent from the hypertension. In addition, it was shown that the NOX4 is not alone responsible for the oxidative stress. Other NADPH oxidases must contribute to the induction of oxidative stress inside the cell. Moreover, the activation of the Nrf2 pathway has an influence on the effect of Aldo in SD rats. The excretion rate of the oxidative stress markers in the 20 h urine of the treated animals showed how the equilibrium between the DNA repair and the oxidative stress level was changing over time. The measurement of 8-oxoGuo became more and more popular, because up to the fact that 80 \% of the DNA is translated into RNA. Overall, the detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo is feasible for monitoring the disease or the healing process, because the measurement is non-invasive. The detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo in nucleic acids is a first step into the field of basic research methods, because it reveals a snapshot of the nucleic acid damage in the cell at a specific time point. Usually, there will be an overestimation of the oxidative stress marker resulting from the analytical method. Although, it is possible to detect an underestimation of oxidative stress markers in tissue samples if not all cell types are damaged equally. Therefore, a primary goal should be the detection of a stable oxidation product of guanine to insure a reliable detection strategy and for a better understanding of the equilibrium of DNA oxidation and repair.},
  subject      = {Oxidativer Stress},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pfenning2014,
  author    = {Pfenning, Carolin},
  title     = {Untersuchungen zum genotoxischen Wirkmechanismus des Mykotoxins Patulin: Reaktivit{\"a}t gegen{\"u}ber DNA-Basen unter dem Einfluss von Glutathion},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-109599},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Als Sekund{\"a}rmetabolit verschiedener Schimmelpilze geh{\"o}rt das Mykotoxin Patulin zu den als Kanzerogene diskutierten Lebensmittelinhaltsstoffen nat{\"u}rlichen Ursprungs und kommt vor allem in braunfaulen {\"A}pfeln und daraus verarbeiteten Lebensmitteln vor. Trotz zahlreicher in vitro- und in vivo-Studien zur Genotoxizit{\"a}t von Patulin, ist der Wirkmechanismus f{\"u}r das genotoxische Potential von Patulin weitgehend unbekannt. Um die direkte DNA-Reaktivit{\"a}t von Patulin als m{\"o}gliche genotoxische Wirkung zu betrachten, wurde im ersten Teil der Arbeit zun{\"a}chst die direkte Reaktion von Patulin mit DNA-Basen untersucht. Nach Inkubation von Patulin mit der DNA-Base Adenin wurden mittels (U)HPLC-Massenspektrometrie im Vollscan-Modus insgesamt f{\"u}nf Addukte von Patulin mit Adenin identifiziert. Anhand der Fragmentierungsmuster ohne und nach Methylierung freier Carboxyl- und Ketogruppen wurde f{\"u}r drei Patulin-Adenin-Addukte eine Ketohexans{\"a}ure-Derivat-Struktur des Patulin-R{\"u}ckgrates und die Bindung des Adenin-Molek{\"u}ls an C6 (C5) abgeleitet. Zus{\"a}tzlich wurden zwei Addukte identifiziert, welche die gleiche Patulin-Struktur aufwiesen, jedoch je ein Molek{\"u}l Adenin an C5 und C6 gebunden haben. Patulin reagierte folglich mit Adenin unter Bildung von Mono- und Diaddukten. In Gegenwart von einer zu Adenin {\"a}quimolarer Konzentrationen an Glutathion im Inkubationsansatz wurden mittels (U)HPLC-Massenspektrometrie im Vollscan-Modus die gleichen Patulin-Adenin-Addukte wie in Abwesenheit von Glutathion beschrieben beobachtet. Weiterhin wurden drei bisher unbekannte Glutathion-Patulin-Addukte identifiziert. Es handelte sich, abgeleitet von deren Fragmentierungsverhalten ohne und nach Methylierung, um C6-monosubstituierte Addukte mit Ketohexans{\"a}ure-Derivat-Struktur. In einem dieser Addukte lag das Glutathion-Molek{\"u}l linear gebunden vor, wohingegen in den beiden anderen Addukten die α-Aminogruppe des Glutamins{\"a}urerestes zudem an C1 oder C7 von Patulin verkn{\"u}pft war und es sich somit um 6,1- bzw. 6,7-cyclische Glutathion-Patulin-Addukte handelte. Interessanterweise, wurden sieben weitere Produktpeaks nur bei gleichzeitiger Anwesenheit beider Nukleophilkomponenten im Inkubationsansatz gebildet, was folglich auf gemischte Addukte aus Patulin, Glutathion und Adenin hinwies. Das Fragmentierunsmuster best{\"a}tigte die Anwesenheit von Adenin und Glutathion in der Adduktstruktur und zeigte zudem, dass die neuartigen Addukte Regioisomere mit Ketohexans{\"a}ure-Derivat-Struktur waren, die ein 6,7-cyclisch gebundenes Glutathion-Molek{\"u}l aufwiesen. Durch Methylierung der freien Carboxylgruppen innerhalb der Adduktstruktur und Analyse der Molek{\"u}l- und Fragmentionen wurde die Bindung des Adenin-Molek{\"u}ls lokalisiert. In zwei diastereomeren Adduktpaaren war das Adenin-Molek{\"u}l an C1 {\"u}ber eine Amidbindung gebunden. In geringerer Intensit{\"a}t wurden auch zwei diastereomere gemischte Glutathion-Patulin-Adenin-Addukte mit linearem Glutathion-Molek{\"u}l und C1-gebundenem Adenin-Molek{\"u}l identifiziert. Die Summenformeln aller postulierten Strukturen wurden mittels hochaufl{\"o}sender Massenspektrometrie best{\"a}tigt. Zudem wurde ein Reaktionsmechanismus f{\"u}r die Bildung der neuen (Glutathion-)Patulin(-Adenin)-Addukte hergeleitet. Die Bildung gemischter Glutathion-DNA-Basen-Addukte wurde bisher weder f{\"u}r Patulin noch f{\"u}r andere α,β-unges{\"a}ttigte Carbonyle beschrieben. Die Reaktion der Mischadduktbildung unterscheidet sich zudem mechanistisch von den Reaktionen, welche zur Bildung bereits bekannter Glutathion-DNA-Basen-Addukte von 1,2-Dihaloalkanen, sowie 1,2,3,4-Diepoxybutan f{\"u}hren. ...},
  subject      = {Patulin},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schmalbach2014,
  author    = {Schmalbach, Katja},
  title     = {Identification of factors influencing 17beta-estradiol metabolism in female mammary gland},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-109300},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {The female sex hormone 17beta-estradiol, produced naturally in the body, seems to play an important role in the development of breast cancer, since (i) it can be activated to reactive metabolites, which are known to damage DNA and (ii) the stimulation of the estrogen receptor alpha by 17beta-estradiol enhances cell proliferation. Both processes together increase mutation frequency and subsequently lead to transformation of epithelial cells. Therefore, the aim of this work was to characterize the influence of polymorphisms and lifestyle factors on 17beta-estradiol metabolism in normal mammary gland tissue. [...] In sum, the tissue specific 17beta-estradiol metabolism was described in mammary gland tissue homogenate, whereas differences in proliferation of epithelial cells were only reflected in isolated epithelial cells. Factors associated with breast cancer risk (age, BMI and age-related changes in mammary gland morphology) were shown to affect 17beta-estradiol tissue levels. The 17beta-estradiol mediated genotoxicity was evaluated using bioinformatically calculated DNA adduct fluxes, which were predominately influenced by individual mRNA patterns rather than individual genotypes and (DNA adduct fluxes) were correlated with known breast cancer risk factors (age, parity, BMI and polymorphism of glutathione-S-transferase theta 1).},
  subject      = {Milchdr{\"u}se},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Bank2014,
  author    = {Bank, Stephanie},
  title     = {LC-ESI und MALDI-Massenspektrometrische Analyse nativer und derivatisierter Zucker und Glykane},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-106085},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Glykane sind weitverbreitete Biomolek{\"u}le, die meist in Form von Glykokonjugaten, wie beispielsweise als Glykoproteine oder Glykolipide, vorliegen. Durch die Interaktion von Glykanen mit Glykan-bindenden Proteinen wird eine Vielzahl an biochemischen Prozessen ausgel{\"o}st, sowohl physiologischer, als auch pathologischer Art. Die Aufkl{\"a}rung der beteiligten Glykanstrukturen ist daher nicht nur wichtig f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis dieser Prozesse, sondern kann auch Hinweise auf verschiedene Erkrankungen geben. Die Identifizierung von Glykanstrukturen kann {\"u}ber verschiedene Wege erfolgen. In der instrumentellen Analytik spielt dabei vor allem die ESI- und MALDI Massenspektrometrie eine wichtige Rolle, da diese sowohl f{\"u}r Detektion, als auch Fragmentierung großer Biomolek{\"u}le geeignet sind. Um die Analyse von Zuckern mittels chromatographischer und massenspektrometrischer Methoden zu erleichtern, werden h{\"a}ufig Derivatisierungsreagenzien eingesetzt. Diese verringern die Polarit{\"a}t der Zucker und erleichtern die Detektion durch das Einbringen von Chromo- oder Fluorophoren. Zur Derivatisierung am reduzierenden Terminus von Glykanen und Zuckern eignen sich vor allem Aminierungsreagenzien oder Hydrazide. Hydrazide haben gegen{\"u}ber anderen Derivatisierungsreagenzien den Vorteil einer einfachen, salzfreien Umsetzung, aus der ein stabiles Derivat mit geschlossenem terminalen Zuckerring hervorgeht. F{\"u}r die vorliegende Arbeit wurde die Derivatisierung mit den neuen Hydrazid Reagenzien INH und BINH, sowie dem bereits von Dr. P. Kapkov{\´a} bearbeiteten BACH untersucht. Als Vergleich dienten die underivatisierten Kohlenhydrate, wie auch das standardm{\"a}ßig eingesetzte Aminierungsreagenz 2-AB. Dabei sollte das Ver-halten verschiedener Zucker und Glykane in Bezug auf chromatographische Trennung, Signalintensit{\"a}t und Fragmentierung analysiert werden. Zun{\"a}chst wurde die Umsetzung von Mono-, Di- und Trisacchariden mit den neuen Derivatisierungsreagenzien INH und BINH optimiert. Dadurch konnte bei beiden Substanzen die komplette Umsetzung der Zucker in ihre Derivate gew{\"a}hrleistet werden. Auch die Derivatisierung mit Hilfe der Mikrowelle konnte bei INH erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden. Auf diese Weise ließ sich die Reaktionszeit, im Vergleich zu den im Thermo-mixer® ben{\"o}tigten 90 Minuten, auf 20 Minuten verk{\"u}rzen. Aufgrund der großen Men-gen an Zucker und Derivatisierungsreagenz, die f{\"u}r die Umsetzung in der Mikrowelle n{\"o}tig sind, war der Versuch jedoch nur f{\"u}r INH geeignet. Im n{\"a}chsten Schritt wurde das Trennverhalten der verschiedenen Mono-, Di- und Tri-saccharid-Derivate auf RP-C18- und HILIC-Phasen untersucht. Bei den Monosaccha-riden konnte durch keines der Derivate eine vollst{\"a}ndige Trennung auf einer der Pha-sen erreicht werden. Das beste Ergebnis wurde durch INH auf der HILIC-S{\"a}ule erzielt, doch auch dort konnten die Epimere Glucose, Mannose und Galactose nicht vollst{\"a}n-dig separiert werden. Die Trennung der Disaccharide Maltose, Cellobiose und Lactose konnte auf der HILIC-Phase mit allen Derivaten außer BACH erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden, auf der RP-C18 erwies sich dagegen nur 2-AB als geeignet. Bei den Trisac-chariden 3'SLN und 6'SLN konnten sowohl underivatisierte Zucker, als auch s{\"a}mtliche Derivate mittels HILIC getrennt werden. Auch auf der C18-Phase war eine Trennung der BINH, BACH und 2-AB-Derivate m{\"o}glich. Des Weiteren konnte durch die Derivati-sierungen die Signalintensit{\"a}t gegen{\"u}ber den underivatisierten Zuckern deutlich gesteigert werden. Nach ihrer Trennung lassen sich massegleiche Di- und Trisaccharide anhand des Fragmentierungsmusters unterscheiden. W{\"a}hrend bei den underivatisierten Disaccha-riden Maltose, Cellobiose und Lactose die charakteristischen Fragmente nur schwach sichtbar waren, konnte mit Hilfe der Hydrazide INH, BINH und BACH die Differenzie-rung deutlich erleichtert werden. Die 2-AB-Derivatisierung zeigte dagegen keine Ver-besserung der Fragmentierungseigenschaften. Bei der Unterscheidung der Trisaccharide 3'SLN und 6'SLN waren ebenfalls sowohl underivatisierte, als auch Hydrazid-derivatisierte Zucker im Vorteil gegen{\"u}ber den 2-AB-Derivaten. Die Derivatisierung der N-Glykane von Ribonuclease B und Ovalbumin f{\"u}hrte bei der Analyse mittels MALDI-TOF zu einer deutlichen Steigerung der Sensitivit{\"a}t. Beispiels-weise ließen sich bei den Glykanen des Ovalbumins durch die Derivatisierungen drei zus{\"a}tzliche Strukturen im Vergleich zu den nativen Glykanen detektieren. Auch das Fragmentierungsverhalten der Glykane am MALDI-TOF/TOF konnte mit Hilfe der Derivatisierungen erheblich verbessert werden. Besonders die Umsetzung mit BINH f{\"u}hrte zu einer Vielzahl charakteristischer Ringfragmente, wodurch die Aufkl{\"a}rung der verschiedenen Glykanstrukturen deutlich vereinfacht wurde. Auch im Vergleich zu 2 AB zeigten die Hydrazid-Derivate sowohl bessere Fragmentierungseigenschaften, als auch eine einfachere Handhabung f{\"u}r die Messung mittels MALDI-MS. Eine weitere M{\"o}glichkeit zur Identifikation von Glykanstrukturen liegt in der spezifischen Bindung durch Lektine. Diese Untersuchung gibt des Weiteren auch einen Hinweis auf funktionelle Eigenschaften der Glykane. Daf{\"u}r wird die hohe Affinit{\"a}t von Biotin-haltigen Derivatisierungsreagenzien zu Avidin und Streptavidin genutzt. Nach der auf diese Weise erfolgten Immobilisierung der Glykane k{\"o}nnen diese mittels spezifischer Lektine nachgewiesen werden. Die Eignung des neuen Derivatisierungsreagen-zes BINH f{\"u}r diese Zwecke wurde anhand eines Glykan-Arrays getestet. Dadurch ließ sich best{\"a}tigen, dass BINH-derivatisierte Glykane und Zucker sowohl in der Lage sind an Streptavidin zu binden, als auch durch Lektine nachgewiesen werden k{\"o}nnen. Daher kann davon ausgegangen werden, dass BINH grunds{\"a}tzlich f{\"u}r den Einsatz in bio-chemischen Methoden geeignet ist. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass die Derivatisierung von Kohlenhydraten mit INH, BINH und BACH zu einer deutlichen Verbesserung der Trenn- und Fragmentierungseigenschaften f{\"u}hrten. Dadurch konnten Identifizierung und Strukturanalyse sowohl von kleinen Zuckern, als auch von Glykanen erleichtert werden. Im Vergleich zu dem Standard-Derivatisierungsreagenz 2-AB zeigten die Hydrazide nicht nur im Bereich der Fragmentierungen, sondern auch durch die einfachere Derivatisierungsreaktion wesentliche Vorteile.},
  subject      = {MALDI-MS},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zilian2014,
  author    = {Zilian, David},
  title     = {Neuartige, empirische Scoring-Modelle f{\"u}r Protein-Ligand-Komplexe und computergest{\"u}tzte Entwicklung von Hsp70-Inhibitoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-105055},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Techniken des computergest{\"u}tzten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schl{\"u}sselrolle im strukturbasierten computergest{\"u}tzen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zun{\"a}chst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergr{\"o}ßern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex besch{\"a}ftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivit{\"a}t klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich {\"u}berlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im n{\"a}chsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinit{\"a}ten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivit{\"a}t der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verf{\"u}gbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repr{\"a}sentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings erm{\"o}glicht. F{\"u}r die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der gr{\"o}ßten, die bisher f{\"u}r die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datens{\"a}tze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten f{\"u}r beide Datens{\"a}tze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datens{\"a}tzen zeigt - ein Ph{\"a}nomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datens{\"a}tze ergab dar{\"u}ber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie {\"u}ber die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor f{\"u}r die protein-abh{\"a}ngigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verl{\"a}ssliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums m{\"o}glich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ans{\"a}tze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' f{\"u}r die SFCscore-Funktionen definieren l{\"a}sst. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zus{\"a}tzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverl{\"a}sslichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgesch{\"a}tzt werden k{\"o}nnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt f{\"u}r weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren f{\"u}r das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur f{\"u}r die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Dom{\"a}nen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zun{\"a}chst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erkl{\"a}rt werden. F{\"u}r die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Dom{\"a}nen-System, dass verschiedene allostere Zust{\"a}nde einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilit{\"a}t auf die Stabilit{\"a}t der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen f{\"u}r das Protein durchgef{\"u}hrt. Diese zeigen, dass das Protein tats{\"a}chlich eine {\"u}berdurchschnittlich hohe Flexibilit{\"a}t aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Dom{\"a}nen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgef{\"u}hrten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise daf{\"u}r gefunden werden, dass die Mutationen, welche die f{\"u}r die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilit{\"a}t des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Dom{\"a}nenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilit{\"a}t auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zuk{\"u}nftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verkn{\"u}pft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt f{\"u}r die Inhibtion des Proteins darstellt.},
  subject      = {Arzneimittelforschung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schneider2014,
  author    = {Schneider, Magdalena},
  title     = {Synthese, Radiomarkierung und biochemische sowie pr{\"a}klinische Evaluierung neuer Aminopeptidase N- und Fibroblasten-Aktivierungs-Protein alpha- affiner Verbindungen f{\"u}r die molekulare Bildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-102562},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Nach einem Myokardinfarkt setzen Wundheilungsprozesse ein, um die Durchblutung wieder herzustellen und nekrotisches Muskelgewebe durch Narbengewebe zu ersetzen. Die Einsprossung neuer Kapillaren vom bestehenden Gef{\"a}ßnetz aus wird als Angiogenese bezeichnet. Das dabei vermehrt exprimierte proteolytische Enzym Aminopeptidase N (APN) spielt eine entscheidende Rolle bei der Einsprossung von Endothelzellen. Beim kardialen Remodeling werden abgestorbene Myozyten mithilfe der Einwanderung von Fibroblasten durch Binde- oder St{\"u}tzgewebe ersetzt, dabei {\"u}bernimmt das Fibroblasten-Aktivierungs-Protein alpha (FAP) Aufgaben bei der Proliferation und Fortbewegung von Fibroblasten. Durch ihre erh{\"o}hte Expression bei den Wundheilungs- und Remodelingprozessen nach einem Herzinfarkt stellen die Metalloprotease APN und die Serinprotease FAP molekulare Targets f{\"u}r die Diagnostik und Therapie dar. Als Diagnosemethode besonders geeignet ist die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), die es erm{\"o}glicht, biochemische Prozesse in Echtzeit im zu untersuchenden Organismus zu visualisieren und zu quantifizieren. Eine als Radiopharmakon oder Tracer bezeichnete biochemische Sonde kann im Falle eines Enzyms dessen radioaktiv markiertes Substrat oder ein Inhibitor sein. Ziel dieser Arbeit war es, spezifische APN- und FAP-affine Tracer f{\"u}r die nicht-invasive Untersuchung der APN- und FAP-Expression mittels PET zu entwickeln und dadurch die Rolle von APN und FAP bei Remodelingprozessen nach Myokardinfarkt besser verstehen bzw. kl{\"a}ren zu k{\"o}nnen. Um die Protease APN mittels PET zu untersuchen, wurden die f{\"u}r APN affine Verbindung NOTA-NGR (Komplexbildner + cyclisches Peptid inkl. Asparagin-Glycin-Arginin) mit dem Positronen-emittierenden Nuklid Gallium-68 (68Ga) markiert. Das Potential von 68Ga-NOTA-NGR als PET-Tracer wurde in vivo am Infarktmodell mittels Kleintier-PET untersucht und mit 68Ga-NOTA-RGD, einem zur Visualisierung des neo-angiogenetischen alphavbeta3-Integrins etablierten Tracer, verglichen. Untersuchungen ergaben, dass 68Ga-NOTA-NGR einen vielversprechenden neuen PET-Tracer f{\"u}r die Visualisierung und Quantifizierung der APN-Expression im Rahmen der Angiogenese nach einem Myokardinfarkt darstellt. 68Ga-NOTA-NGR zeigte eine erh{\"o}hte Aufnahme im Bereich des Myokardinfarkts im Sinne einer vermehrten Angiogenese. Die Aufnahme des Tracers in infarzierten Arealen war quantitativ h{\"o}her als in der Untersuchung mit 68Ga-NOTA-RGD. In Autoradiographie-Experimenten wurde 68Ga-NOTA-NGR ex vivo untersucht. Die Akkumulation von 68Ga-NOTA-NGR im isch{\"a}mischen Bereich war deutlich h{\"o}her als im gesunden Myokard. Der Nachweis der unterschiedlichen Bereiche des Herzens erfolgte mit HE-F{\"a}rbung. Die Expression von APN wurde immunohistochemisch mittels spezifischer Antik{\"o}rper best{\"a}tigt. Zum Vergleich wurden ebenso einige andere an der Angiogenese beteiligte Faktoren untersucht. APN stellte sich auch hier als geeignetes Target zum Nachweis der Angiogenese heraus. Um die Protease FAP mittels PET zu untersuchen, wurden eine Reihe peptidomimetischer Inhibitoren, die die Erkennungssequenz Glycin-Prolin mit einer Carbonitril-Gruppe als elektrophiler Einheit zur kovalent-reversiblen Hemmung des Enzyms enthalten, entwickelt. Ausgehend vom N-Acetylglycin-pyrrolidin-(2S)-carbonitril als Leitstruktur wurden Inhibitoren und Vorstufen zur Radiomarkierung inkl. verschieden substituierter Benzoes{\"a}uren dargestellt. Zus{\"a}tzlich wurden noch bereits bekannte Inhibitoren synthetisiert, die zum Vergleich in den Enzymassays dienten. Drei Verbindungen zeigten gute inhibitorische Wirkung an FAP und außerdem Selektivit{\"a}t gegen{\"u}ber DPP IV. Keine der entwickelten Verbindungen zeigte einen KI-Wert im nanomolaren Bereich, erforderlich f{\"u}r einen potentiellen Tracer zur in-vivo-Visualisierung einer Enzymexpression mittels PET. Um die Inhibitoren mit der besten Hemmung an FAP zum PET-Tracer weiterzuentwickeln, mussten sie mit einem Positronenemitter markiert werden. Die Markierung erfolgte {\"u}ber Isotopenaustausch, bei dem nicht-radioaktives Iod am aromatischen Ring des Precursors durch das radioaktive Iod-124 (124I) substituiert wurde. Es konnten dadurch die radioiodierten Verbindungen 1-(2-[124I]Iodhippurs{\"a}ure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril und 1-(4-[124I]Iod-hippurs{\"a}ure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril synthetisiert werden. Trotz der relativ niedrigen Affinit{\"a}t f{\"u}r FAP wurde das neue 1-(2-[124I]Iodhippurs{\"a}ure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril in Ratten am Infarktmodell mittels Kleintier-PET getestet. Die Lage der isch{\"a}mischen Zone wurde im Anschluss durch HE-F{\"a}rbung bestimmt. In vivo zeigte sich eine nur sehr geringe Aufnahme des Radiopharmakons in der isch{\"a}mischen Zone des Myokards. Damit ist 1-(2-[124I]Iod-hippurs{\"a}ure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril kein f{\"u}r den gew{\"u}nschten Zweck geeigneter PET-Tracer. Nichtsdestotrotz war der Ansatz vielversprechend und es wurde zum ersten Mal ein PET-Tracer dieser Art zur Untersuchung des FAP im Myokardinfarkt hergestellt.},
  subject      = {Positronen-Emissions-Tomographie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hein2014,
  author    = {Hein, Michael},
  title     = {Entwicklung computergest{\"u}tzter Methoden zur Bewertung von Docking-L{\"o}sungen und Entwurf niedermolekularer MIP-Inhibitoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-101585},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Dockingbasierte Ans{\"a}tze z{\"a}hlen zu den wichtigsten Komponenten im virtuellen Screening. Sie dienen der Vorhersage der Ligandposition und -konformation in der Bindetasche sowie der Absch{\"a}tzung der Bindungsaffinit{\"a}t zum Protein. Bis heute stellt die korrekte Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen ein noch nicht vollst{\"a}ndig gel{\"o}stes Problem f{\"u}r Scoringfunktionen dar. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist daher der Entwicklung computergest{\"u}tzter Methoden zur Bewertung von Docking-L{\"o}sungen gewidmet. Der Fokus eines ersten Teilprojektes lag auf der Ber{\"u}cksichtigung der Abs{\"a}ttigung vergrabener Wasserstoffbr{\"u}ckenakzeptoren (HBA) und -donoren (HBD) bei der Bewertung von Docking-L{\"o}sungen. Nicht-abges{\"a}ttigte vergrabene HBA und HBD stellen einen der Bindungsaffinit{\"a}t abtr{\"a}glichen Beitrag dar, der bis dato aufgrund fehlender Struktur- bzw. Affinit{\"a}tsdaten in Scoringfunktionen vernachl{\"a}ssigt wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer detaillierten Untersuchung zur H{\"a}ufigkeit vergrabener nicht-abges{\"a}ttigter HBA und HBD in hochaufgel{\"o}sten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes eine empirische Filterfunktion („vnaHB"-Filterfunktion) entwickelt, die unerw{\"u}nschte Ligandbindeposen erkennt und von der Bewertung mittels Scoringfunktionen ausschließt. Der praktische Nutzen der empirischen Filterfunktion wurde f{\"u}r die Scoringfunktionen SFCscore und DSX anhand vorgenerierter Docking-L{\"o}sungen des Cheng-Datensatzes untersucht. Die H{\"a}ufigkeitsuntersuchung zeigt, dass eine Abs{\"a}ttigung vergrabener polarer Gruppen in Protein-Ligand-Komplexen f{\"u}r eine hochaffine Protein-Ligand-Bindung notwendig ist, da vergrabene nicht-abges{\"a}ttigte HBA und HBD nur selten auftreten. Eine vollst{\"a}ndige Abs{\"a}ttigung durch entsprechende Proteinpartner wird f{\"u}r ca. 48 \% der untersuchten Komplexe beobachtet, ca. 92 \% weisen weniger als drei haupts{\"a}chlich schwache, nicht-abges{\"a}ttigte HBA bzw. HBD (z. B. Etherfunktionen) auf. Unter Einbeziehung von Wassermolek{\"u}len in die H{\"a}ufigkeitsanalyse sind sogar f{\"u}r ca. 61 \% aller Komplexe alle wasserstoffbr{\"u}ckenbindenden Gruppen abges{\"a}ttigt. Im Gegensatz zu DSX werden f{\"u}r SFCscore nach Anwendung der empirischen Filterfunktion erh{\"o}hte Erfolgsraten f{\"u}r das Auffinden einer kristallnahen Pose (≤ 2.0 {\AA} Abweichung) unter den am besten bewerteten Docking-Posen erzielt. F{\"u}r die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::229m) werden Steigerungen dieses als „Docking Power" bezeichneten Kriteriums f{\"u}r die Top-3-Posen (Erfolgsrate f{\"u}r die Identifizierung einer kristallnahen 2.0 {\AA} Pose unter den besten drei Docking-L{\"o}sungen) von 63.1 \% auf 64.2 \% beobachtet. In einem weiteren Teilprojekt wurden repulsive Protein-Ligand-Kontakte infolge sterischer {\"U}berlappungen der Bindungspartner bei der Bewertung von Docking-L{\"o}sungen ber{\"u}cksichtigt. Die ad{\"a}quate Einbeziehung solcher repulsiver Kontakte im Scoring ist f{\"u}r die Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen entscheidend, jedoch aufgrund fehlender Affinit{\"a}ts- bzw. Strukturdaten problematisch. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis des Lennard-Jones-Potentiales des AMBER-Kraftfeldes zun{\"a}chst ein neuer Deskriptor zur Beschreibung repulsiver Kontakte („Clash"-Deskriptor) entwickelt und zur Untersuchung der H{\"a}ufigkeit ung{\"u}nstiger Protein-Ligand-Kontakte in hochaufgel{\"o}sten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes herangezogen. Eine aus der H{\"a}ufigkeitsverteilung abgeleitete empirische Filterfunktion („Clash"-Filterfunktion) wurde anschließend der Bewertung von Docking-L{\"o}sungen des Cheng-Datensatzes mittels der Scoringfunktionen SFCscore und DSX vorgeschaltet, um unerw{\"u}nschte Ligandbindeposen auszuschließen. Die H{\"a}ufigkeitsuntersuchung zeigt, dass vorwiegend schwache repulsive Kontakte in Protein-Ligand-Komplexen auftreten. So werden in 75 \% der Komplexe des Hartshorn-Datensatzes abstoßende Potentiale unter 0.462 kcal/mol beobachtet. Zwar betragen die ung{\"u}nstigen Beitr{\"a}ge pro Komplex f{\"u}r 50 \% aller Strukturen ca. 0.8 kcal/mol bis 2.5 kcal/mol, jedoch k{\"o}nnen diese auf Ungenauigkeiten der Kristallstrukturen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sein bzw. durch g{\"u}nstige Protein-Ligand-Wechselwirkungen kompensiert werden. Die Anwendung der „Clash"-Filterfunktion zeigt signifikante Verbesserungen der Docking Power f{\"u}r SFCscore. F{\"u}r die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::frag) werden Steigerungen der Erfolgsraten f{\"u}r das Auffinden einer kristallnahen Pose unter den drei am besten bewerteten Docking-L{\"o}sungen von 61.4 \% auf 86.9 \% erzielt, was an die Docking Power der bis dato besten Scoringfunktionen aus der Literatur (z. B. DSX, GlideScore::SP) heranreicht (Docking Power (DSX): 92.6 \%; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 \%). Die „Clash"-Filterfunktion allein ist auch der Kombination der „Clash"- und der „vnaHB"-Filterfunktion {\"u}berlegen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde auf die Einbeziehung von Decoy-Daten (Struktur- und Affinit{\"a}tsdaten schwach affiner und inaktiver Liganden) im Zuge der Entwicklung computergest{\"u}tzter Methoden zur Bewertung von Docking-L{\"o}sungen gelegt. Dadurch soll eine ad{\"a}quate Ber{\"u}cksichtigung ung{\"u}nstiger Beitr{\"a}ge zur Bindungsaffinit{\"a}t erm{\"o}glicht werden, die f{\"u}r die Richtigkeit und Zuverl{\"a}ssigkeit ermittelter Vorhersagen essentiell ist. In der vorliegenden Arbeit wurden bin{\"a}re Klassifizierungsmodelle zur Bewertung von Docking-L{\"o}sungen entwickelt, die die Einbeziehung von Decoy-Daten ohne die Verf{\"u}gbarkeit von Affinit{\"a}tsdaten erlauben. Der Random-Forest-Algorithmus (RF), SFCscore-Deskriptoren, der neu entwickelte „Clash"-Deskriptor, und die Decoy-Datens{\"a}tze von Cheng und Huang (Trainingsdaten) bilden die Grundlage des leistungsf{\"a}higsten Klassifizierungsmodells. Der praktische Nutzen des „besten" RF-Modells wurde nach Kombination mit der Scoringfunktion DSX anhand der Docking Power f{\"u}r das Auffinden einer kristallnahen Pose auf Rang 1 am unabh{\"a}ngigen Cheng-/Huang- (Komplexe, die nicht in den Trainingsdaten enthalten sind) und CSAR-2012-Testdatensatz untersucht. Gegen{\"u}ber einer alleinigen Anwendung von DSX werden an beiden Testdatens{\"a}tzen weitere Verbesserungen der Docking Power erzielt (Cheng-/Huang-Testdatensatz: DSX 84.24 \%, RF 87.27 \%; CSAR-2012-Testdatensatz: DSX 87.93 \%, RF 91.38 \%). Das „beste" Modell zeichnet sich durch die zuverl{\"a}ssige Vorhersage richtig-positiver Docking-L{\"o}sungen f{\"u}r einige wenige Komplexe aus, f{\"u}r die DSX keine kristallnahe Ligandkonformation identifizieren kann. Ein visueller Vergleich der jeweils am besten bewerteten RF- und DSX-Pose f{\"u}r diese Komplexe zeigt Vorteile des RF-Modells hinsichtlich der Erkennung f{\"u}r die Protein-Ligand-Bindung essentieller Wechselwirkungen. Die Untersuchung der Bedeutung einzelner SFCscore-Deskriptoren f{\"u}r die Klassifizierung von Docking-L{\"o}sungen sowie die Analyse der Misserfolge nach Anwendung des Modells geben wertvolle Hinweise zur weiteren Optimierung der bestehenden Methode. Hinsichtlich der zu bewertenden Eigenschaften ausgeglichenere Trainingsdaten, Weiterentwicklungen bestehender SFCscore-Deskriptoren sowie die Implementierung neuer Deskriptoren zur Beschreibung bis dato nicht-ber{\"u}cksichtigter Beitr{\"a}ge zur Bindungsaffinit{\"a}t stellen Ansatzpunkte zur Verbesserung dar. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit umfasst die Anwendung dockingbasierter Methoden im Rahmen der Entwicklung neuer Inhibitoren des „Macrophage Infectivity Potentiator"-(MIP)-Proteins von Legionella pneumophila und Burkholderia pseudomallei. Das MIP-Protein von Legionella pneumophila stellt einen wichtigen Virulenzfaktor und daher ein attraktives Zielprotein f{\"u}r die Therapie der Legionellose dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgten systematische Optimierungen des Pipecolins{\"a}ure-Sulfonamides 1, des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM). Nach Hot-Spot-Analysen der Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten f{\"u}r die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgef{\"u}hrt. Die Ergebnisse der Hot-Spot-Analysen zeigen g{\"u}nstige Wechselwirkungsbereiche f{\"u}r Donorgruppen und hydrophobe Substituenten in meta-Position sowie Akzeptorgruppen in para-Position des Benzylringes von 1 auf. Die Einf{\"u}hrung einer Nitrofunktion in para-Position des Benzylringes von 1 (2h) resultiert in einer erh{\"o}hten MIP-Inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), was wahrscheinlich auf die Ausbildung einer zus{\"a}tzlichen Wasserstoffbr{\"u}cke zu Gly116 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Selektivit{\"a}tsverbesserungen gegen{\"u}ber dem strukturverwandten humanen FKBP12-Protein werden insbesondere f{\"u}r das para-Aminoderivat von 1 (2n) erzielt (Selektivit{\"a}tsindex (1): 45, Selektivit{\"a}tsindex (2n): 4.2; mit Selektivit{\"a}tsindex = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring (2s) f{\"u}hrt zu einer verbesserten L{\"o}slichkeit bei vergleichbarer MIP-Inhibition. Das MIP-Protein von Burkholderia pseudomallei spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Melioidose und stellt daher ein attraktives Zielprotein f{\"u}r die Entwicklung neuer Arzneistoffe dar. In der vorliegenden Arbeit erfolgten Optimierungen des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors 1. Ausgehend von einem Strukturvergleich von Burkholderia pseudomallei MIP mit Legionella pneumophila MIP und einer Hot-Spot-Analyse der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten f{\"u}r die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgef{\"u}hrt. Der Strukturvergleich zeigt eine hohe Homologie beider Bindetaschen. Gr{\"o}ßere konformelle {\"A}nderungen werden lediglich f{\"u}r den von Ala94, Gly95, Val97 und Ile98 geformten Bindetaschenbereich beobachtet, was unterschiedliche Optimierungsstrategien f{\"u}r 1 erforderlich macht. G{\"u}nstige Wechselwirkungsbereiche der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche finden sich einerseits f{\"u}r Donorgruppen oder hydrophobe Substituenten in para-Position des Benzylringes (Region A) von 1, andererseits f{\"u}r Akzeptor- bzw. Donorgruppen in para- bzw. meta-/para-Position des Trimethoxyphenylringes (Region B). Anhand von Docking-Studien konnten sowohl f{\"u}r Variationen in Region A als auch in Region B aussichtsreiche Kandidaten identifiziert werden. Initiale MIP-Inhibitionsmessungen der bis dato synthetisierten Derivate deuten auf erh{\"o}hte Hemmungen im Vergleich zu 1 hin. Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring f{\"u}hrt auch hier zu vergleichbarer MIP-Inhibition bei verbesserter L{\"o}slichkeit. Derzeit sind weitere Synthesen und Testungen aussichtsreicher Liganden durch die Kooperationspartner geplant. Die Ergebnisse der Inhibitionsmessungen sollen deren Nutzen als MIP-Inhibitoren aufzeigen und wertvolle Informationen f{\"u}r weitere Zyklen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns liefern.},
  subject      = {Arzneimitteldesign},
  language  = {de}
}