@phdthesis{Heubeck2003,
  author    = {Heubeck, Christian},
  title     = {Zusammensetzung eukaryotischer RNase P aus pflanzlichen Zellkernen und Plastiden},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7757},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Ribonuklease P (RNase\&\#61472;P) ist eine essentielle Endonuklease, welche die 5'-Flanke von pre-tRNAs entfernt. In nahezu allen bisher untersuchten Organismen und Organellen besteht das Holoenzym aus einer RNA-Untereinheit und einer Protein-Komponente. Nur die Zusammensetzung des Enzyms in den Chloroplasten und Mitochochondrien mehrzelliger Eukaryonten scheint unklar. Eine RNA-Untereinheit konnte hier bis jetzt nicht nachgewiesen werden. Um den Aufbau der RNase\&\#61472;P aus photosynthetischen Organellen zu kl{\"a}ren, wurde die RNase\&\#61472;P aus den Cyanellen von Cyanophora paradoxa untersucht. Das Enzym enth{\"a}lt eine RNA, welche im Gegensatz zu bakteriellen RNase\&\#61472;P-RNAs nicht in der Lage ist, die pre-tRNA-Prozessierung unter in\&\#61472;vitro-Bedingungen durchzuf{\"u}hren, obwohl sie eindeutig dem cy- anobakteriellen Strukturtyp zugeordnet werden kann. Die Cyanellen-RNase\&\#61472;P-RNA aus C.\&\#61472;paradoxa kann mit rekombinanten cyanobakteriellen RNase\&\#61472;P-Proteinen zum katalytisch aktiven Holoenzym rekonstituiert werden. Das Einf{\"u}hren der hochkonservierten Nukleotide G22 und G213 in die Cyanellen-RNase\&\#61472;P-RNA f{\"u}hrt nicht zu signifikanten Unterschieden im Prozessierungsverhalten des heterologen Holoenzyms. Durch Mutationsanalyse einer cyanobakteriellen RNase\&\#61472;P-RNA an den entsprechenden Positionen wurde gezeigt, dass diese Konsensus-Nukleotide keinen essentiellen Einfluss auf die Katalyse aus{\"u}ben. Die funktionelle Charakterisierung der RNase\&\#61472;P-RNA aus den Cyanellen von G. nostochinearum best{\"a}tigt die Ergebnisse f{\"u}r C.\&\#61472;paradoxa. Die RNA besitzt keine Ribozym-Aktivit{\"a}t und kann mit cyanobakteriellen RNase\&\#61472;P-Proteinen zum aktiven Holoenzym rekonstituiert werden. Um zu kl{\"a}ren, ob die fehlende Ribozym-Aktivit{\"a}t der Cyanellen-RNase\&\#61472;P-RNAs auf das Fehlen der F{\"a}higkeit zur Substratbindung zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist, wurden zirkular permutierte Cyanellen-RNase P-RNAs mit kovalent verkn{\"u}pften pre-tRNAs konstruiert. Entsprechende Transkripte weisen keine Ribozymaktivit{\"a}t auf, k{\"o}nnen aber mit cyanobakteriellem RNase\&\#61472;P-Protein zum aktiven Komplex rekonstituiert werden. Die Reaktion l{\"a}uft intramolekular, da die Prozessierungsreaktion mit zirkular permutierten Konstrukten nicht durch reife tRNAs gehemmt wird. Zur Identifizierung der Protein-Untereinheit(en) aus Cyanellen-RNase\&\#61472;P wurden polyklonale Antik{\"o}rper gegen das rekombinate RNase\&\#61472;P-Protein aus dem Cyanobakterium Synechocystis PCC 6803 gewonnen. Immunoblots zeigen spezifische Signale im homologen und im Cyanellen-Extrakt, jedoch keinerlei Bindung des RNase P Proteins aus E. coli. Die hohe Spezifit{\"a}t der Antik{\"o}rper f{\"u}r ein Cyanellen-RNase P-Protein konnte durch Immunopr{\"a}zipitations-Experimente best{\"a}tigt werden. Da im vollst{\"a}ndig sequenzierten Cyanellen-Genom keine zu RNase\&\#61472;P-Proteinen homologe Sequenz identifiziert werden kann, muss das Cyanellen RNase\&\#61472;P-Protein im Kern codiert sein. Um die Proteinkomponente der Cyanellen-RNase P zu klonieren, wurde eine cDNA-Expressionsbank f{\"u}r Cyanophora paradoxa angelegt. Versuche zum Immuno-Screening wurden aufgrund eines schlechten Signal\&\#61472;:\&\#61472;Hintergrund-Verh{\"a}ltnisses nicht weiter verfolgt. Durch Screening der cDNA-Expressionsbank mit Cyanellen-RNase\&\#61472;P-RNA konnten zwei Cyanophora-Proteine mit hoher Homologie zu eukaryontischen RNA-bindenden Proteinen identifiziert werden. Das Molekulargewicht des C.\&\#61472;paradoxa-Holoenzyms wurde durch Ultrazentrifugation im Glyceringradienten zu etwa 280\&\#61472;kD bestimmt. RNase\&\#61472;P-Aktivit{\"a}t und RNase\&\#61472;P-RNA-Untereinheit korrelieren im Gradienten mit einem 30\&\#61472;kD-Protein, welches im Immunoblot mit cyanobakteriellen RNase\&\#61472;P-Protein-Antik{\"o}rpern spezifisch erkannt wird. Das Cyanellen-Holoenzym zeigt in wesentlichen Merkmalen eine {\"U}bereinstimmung mit eukaryontischer RNase\&\#61472;P. Dennoch scheint die katalytische Aktivit{\"a}t in der RNA-Untereinheit lokalisiert zu sein, da die native, relativ große Cyanellen-Protein-Untereinheit ohne Funktionsverlust gegen sehr viel kleinere cyanobakterielle Protein-Untereinheiten ausgetauscht werden kann. Die Protein-Komponente der Cyanellen RNase\&\#61472;P scheint deshalb trotz ihrer Gr{\"o}ßenzunahme im Vergleich zu ihren evolutiven, bakteriellen Vorfahren, keine weiteren essentiellen Aufgaben {\"u}bernommen zu haben. Eukaryontische RNase\&\#61472;P ist aus bis zu zehn Protein-Untereinheiten aufgebaut. Durch Genom-Analyse konnte in Arabidopsis thaliana das potentielle RNase\&\#61472;P-Protein Pop1 identifiziert werden. Mit der experimentell best{\"a}tigten Identit{\"a}t dieses Proteins wurde erstmals ein RNase\&\#61472;P-Protein aus A.\&\#61472;thaliana eindeutig identifiziert. Durch spezifische Antik{\"o}rper gegen dieses Protein kann RNase\&\#61472;P-Aktivit{\"a}t aus Weizen-Extrakt pr{\"a}zipitiert werden.},
  subject      = {Plastide},
  language  = {de}
}