@article{MuehlenbergHovestadt1992, author = {M{\"u}hlenberg, Michael and Hovestadt, Thomas}, title = {Das Zielartenkonzept}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-30140}, year = {1992}, abstract = {No abstract available}, language = {de} } @article{Hovestadt1990, author = {Hovestadt, Thomas}, title = {Die Bedeutung zuf{\"a}lligen Aussterbens f{\"u}r die Naturschutzplanung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-30136}, year = {1990}, abstract = {No abstract available}, language = {de} } @article{DandekarArgos1992, author = {Dandekar, Thomas and Argos, P.}, title = {Potential of genetic algorithms in protein folding and protein engineering simulations}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29974}, year = {1992}, abstract = {No abstract available}, language = {de} } @article{DandekarArgos1994, author = {Dandekar, Thomas and Argos, P.}, title = {Folding the main chain of small proteins with the genetic algorithm}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29847}, year = {1994}, abstract = {No abstract available}, language = {de} } @misc{DandekarDandekar1994, author = {Dandekar, Thomas and Dandekar, G.}, title = {Schlange als Attribut des {\"A}skulap}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29822}, year = {1994}, abstract = {No abstract available}, language = {de} } @misc{Dandekar1990, author = {Dandekar, Thomas}, title = {Hefezellen - ein gutes Modell f{\"u}r h{\"o}here Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29726}, year = {1990}, abstract = {No abstract available}, language = {de} } @phdthesis{Endter2008, author = {Endter, J{\"o}rg-Michael}, title = {Mechanismen der Elektropermeabilisierung und Elektrofusion eukaryotischer Zellen und Protoplasten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29647}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In dieser Arbeit konnten grundlegende Erkenntnisse {\"u}ber die Wirkung elektrischer Felder auf Membranen von eukaryotischen Zellen gewonnen werden. Dieses Wissen erm{\"o}glichte eine detaillierte Aufkl{\"a}rung der Mechanismen der Elektropermealisierung und der Elektrofusion. Maßgeblich hierf{\"u}r war die dielektrische Analyse von Pflanzen- bzw. Hefeprotoplasten durch umfassende Messungen auf Basis der Elektrorotationsmethode. Mithilfe dieser Methode wurden die elektrischen Eigenschaften wie die fl{\"a}chenspezifische Membrankapazit{\"a}t und die innere Leitf{\"a}higkeit von Pichia pastoris Protoplasten ermittelt. Die Kenntnis dieser Zelleigenschaften verhalf dazu, einerseits das Sammelfeld im Hinblick auf seine Feldst{\"a}rke und Frequenz einzustellen. Damit wurde ein optimaler Kontakt der Zellmembranen w{\"a}hrend der Fusion erm{\"o}glicht und st{\"o}rende Einfl{\"u}sse, wie beispielsweise die Multizellrotation, minimiert. Anderseits wurde der Durchbruchpuls bez{\"u}glich der Pulsl{\"a}nge und der Feldst{\"a}rke den Anforderungen f{\"u}r die Elektrofusion der relativ kleinen Protoplasten angepasst. In Folge dessen war es m{\"o}glich, ein Protokoll zur Herstellung von Riesenzellen aus Pichia pastoris Protoplasten zu erstellen. Diese Erkenntnisse sind besonders interessant, da der Einsatz von Riesenzellen die Erforschung der aktiven elektrischen Eigenschaften von Zellmembranen durch kombinierte Anwendung intrazellul{\"a}rer Mikroelektroden mit etablierten elektrophysiologischen Techniken erm{\"o}glicht. Als Beispiele seien hier „current-„ und „voltage-clamp", „patch clamp" sowie die Ladungspulsmethode genannt. Die erhebliche Vergr{\"o}ßerung der Membranoberfl{\"a}che bei Riesenzellen f{\"u}hrt zu einer Erh{\"o}hung der Gesamtzahl von Membranproteinen wie beispielsweise Transmembrankan{\"a}le. Daher kann erwartet werden, dass kanalvermittelte Signale deutlich st{\"a}rker ausfallen und ihre Untersuchungen erleichtert werden. Die komplexen Ergebnisse der Elektrorotation von vakuolisierten BY-2 Protoplasten konnten sehr genau mit Hilfe des Dreischalenmodells erkl{\"a}rt werden, welches die Struktur der pflanzlichen Zellen, insbesondere die zwei seriell geschalteten Kapazit{\"a}ten des Plasmalemmas und des Tonoplasten, ber{\"u}cksichtigt. Die Anwendung dieses Modells erlaubte eine getrennte Berechnung der Potentialprofile {\"u}ber das Plasmalemma (Up) und den Tonoplasten (Ut), welche durch einen kurzen Gleichstrompuls induziert wurden. Anhand dieser Potentialprofile war es m{\"o}glich, die Abh{\"a}ngigkeit des Ca2+-Einstromes in das Cytoplasma aus der Vakuole oder dem extrazellul{\"a}ren Raum vom applizierten elektrischen Feld und der externen Leitf{\"a}higkeit zu erkl{\"a}ren. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Aufladung des Plasmalemmas und des Tonoplasten und daraus folgend der elektrischen Membrandurchbruch der jeweiligen Membran stark von der externen Leitf{\"a}higkeit abh{\"a}ngen. Die Tatsache, dass elektrische Pulssequenzen von niedriger Intensit{\"a}t einen erhebliche Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration bewirken k{\"o}nnen und sich durch Modulation ihrer Amplitude reizspezifische Ca2+-Signaturen simulieren lassen, er{\"o}ffnet eine schonende M{\"o}glichkeit zur Untersuchung von Ver{\"a}nderungen des cytosolischen Ca2+-Spiegels unabh{\"a}ngig von persistierenden exogenen Stimuli. Da Ca2+ in Pflanzen ein wichtiger „second messenger" ist, bieten sich elektrische Felder als neues wirksames Werkzeug zur Kontrolle zellinterne Signalwege f{\"u}r die Grundlagenforschung sowie f{\"u}r Anwendungen in der Biotechnologie, wie beispielsweise Elektrotransfektion und -fusion, an. Als wichtige Konsequenz kann aus den hier gewonnen Erkenntnissen gezogen werden, dass Behandlungen pflanzlicher Zellen mit elektrischen Feldern in niedrig leitende Medien durchgef{\"u}hrt werden, um eine minimale Freisetzung von Ca2+ und anderen Inhaltstoffen aus der Vakuole zu gew{\"a}hrleisten.}, subject = {Elektrofusion}, language = {de} } @phdthesis{Gebhardt2008, author = {Gebhardt, Susanne}, title = {Expression, biochemische Charakterisierung und biologische Analyse des CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29565}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Der Connective tissue growth factor, CTGF, ist ein mit der EZM assoziiertes Protein, das diverse zellul{\"a}re Aktivit{\"a}ten, einschließlich Adh{\"a}sion, Proliferation, Differenzierung und Migration, besitzt. Die umfassenden biologischen Eigenschaften des CTGF in verschiedenen Zelltypen spiegelt seine F{\"a}higkeit, eine Vielfalt an Zelloberfl{\"a}chenmolek{\"u}len (HSPGs, Integrine, …) als auch andere bioaktive Molek{\"u}le (BMP-4, TGF-\β1, ...) zu binden, wieder. Eine ver{\"a}nderte CTGF-Expression ist mit mehreren fibrotischen Erkrankungen assoziiert und CTGF selbst stimuliert die Entstehung und Progression fibrotischer Defekte. Genauere Informationen {\"u}ber den Einfluss des CTGF auf die Genexpression von Zellen waren bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde zun{\"a}chst humanes CTGF in HEK-Zellen exprimiert und anschließend in mehreren chromatographischen Schritten aufgereinigt. Die biologische Charakterisierung zeigte, dass das rekombinante Protein mit BMP-2 in Oberfl{\"a}chenplasmonresonanzstudien und auf Zellbasis interagiert. Desweiteren konnte auch eine Interaktion mit Balb3T3-Zellen festgestellt werden. Die biologische Aktivit{\"a}t des Proteins wurde durch Proliferationsassays mit einer Endothelzelllinie und prim{\"a}ren Fibroblasten des menschlichen Tenon best{\"a}tigt. Das reine rekombinante Protein wurde f{\"u}r Genexpressionsanalysen an humanen prim{\"a}ren Fibroblasten des Tenon eingesetzt. Ergebnisse dieser Studie der Genexpression von HTF von drei unabh{\"a}ngigen Spendern zeigten, dass CTGF verschiedene biologische und physiologische Prozesse beeinflusst. Bekannte proliferatorische Eigenschaften und der Einfluss auf die EZM konnten best{\"a}tigt werden. Neben den bisher bekannten Funktionen der durch CTGF verursachten Effekte bei der Wundheilung, die {\"u}berwiegend in der zweiten und dritten Phase der Wundheilung im Bereich der Umstrukturierung der EZM zu finden sind, konnten mehrere regulierte Gene nachgewiesen werden, die eine Rolle in der ersten Phase der Wundheilung, der Inflammation, spielen. Die interessantesten bisher im Zusammenhang mit CTGF noch nicht beschriebenen proinflammatorischen Proteine sind die CXC-Chemokine 1, 2, 6 und 8 sowie IL-6, die in den CTGF behandelten Fibroblasten st{\"a}rker exprimiert waren. CTGF scheint somit eine mannigfaltige koordinierte Rolle in der Wundheilung am Auge, einschließlich Inflammation und EZM-Remodeling sowie m{\"o}glicherweise auch in der Angiogenese und H{\"a}mostase, zu spielen und damit seine Rolle als mulitmodularer Faktor zu best{\"a}tigen.}, subject = {CTGF}, language = {de} } @phdthesis{Riedel2007, author = {Riedel, Alexander}, title = {Untersuchungen zur endogenen MHC-Klasse-II-restringierten Pr{\"a}sentation nukle{\"a}rer Antigene}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25183}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die endogene Pr{\"a}sentation von intrazellul{\"a}ren Antigenen auf Major-Histokompatibilit{\"a}tskomplex Klasse-II (MHC-II) -Molek{\"u}len ist von entscheidender Bedeutung f{\"u}r eine Reihe von immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Pr{\"a}sentationsweges sind aber noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verst{\"a}ndnis der Abl{\"a}ufe zu leisten, die an der endogenen Pr{\"a}sentation nukle{\"a}rer Antigene auf MHC-II-Molek{\"u}len beteiligt sind. Dazu sollte am Beispiel des nukle{\"a}r lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II (NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen Pr{\"a}sentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpr{\"a}sentierenden Zellen untersucht werden. In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR {\"u}ber einen endogenen Pr{\"a}sentationsweg und nicht {\"u}ber die Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molek{\"u}len pr{\"a}sentiert. Durch die Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen Antigenpr{\"a}sentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, wurde nach m{\"o}glichen Eintrittspforten f{\"u}r nukle{\"a}re Proteine in diesen Abbauweg gesucht. F{\"u}r die Autophagie-abh{\"a}ngige Pr{\"a}sentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Aufl{\"o}sung der Kernmembran im Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukle{\"a}rer und zytoplasmatischer Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der Auftrennung antigenexprimierender Zellen nach Zellzyklusphasen konnte eine verst{\"a}rkte Antigenpr{\"a}sentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus immer mehr abnahm. Die Antigenpr{\"a}sentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen korrelierte die Antigenpr{\"a}sentation mit der MHC-II-Oberfl{\"a}chenexpression, die von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine {\"a}hnliche Korrelation von Antigentranskription/ Antigentranslation und Autophagie-abh{\"a}ngiger Antigenpr{\"a}sentation wurde auch f{\"u}r EBNA3C und die zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet. Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abh{\"a}ngige Pr{\"a}sentation neusynthetisierter Proteine als den verantwortlichen molekularen Mechanismus f{\"u}r die endogene Pr{\"a}sentation der untersuchten nukle{\"a}ren Antigene auf MHC-II-Molek{\"u}len. Durch die Kopplung von Translation und autophagischem Abbau erlangen Proteine unabh{\"a}ngig von ihrer subzellul{\"a}ren Lokalisation Zugang zu diesem Pr{\"a}sentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellul{\"a}ren Antigene, die einer CD4+ T-Zell{\"u}berwachung unterliegen.}, subject = {Autophagie}, language = {de} } @phdthesis{Mertins2008, author = {Mertins, Sonja}, title = {Einfluss des Kohlenstoff-Metabolismus auf die Aktivit{\"a}t des Virulenzfaktors PrfA von Listeria monocytogenes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29556}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Listeria monocytogenes geh{\"o}rt zu den Gram-positiven fakultativ intrazellul{\"a}ren Bakterien, ist aber auch zu einem saprophytischen Leben in freier Natur f{\"a}hig. Zahlreiche, umfassend charakterisierte Virulenzfaktoren sind f{\"u}r die verschiedenen Schritte im Infektionszyklus von L. monocytogenes erforderlich: InlA und InlB induzieren die Aufnahme von L. monocytogenes in nicht-phagozytische Zellen, LLO und PlcA sind f{\"u}r die Freisetzung aus dem prim{\"a}ren Phagosom, ActA f{\"u}r die Zell-zu-Zell-Ausbreitung und LLO zusammen mit PlcA und vor allem PlcB f{\"u}r die Freisetzung der Listerien aus dem sekund{\"a}ren Phagosom erforderlich. Der Hexose-Phosphat-Transporter UhpT ist teilweise f{\"u}r die Vermehrung von L. monocytogenes im Zytosol der infizierten Wirtszelle verantwortlich. Die Gene, die f{\"u}r diese Virulenzfaktoren kodieren, sind gr{\"o}ßtenteils in dem 9,6 kb-großen Virulenzgencluster LIPI-1 zusammengefasst oder liegen verteilt auf dem Chromosom. Alle diese Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA (PrfA = positive regulatory factor A) in ihrer Transkription kontrolliert. Das prfA-Gen, kodierend f{\"u}r PrfA, ist benfalls Bestandteil des Virulenzgenclusters (LIPI-1). In bisherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Verwertung der Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose und Cellobiose zur Hemmung der PrfA-Aktivit{\"a}t in L. monocytogenes f{\"u}hrt. Basierend auf Literaturdaten und eigenen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass Komponenten der globalen Kohlenstoff-Katabolitrepression (KKR) oder des PTS (Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System)-abh{\"a}ngigen Zuckertransports an der Modulation der PrfA-Aktivit{\"a}t beteiligt sind. Um zu {\"u}berpr{\"u}fen, ob {\"u}ber die KKR die Aktivit{\"a}t von PrfA gesteuert wird und dadurch auch die Regulation der PrfA-abh{\"a}ngigen Virulenzgenexpression, wurden in dieser Arbeit pLSV101-Insertionsmutanten f{\"u}r die Gene ccpA (kodierend f{\"u}r CcpA = catabolite control protein A), hprK (kodierend f{\"u}r die HPr-Kinase/Phosphorylase, die HPr am Ser46 phophoryliert) und ptsH (kodierend f{\"u}r das hitzestabile HPr) charakterisiert. Die Insertionsmutanten ::ccpA und ::hprK zeigten sowohl in BHI (undefiniertes n{\"a}hrstoffreiches Medium) als auch in definiertem Minimalmedium (MM) mit 50 mM Glukose ein verlangsamtes Wachstum und eine verringerte [14C]-Glukose-Aufnahme im Vergleich zum Wildtyp (WT). Die ::ptsH-Insertionsmutante war nur zu einem Wachstum in BHI f{\"a}hig und zeigte erwartungsgem{\"a}ß (fehlendes HPr) kein Wachstum in definiertem MM mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle. Die ::hprK- und (unter bestimmten Wachstumsbedingungen) auch die ::ptsH-Mutante wiesen sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene eine gesteigerte Expression PrfA-abh{\"a}ngiger Virulenzgene auf. Cellobiose-Verwertung f{\"u}hrte auch in der ::hprK-Insertionsmutante zu einer Hemmung der PrfA-Aktivit{\"a}t. Dagegen wurde in der ::ccpA-Insertionsmutante eine geringere Expression aller PrfA-abh{\"a}ngigen Virulenzgene im Vergleich zum WT festgestellt. Die Revertanten RccpA, RhprK und RptsH wiesen im Wachstumsverhalten und in der PrfA-abh{\"a}ngigen Virulenzgenexpression wieder einen wildtypischen Ph{\"a}notyp auf. Trotz der etwas gesteigerten Virulenzgenexpression zeigte die ::ptsH-Mutante eine deutlich verringerte Replikationsrate in J744 Makrophagen gegen{\"u}ber dem WT. Die Transkriptomprofile der ::ccpA- und ::hprK-Insertionsmutanten zeigten im Vergleich zum WT viele hochregulierte Gene. Diese umfassen Gene, die v.a. f{\"u}r den PTS-abh{\"a}ngigen Zuckertransport, ABC-Transporter und Enzyme des C- und N-Metabolismus kodieren und im WT wahrscheinlich unter den gegebenen Wachstumsbedingungen unter KKR-Kontrolle stehen. Die erh{\"o}hte PrfA-abh{\"a}ngige Virulenzgenexpression in der ::hprK-Mutante korreliert mit der Herunterregulation einiger Gene, die in ihrer Transkription durch einen aktiven PTSvermittelten Glukose-Transport kontrolliert werden. Die gesteigerte PrfA-Aktivit{\"a}t und die Abwesenheit von HPr-Ser46~P (neben CcpA eine wichtige Komponente der KKR) in den ::hprK- und ::ptsH-Insertionsmutanten f{\"u}hrten zu der Annahme, dass eine Korrelation zwischen der Menge an HPr-Ser46~P und der PrfA-Aktivit{\"a}t bestehen k{\"o}nnte. Die Untersuchung der PrfA-Aktivit{\"a}t und parallel dazu die Mengenbestimmung von HPr-Ser46~P in MM mit Glukose, Cellobiose und Glyzerin zeigte jedoch, dass weder HPr-Ser46~P noch HPr-His15~P direkte Modulatoren der PrfA-Aktivit{\"a}t sind. Eine direkte Interaktion zwischen HPr-Ser46~P und PrfA konnte mittels Biacor-Analyse ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Auch in vitro Transkriptions-Studien zeigten keinen inhibitorischen Effekt von HPr-Ser46~P auf die Initiation der Transkription bei PrfA-abh{\"a}ngigen Promotoren (S. M{\"u}ller-Altrock, pers{\"o}nliche Mitteilung). Interessanterweise war bei einem aktiven Glukose-Transport, bei Bedingungen also, wo die EIIA-Komponenten aller aktiven Glukose-spezifischen PTS im unphosphoryliertem Zustand vorliegen (EIIA-Komponenten {\"u}bertragen {\"u}ber EIIB das aktive Phosphat auf die {\"u}ber EIIC in die Bakterienzelle transportierte Glukose), die PrfA-Aktivit{\"a}t gering. Erst in der sp{\"a}tlogarithmischen bis station{\"a}ren Wachstumsphasen, wenn Glukose nur noch in geringem Umfang von der Bakterienzelle aufgenommen wird und die Glukose-spezifischen EIIA-Komponenten in phosphorylierter Form vorliegen, steigt die PrfA-Aktivit{\"a}t. Die Verwertung der PTS-unabh{\"a}ngigen Kohlenstoffquelle Glyzerin zeigte gegen{\"u}ber den PTS Zuckern Glukose und Cellobiose schon in der fr{\"u}hen Wachstumsphase eine erh{\"o}hte PrfA-Aktivit{\"a}t. Demnach scheint sich die Expression spezifischer PTS und der Phosphorylierungszustand von EIIA dieser PTS regulatorisch auf die PrfA-Aktivit{\"a}t auszuwirken. Die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ist noch nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt (R. Stoll, unver{\"o}ffentlichte Ergebnisse). Doch kann aufgrund des Wachstumsverlustes der ::ptsH-Insertionsmutante in Glukose-haltigem MM davon ausgegangen werden, dass die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ausschließlich PTS-abh{\"a}ngig erfolgt. Ein Glukose-spezifisches PtsG, das in B. subtilis und anderen Bakterien als wichtiger Glukose-Transporter beschrieben wurde, existiert in L. monocytogenes nicht. Hier konnte nur eine PtsG-spezifische EIIA-Komponente (kodiert von lmo1017) identifiziert werden. Wachstumsuntersuchungen in definiertem MM mit den Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose, Cellobiose und Glyzerin ergaben keinen Wachstumsunterschied zwischen der in dieser Komponente defekten \&\#916;eIIAGlc-Mutante und dem WT. Die PrfA-Aktivit{\"a}t dieser Mutante war leicht erh{\"o}ht, was sich in einer etwas gesteigerten ActA- bzw. PrfA-Expression und einer h{\"o}heren LLO-Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber dem WT auspr{\"a}gte. Es konnte jedoch keine eindeutige Interaktion zwischen dieser gereinigten EIIAGlc-Komponente und dem PrfA-Protein mittels Biacor-Analyse nachgewiesen werden (S. M{\"u}ller-Altrock und G. Seidel, pers{\"o}nliche Mitteilung). Welche EIIA-Komponenten spezifischer PTS an der Modulation der PrfA-Aktivit{\"a}t beteiligt sind, konnte in dieser Arbeit damit nicht abschließend gekl{\"a}rt werden. Der Transport von phosphorylierten Zuckern, wie Glukose-1-, Glukose-6- oder Mannose-6- Phosphat, erfolgt in L. monocytogenes {\"u}ber den Hexose-Phosphat-Transporter UhpT, der von dem strikt PrfA-abh{\"a}ngig uhpT-Gen kodiert wird. Durch die Zugabe von Amberlite XAD-4 zu LB-Medium oder durch vorherigen Anzucht in Glyzerin-haltigem MM, Bedingungen, die sich stimulierend auf die PrfA-Aktivit{\"a}t auswirken, konnte ein effizientes Wachstum von L. monocytogenes in Glukose-6-Phosphat-haltigem Medium erreicht werden. Obwohl die Kohlenstoff-Verbindungen (Glukose, Cellobiose und Glukose-6-Phosphat) in die Glykolyse eingeschleust werden, f{\"u}hrte die Verwertung von Glukose-6-Phosphat zur Aufhebung der KKR. Dies konnte durch vergleichende Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und an der Bestimmung der HPr-Ser46~P Meng gezeigt werden. Die PTS-unabh{\"a}ngige Glukose-6-Phosphat-Aufnahme f{\"u}hrt, {\"a}hnlich wie die von Glyzerin, zu einer erh{\"o}hten Aktivit{\"a}t von PrfA. Neben Glyzerin k{\"o}nnen auch Dihydroxyaceton (Dha) und Pyruvat (letztere allerdings mit niedriger Wachstumseffizienz), nicht aber Glyzerin-3-Phosphat in vitro als C3-Quellen dienen. Da die ::ptsH-Insertionsmutante kein Wachstum in Glyzerin- oder Dha-haltigem Medium zeigte, l{\"a}sst sich vermuten, dass die listeriellen Glyzerin-Kinase(n) (GlpK), {\"a}hnlich wie die von B. subtilis, durch HPr-His15~P aktiviert werden muss und die Dha-Kinase(n) (DhaK) von L. monocytogenes ebenfalls HPr-His15~P als Kofaktor f{\"u}r die Phosphorylierung von Dha verwendet. Der Glyzerin-Metabolismus in L. monocytogenes wurde vor allem {\"u}ber Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und Real-time RT-PCR Untersuchungen n{\"a}her charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes mehrere Gene besitzt, die in Glyzerin-haltigem Medium verst{\"a}rkt exprimiert werden und vermutlich am Glyzerin- bzw. Dha-Metabolismus beteiligt sind. L. monocytogenes besitzt zwei Dha-Kinasen (kodiert von lmo0347-48 und lmo2695-96), die beide eine hohe Homologie zur DhaK aus E. coli besitzen. Eine Deletion beider Dha-Kinasen (\&\#916;dhaK = \&\#916;lmo0347-48/lmo2695-96) f{\"u}hrte zu einer starken Wachstumshemmung in Glyzerin-haltigem MM und zur weitgehenden Inaktivierung von PrfA. Die \&\#916;dhaK- und die \&\#916;glpD/dhaK-Mutante wiesen in J744 Makrophagen eine verringerte Replikationsrate im Vergleich zum WT auf, was f{\"u}r eine Verwertung von Glyzerin und/oder Dha durch L. monocytogenes im Zytoplasma von Wirtszellen spricht. Da diese Mutanten aber noch -wenn auch mit verringerter Effizienz - in diesem Zellkompartiment der Makrophagen wachsen k{\"o}nnen, muss L. monocytogenes wohl auch in der Lage sein, weitere Kohlenstoffquellen dieser Wirtszelle verwerten zu k{\"o}nnen.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} } @phdthesis{Endlein2007, author = {Endlein, Thomas}, title = {Haftung und Fortbewegung: Kontrollmechanismen von Adh{\"a}sionskr{\"a}ften bei Ameisen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28985}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Nat{\"u}rliche Haftsysteme {\"u}bertreffen technische Kleber in mehreren Aspekten: Sie haften auf nahezu allen Oberfl{\"a}chen, sind selbstreinigend und sind in ihrer Haftst{\"a}rke dynamisch kontrollierbar. F{\"u}r Tiere mit Haftorganen ist deren Kontrolle eine Grundvoraussetzung f{\"u}r effiziente Lokomotion. Wie k{\"o}nnen Tiere gut an Oberfl{\"a}chen haften und gleichzeitig schnell laufen? Wie werden Haftorgane kontrolliert, um auf rauen oder glatten Oberfl{\"a}chen senkrecht oder kopf{\"u}ber zu haften und wieder loszulassen? Die vorliegende Arbeit untersucht am Beispiel vonWeberameisen (Oecophylla smaragdina), welche Kontrollmechanismen Insekten verwenden, um den Konflikt zwischen Haftung und Fortbewegung zu bew{\"a}ltigen. Weberameisen besitzen an ihren F{\"u}ßen zwischen den Krallen ein entfaltbares Haftorgan (Arolium), welches im Vergleich zu anderen Hymenopteren stark vergr{\"o}ßert ist. Ihre enormen Haftkr{\"a}fte (mehr als das 100-fache ihres K{\"o}rpergewichtes) werden haupts{\"a}chlich eingesetzt, um Bl{\"a}tter f{\"u}r ihren Nestbau in den Baumkronen zusammenzuziehen. Sie sind Meister der Haftung und gute L{\"a}ufer zugleich und eigneten sich daher sehr gut als Modellsystem. In der Arbeit wurde dieWechselwirkung von Haftung und Bewegung auf mehreren hierarchischen Ebenen untersucht, vom gesamten K{\"o}rper {\"u}ber die Beine bis zum Haftorgan selbst. Es zeigte sich, dass Kontrollmechanismen auf allen drei Ebenen vorliegen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch Manipulationen an der Krallenziehersehne die komplexe innere Mechanik des Pr{\"a}tarsus aufgekl{\"a}rt. Es zeigte sich, dass die Bewegungen von Tarsus, Krallen und Arolium in einer koordinierten Reihenfolge erfolgten. Durch Amputationen der Krallenspitzen an lebenden Ameisen konnte best{\"a}tigt werden, dass die Entfaltung des Aroliums durch das Verhaken der Krallen auf rauen Oberfl{\"a}chen mechanisch eingeschr{\"a}nkt wird. Der Einsatz des Aroliums war auch abh{\"a}ngig von der Oberfl{\"a}chenorientierung. Weberameisen setzten ihr Haftorgan beim aufrechten Laufen {\"u}berhaupt nicht ein, beim Kopf{\"u}berlaufen auf glatten Oberfl{\"a}chen wurde dagegen nur ein Bruchteil der maximal m{\"o}glichen Haftkontaktfl{\"a}che entfaltet. Die Versuche zeigten, dass Ameisen die Entfaltung des Aroliums entweder aktiv, d. h. durch Kontraktion des Krallenziehermuskels, oder passiv durch Zugbewegungen des Tarsus graduell variieren. Beide Mechanismen werden von den Ameisen verwendet, um die ansonsten klein gehaltene Haftkontaktfl{\"a}che bei Bedarf (z. B. bei Zusatzbeladungen) zu vergr{\"o}ßern. Die passive Entfaltung ist von der neuromuskul{\"a}ren Kontrolle entkoppelt und unterliegt somit nicht den Zeitverz{\"o}gerungen von Reflexreaktionen. Durch pl{\"o}tzliche laterale Verschiebung der Laufoberfl{\"a}che durch einen Stoß konnte eine schlagartige Ausfaltung der Arolien ausgel{\"o}st werden, die wesentlich schneller ablief als alle bekannten Reflexreaktionen. Dies kann als Sicherheitsmechanismus interpretiert werden, womit sich die Ameisen bei starken Ersch{\"u}tterungen der nat{\"u}rlichen Laufsubstrate (Bl{\"a}tter) durchWindst{\"o}ße oder Regentropfen festhalten k{\"o}nnen. Sowohl Kraftmessungen an der Krallenziehersehne, welche die Kontraktion des Krallenziehermuskels nachahmten als auch Reibungskraftmessungen zur passiven Entfaltung des Aroliums zeigten, dassWeberameisen im Vergleich zu einer bodenlebenden Ameise ihre Haftorgane leichter entfalten konnten. Dies erleichtert es ihnen, ihre Haftorgane {\"u}ber lange Zeit im entfalteten Zustand zu halten, wie es beispielsweise beim Nestbau erforderlich ist. Mit Hilfe von dreidimensionalen Kinematikstudien konnte gezeigt werden, dass Weberameisen durch {\"A}nderungen des Beinwinkels zur Oberfl{\"a}che das Sch{\"a}lverhalten der Haftorgane beeinflussen. Ein flacherer Winkel verhinderte das Absch{\"a}len der Haftorgane w{\"a}hrend der Standphase oder beim Tragen von Zusatzlasten; ein steilerer Tarsus hingegen erleichterte das Absch{\"a}len w{\"a}hrend der Abl{\"o}sephase. Dieses Verhalten wurde mit dem Modell eines Klebebandes verglichen. Allerdings ver{\"a}nderten sich die Haftkr{\"a}fte in einem bestimmten Winkelbereich deutlich st{\"a}rker, als die Sch{\"a}ltheorie es vorhersagen w{\"u}rde. Die starken Unterschiede in der Haftkraft an dieser Schwelle sind jedoch biologisch sinnvoll und werden wahrscheinlich von den Ameisen verwendet, um schnell zwischen Haften und L{\"o}sen zu wechseln. Messungen der Bodenreaktionskr{\"a}fte zeigten einen weiteren Abl{\"o}semechanismus: W{\"a}hrend der Abl{\"o}sephase wird durch distales Schieben des Beines das Haftorgan entlastet und so eine passive R{\"u}ckfaltung des Aroliums erlaubt. Beide Abl{\"o}semechanismen (Sch{\"a}len und Entlasten) wurden f{\"u}r einzelne Beinpaare im unterschiedlichen Ausmaß von den Ameisen verwendet. Eine Umorientierung zur Schwerkraftrichtung, z. B. beim Kopf{\"u}berlaufen, hatte auch Einfluss auf das Laufmuster und die Beinstellung relativ zum K{\"o}rperschwerpunkt. Die Ameisen passten beim Kopfx {\"u}berlaufen ihren Gang so an, dass sie mehrere Beine gleichzeitig in Bodenkontakt hielten und langsamere und k{\"u}rzere Schritte machten. Entstandene Drehmomente beim Tragen von Zusatzlasten wurden durch gezielte {\"A}nderungen der Beinpositionen ausgeglichen. Meine Arbeit zeigt, dass Insekten die Oberfl{\"a}chenhaftung auf verschiedenen hierarchischen Ebenen mit Hilfe verschiedener Anpassungen kontrollieren und dabei elegant neuromuskul{\"a}re Steuerungen mit rein passiven Mechanismen vereinigen. Die hier f{\"u}r Weberameisen exemplarisch untersuchten Effekte sind von allgemeiner Bedeutung f{\"u}r alle Tiere, die sich mit Hilfe von Haftorganen fortbewegen. Ein Verst{\"a}ndnis der Mechanismen, mit denen Insekten Haftung dynamisch kontrollieren, k{\"o}nnte wichtige Anregungen f{\"u}r die Entwicklung von kletterf{\"a}higen Laufrobotern liefern.}, subject = {Ameisen}, language = {de} } @phdthesis{Geissler2008, author = {Geissler, Oliver}, title = {Der Informationsfluss bei der Futtersuche von Ameisen : Spezielle Kommunikationsstrategien von Blattschneiderameisen und nektarsammelnden Ameisen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28878}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Die komplexen Aktivit{\"a}tsmuster w{\"a}hrend der Futtersuche bei Ameisen sind kein Resultat einer einfachen Selbstorganisation mit starren Regeln sind, sondern diese Regeln werden vielmehr permanent durch den Informationsaustausch zwischen den Arbeiterinnen modifiziert. Die Furagier{\"o}kologie hat vor allem einen Einfluss auf die Rekrutierungsstrategie der Tiere. Blattschneiderameisen furagieren an großen und stabilen Nahrungsressourcen auf diese sie nach dem Auffinden sofort stark rekrutieren. Camponotus rufipes besucht hingegen Futterquellen, die in ihrer Ergiebigkeit schlecht vorhersagbar sind. Daher steigern die Tiere ihre Rekrutierungsintensit{\"a}t erst nachdem sie sich durch mehrmaliges Aufsuchen der Futterquelle von deren Best{\"a}ndigkeit {\"u}berzeugt haben.}, subject = {Nahrungserwerb}, language = {de} } @phdthesis{Kroiss2008, author = {Kroiß, Matthias}, title = {Reinigung und funktionelle Charakterisierung des SMN-Komplexes von Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28840}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Die Zusammenlageurng spleißosomaler UsnRNPs erfolgt beim Menschen und anderen Vertebraten durch den makromolekularen SMN-Komplex. Dieser besteht aus insgesamt neun Proteinen, genannt SMN und Gemin2-8. In dieser Arbeit wurde die Evolution dieser molekularen Maschine untersucht. Dazu wurden die Genome mehrerer Modellorganismen bioinformatisch nach Orthologen von SMN und seinen Komplexpartnern durchsucht. Es zeigte sich, dass SMN und Gemin2 die Kernkomponenten des Komplexes darstellen. Von diesen ausgehend kamen weitere Komponenten im Laufe der Evolution hinzu und zwar blockweise, wie es ihrer physischen Assoziation im humanen Komplex entspricht. Um diese Befunde einer biochemischen {\"U}berpr{\"u}fung zu unterziehen, wurde ein neues Affinit{\"a}tsepitop, das TagIt-Epitop, entwickelt. Nach stabiler Transfektion von Drosophila Schneider2-Zellen konnte das Fusionsprotein effizient exprimiert und der Drosophila-SMN-Komplex nativ aufgereinigt werden. Die massenspektrometrische Untersuchung des Komplexes zeigte, dass SMN und Gemin2 seine einzigen st{\"o}chiometrischen Komponenten sind. Dies ist in eindrucksvoller {\"U}bereinstimmung mit den bioinformatischen Daten. Der aufgereinigte Komplex lagert in vitro Sm-Proteine mit der entsprechenden UsnRNA zum UsnRNP-core-Komplex zusammen. Diese Ergebnisse ließen sich nach rekombinanter Rekonstitution des SMN/Gemin2-Dimers rekapitulieren. Dabei zeigte sich, dass der SMN-Komplex die unkoordinierte Bindung der Sm-Proteine an „falsche" RNAs verhindert. Folglich gen{\"u}gen SMN und Gemin2 zur Zusammenlagerung des Sm-core-Komplexes, w{\"a}hrend die {\"u}brigen Gemine weitere Funktionen im Kontext der UsnRNP-Biogenese spielen k{\"o}nnten. Aus evolutionsbiologischer Sichtweise ist der SMN-Komplex aus Drosophila ein eindr{\"u}ckliches Beispiel, wie die Vereinfachung eines biochemischen Prozesses zur Kompaktierung des Genoms beitragen kann.}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @phdthesis{Haneke2008, author = {Haneke, Torsten}, title = {Die Tumorgenese in Mlh1 defizienten M{\"a}usen und der Einfluss des Immunsystems auf die Abwehr von Tumoren in Mismatch Reparatur-(MMR-) defizienten M{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28737}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Das DNA-Mismatch-Reparatur-(MMR-) System ist das einzig bekannte postreplikativ arbeitende DNA-Reparatur-System. Es wurde gezeigt, dass die MMR-Aktivit{\"a}t f{\"u}r den Erhalt der genomischen Stabilit{\"a}t in Prokaryoten und Eukaryoten notwendig ist. Defekte in Genen des MMR-Systems (wie beispielsweise MLH1 oder MSH2) wurden als Ursache f{\"u}r die Entstehung des heredit{\"a}ren nicht-polyp{\"o}sen kolorektalen Karzinoms (HNPCC) und anderen Tumorarten beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde die Tumorgenese in Mlh1 defizienten M{\"a}usen (Mlh1-/-) untersucht und eine umfassende Charakterisierung der hier auftretenen Lymphome vorgenommen und die Bedeutung des Immunsystems f{\"u}r die Tumorgenese in Mlh1 defizienten M{\"a}usen durch Einkreuzen zus{\"a}tzlicher Immundefizienzen erruiert. Die auf einen reinen genetischen Hintergrund zur{\"u}ckgekreuzten Mlh1-/--M{\"a}use zeigten eine in zwei Wellen ablaufende Tumorgenese: Eine fr{\"u}he Phase, in der M{\"a}use lymphoide Tumoren entwickelten und eine sp{\"a}tere Phase, in der die Mlh1-/--Tiere vorwiegend an Gastrointestinaltumoren erkrankten. Wir konnten zeigen, dass die Mlh1 defizienten M{\"a}use ein breiteres Lymphomspektrum, als beispielsweise Msh2 defiziente Tiere aufweisen. Eine Vielzahl der untersuchten Lymphome Mlh1 defizienter M{\"a}use war mikrosatelliteninstabil (MSI). Die Tatsache, dass mikrosatellitenstabile (MSS) Lymphome in den Mlh1-/--Tieren vorkamen, impliziert aber auch, das MMR-Defizienz nicht zwingend durch Mikrosatelliteninstabilit{\"a}t gekennzeichnet sein muss. Es ist m{\"o}glich, dass sich eine Mikrosatelliteninstabilit{\"a}t erst zu einem sp{\"a}teren Zeitpunkt der Tumorentwicklung in MMR-defizienten Zellen manifestiert. Darauf deuten auch die MSI-Analysen der in den Rag-/-/Mlh1-/--M{\"a}usen fr{\"u}hzeitiger als in Mlh1-/--M{\"a}usen auftretenden Gastrointestinaltumoren hin. Einige dieser untersuchten Gastrointestinaltumoren in den Rag-/-/Mlh1-/--M{\"a}usen waren mikrosatellitenstabil, wohingegen s{\"a}mtliche Gastrointestinaltumoren der Mlh1 defizienten Mauspopulation Mikrosatelliteninstabilit{\"a}t aufwiesen. In einigen der untersuchten Lymphome fehlte die MHC Klasse I-Molek{\"u}lexpression, was auf deutet den Einfluss des Immunsystems auf die Erkennung und Eliminierung von (durch MMR-Defizienz entstandenen) Tumoren hindeutet. Um die Art der Immunantwort und die verantwortlichen Komponenten des Immunsystems f{\"u}r die Abwehr MMR-defizienter Tumoren einzugrenzen, wurden verschiedene immunkompromitierte oder immundefiziente Mauslinien in Mlh1 defiziente M{\"a}use eingekreuzt. Dieses waren Mauslinien mit beta2Mikroglobulin- (b2m-/--), Perforin- (pfp-/--), beta2Mikroglobulin/Perforin- (b2m-/-/pfp-/--) und Recombination activation gene- (Rag-/--) Defizienz. H{\"a}ufig wurde in diesen Tieren eine Verschiebung im Tumorspektrum und ein beschleunigtes zeitliches Auftreten der Tumoren beobachtet. Anhand dieser Modelle konnten wir demonstrieren, dass insbesondere die Regulierung der MHC Klasse I-Molek{\"u}lexpression ein bedeutsamer Schritt f{\"u}r die Auspr{\"a}gung verschiedener Lymphomarten ist, welcher das „{\"U}berleben" der Tumorzellen gew{\"a}hrleistet. Auch die Notwendigkeit einer balancierten Expression von NK-Zell-stimulatorischen und -inhibitorischen Liganden auf der Tumorzelloberfl{\"a}che, welche die Erkennung und Eliminierung von Tumorzellen durch Nicht-MHC Klasse I-abh{\"a}ngige Immunzellen (wie z.B. den Nat{\"u}rliche Killerzellen) reguliert, liess sich mit Hilfe der beta2Mikroglobulin- und Perforin-Mausmodelle aufzeigen. Offensichtlich sind f{\"u}r die in Mlh1 defizienten M{\"a}usen vorkommenden verschiedenen Tumorarten unterschiedliche zellul{\"a}re Komponenten und Abwehrmechanismen des Immunsystems f{\"u}r die Erkennung und Eliminierung verantwortlich. So beeinflussen insbesondere cytotoxische T-Zellen (CTLs) die Entstehung von Gastrointestinaltumoren in Mlh1 defizienten M{\"a}usen. F{\"u}r die lymphoiden Tumoren ergab sich ein divergentes Bild. Hier beschr{\"a}nkte sich der Einfluss der CTLs bei der Lymphomabwehr auf die Erkennung und Eliminierung disseminierter T- und B-Zell-Lymphome. Die in den Mlh1-/--M{\"a}usen nachgewiesenen thymischen T-Zell Lymphome dagegen unterlagen der perforin-vermittelten Zellabwehr durch Nicht-MHC Klasse I-beschr{\"a}nkte Immunzellen (z.B. Nat{\"u}rlichen Killerzellen). Die Relevanz der vorliegenden Mausmodelle wird deutlich, wenn man sich die Situation von immunsupprimierten Posttransplantationspatienten und immundefizienten HIV-Patienten vor Augen f{\"u}hrt. H{\"a}ufig beobachtet man in diesen Patientengruppen das Auftreten lymphoider Tumoren. Diese sind oftmals Mikrosatelliteninstabil, was auf eine vorliegende MMR-Defizienz hindeutet. Zudem zeigen diese Lymphome {\"a}hnliche Merkmale, wie die durch Mlh1-Defizienz entstandenen lymphoiden Tumoren. Insbesondere f{\"u}r Studien solcher Lymphome stellt die Mlh1-defiziente Maus mit den verschiedenen eingekreuzten Immundefizienzen ein geeignetes in vivo Model dar.}, subject = {Lymphom}, language = {de} } @phdthesis{Loewe2008, author = {L{\"o}we, Tobias}, title = {Untersuchung von gene-drive-Strategien als neue Interventionsstrategien zur Eind{\"a}mmung der Malaria}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28750}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit haben wir unter Nutzung bioinformatischer Methoden eine innovative Strategie zur Eind{\"a}mmung der Malaria entwickelt. Die genetische Modifikationsstrategie beinhaltet sowohl Manipulationen aufseiten des gef{\"a}hrlichsten Erregers, Plasmodium falciparum, als auch des Hauptvektors, Anopheles gambiae. In den Genomen beider Spezies wurden eine Reihe neuer konkreter targets identifiziert. Auch bereits beschriebene targets und Ans{\"a}tze wurden in die Strategie einbezogen bzw. weiter ausgestaltet. Bez{\"u}glich der Vektormoskitos wird die Verbreitung eines gegen{\"u}ber Plasmodien resistenten Genotyps angestrebt. Es werden einerseits effiziente nat{\"u}rliche und k{\"u}nstliche Resistenzgene diskutiert und andererseits eine bekannte Strategie zur Fixierung nat{\"u}rlicher Resistenzallele in nat{\"u}rlichen Populationen verbessert. Auf der Seite der Plasmodien erweiterten wir einen bereits von A. Burt (2003) beschriebenen Eradikationsansatz um weitere targets. Aus ethischen und evolutionsbiologischen Erw{\"a}gungen bevorzugen wir jedoch eine alternative Strategie, welche die Etablierung von in ihrer Virulenz gemilderten Parasiten zum Ziel hat. Der attenuierte Genotyp wird unter anderem durch komplexe Pathway-Remodellierungen beschrieben (L{\"o}we, Sauerborn, Schirmer, Dandekar, A refined genome engineering strategy against parasites and vectors, Manuskript beim Journal „Genome Biology" eingereicht). Da sich Mutanten in der Natur gegen Wildtyp-Organismen kaum durchsetzen k{\"o}nnen, werden zwei drive-Systeme beschrieben, welche f{\"u}r die Implementierung der genetischen Manipulationsstrategie entwickelt wurden. Beide Konstrukte wurden zur Patentierung angemeldet (Patentanmeldung U30010 DPMA bzw. Aktenzeichen 102006029354.1). Zus{\"a}tzlich zur deutschen wurde f{\"u}r eines der beiden Konstrukte eine PCT-Anmeldung eingereicht, welche in Zukunft einen internationalen Patentschutz erm{\"o}glichen soll. Es werden Kalkulationen vorgelegt, welche die Verbreitungstendenzen der Konstrukte in nat{\"u}rlichen Populationen vorhersagen. Die Beschreibung der entwickelten Konstrukte beschr{\"a}nkt sich nicht auf das prim{\"a}re Anwendungsgebiet der Arbeit (Malaria), sondern beinhaltet auch andere Anwendungsgebiete, vor allem im Bereich der Medizin und Molekularbiologie.}, subject = {Malaria tropica}, language = {de} } @phdthesis{Weber2007, author = {Weber, Natalia}, title = {Psychosoziale Aspekte bei heredit{\"a}rer Mamma/Ovarial-Ca-Belastung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28330}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der psychischen Befindlichkeit und anderer gesundheitsbezogenen Konditionen der Frauen und M{\"a}nner mit famili{\"a}ren Mamma- und Ovarialkarzinomrisiko sowie die Kl{\"a}rung hinsichtlich der Bew{\"a}ltigung und Auswirkung genetischer Risikoinformation. Es wurden Risikowahrnehmung, Informationsstand, Inanspruchnahme der Beratungsangebote sowie der Fr{\"u}herkennungsmaßnahmen, Einstellung gegen{\"u}ber genetischer Brustkrebsdiagnostik und famili{\"a}rer/sozialer Kommunikation untersucht. Die vollst{\"a}ndig ausgef{\"u}llten Frageb{\"o}gen von Ratsuchenden und Betroffenen, die an der Beratung und Befragung im Zentrum f{\"u}r „Famili{\"a}ren Brust-/Eierstockkrebs" teilgenommen haben, wurden von uns ausgewertet. F{\"u}r die beratenden Institutionen ist das Wissen der vielf{\"a}ltigen psychischen und sozialen Folgen bei den Testsuchenden und deren Familien sehr wichtig. Nur so kann das Betreuungskonzept und das Beratungsangebot verbessert werden.}, subject = {Brustkrebs}, language = {de} } @phdthesis{Teutschbein2008, author = {Teutschbein, Janka}, title = {Identifizierung und Charakterisierung von Genen und Proteinen in der Xmrk-induzierten Entwicklung von Melanomen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27516}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Melanome stellen die gef{\"a}hrlichste Form von Hautkrebs mit der h{\"o}chsten Mortalit{\"a}tsrate dar. Der Transformation normaler Melanozyten zu malignen Melanomen liegen komplexe molekulare und biochemische Ver{\"a}nderungen zu Grunde. Im Xiphophorus-Melanom-Modell ist die onkogene Rezeptortyrosinkinase "Xiphophorus melanoma receptor kinase" (Xmrk) der alleinige Ausl{\"o}ser der Melanominitiation und -progression. Die Aufkl{\"a}rung der Xmrk-vermittelten Signaltransduktion kann zum besseren Verst{\"a}ndnis von Ereignissen, die auch bei der humanen Melanomentwicklung eine Rolle spielen, beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Microarray-Technologie die Regulation der Genexpression durch Xmrk analysiert. Zu den nach Rezeptoraktivierung am st{\"a}rksten herabregulierten Genen geh{\"o}rten "son of sevenless homolog 1" (Sos1) und "ubiquitin-conjugating enzyme E2I" (Ube2i); stark hochreguliert waren "early growth response 1" (Egr1), "cysteine-rich protein 61" (Cyr61), "dual-specificity phosphatase 4" (Dusp4), "fos-like antigen 1" (Fosl1), "epithelial membrane protein" (Emp1), Osteopontin (Opn), "insulin-like growth factor binding protein 3" (Igfbp3) und "tumor-associated antigen L6" (Taal6). Die f{\"u}r die Regulation dieser Gene verantwortlichen Signalwege wurden durch die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren und siRNA identifiziert, wobei f{\"u}r die SRC-Kinase FYN eine zentrale Bedeutung bei der Xmrk-abh{\"a}ngigen Regulation der Genexpression festgestellt wurde. Dar{\"u}ber hinaus wurde die Expression der Gene in humanen Melanomzelllinien im Vergleich zu normalen humanen Melanozyten untersucht. Als besonders vielversprechende Kandidaten stellten sich dabei DUSP4 und TAAL6 heraus, deren Rolle in der humanen Melanominduktion und -progression Gegenstand zuk{\"u}nftiger Studien sein wird. In einem anderen Ansatz zur Aufkl{\"a}rung des Signalnetzwerkes sollten Zielproteine von Xmrk durch Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems ermittelt werden. Aufgrund ung{\"u}nstiger Expressions- oder Faltungseigenschaften von Xmrk in diesem System war es aber nicht m{\"o}glich, den Rezeptor als K{\"o}derprotein einzusetzen. Das f{\"u}r die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung zentrale Protein FYN konnte jedoch als K{\"o}der etabliert und seine Wechselwirkung mit der Tyrosinkinase FAK analysiert werden. Es wurde gezeigt, dass der phosphorylierte Tyrosinrest an Position 397 von FAK f{\"u}r die Interaktion einer N-terminal trunkierten FAK-Variante mit FYN notwendig ist und dass diese Phosphorylierung in Hefe gew{\"a}hrleistet zu sein scheint. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von FYN mittels der Split-Ubiquitin-Technologie k{\"o}nnte Einblicke in weitere FYN-abh{\"a}ngige Ereignisse bieten, die zur Aufkl{\"a}rung seiner zentralen Rolle bei der Tumorentstehung dienen k{\"o}nnte.}, subject = {Melanom}, language = {de} } @phdthesis{Nieratschker2008, author = {Nieratschker, Vanessa}, title = {Charakterisierung der Serin-/Threonin-Proteinkinase SRPK3 in Drosophila melanogaster und Phosphorylierungsstudien an Synapsin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27806}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Ausl{\"o}ser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut urspr{\"u}nglicher Annotation der „Flybase" (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich {\"u}ber ca. 10,3 kb erstreckt, f{\"u}r zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminos{\"a}uren. Diese beiden urspr{\"u}nglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente best{\"a}tigt werden. Dabei wurde auch ein zus{\"a}tzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus f{\"u}r mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase" annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante f{\"u}r die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie tr{\"a}gt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerst{\"o}rt, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erw{\"a}hnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Ausl{\"o}ser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte {\"a}hneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgel{\"o}st werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen l{\"a}sst. Um nun den Beweis f{\"u}hren zu k{\"o}nnen, dass tats{\"a}chlich diese Mutation die beobachteten Ph{\"a}notypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgef{\"u}hrt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Ph{\"a}notypen vollst{\"a}ndig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tats{\"a}chlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Ph{\"a}notypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) best{\"a}tigen, sowie weitere Daten erhalten zu k{\"o}nnen, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage {\"u}berexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht m{\"o}glich die SRPK3 in wildtypischen Pr{\"a}paraten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch {\"u}berexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine m{\"o}gliche direkte Interaktion beider Proteine….}, subject = {Drosophila melanogaster}, language = {de} } @phdthesis{Geier2008, author = {Geier, Katja}, title = {Durchflusszytometrische Diagnostik bei Verdacht auf Nijmegen Breakage Syndrom}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27695}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine seltene autosomal- rezessive Erkrankung, die durch ein typisches Erscheinungsbild mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, Immundefizienz sowie durch eine erh{\"o}hte Empfindlichkeit gegen{\"u}ber ionisierender Strahlung und eine erh{\"o}hte Pr{\"a}disposition gegen{\"u}ber malignen Tumoren charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch Mutationen im NBS1-Gen verursacht, welches auf Chromosom 8q21 lokalisiert werden konnte. Das NBS1-Gen Produkt, Nibrin, ist Teil des MRE11-RAD50-Nibrin Proteinkomplexes, welcher eine zentrale Rolle bei der Erkennung und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbr{\"u}chen spielt. Das Fehlen von Nibrin f{\"u}hrt zu einer fehlerhaften DNA-Reparatur und erkl{\"a}rt die verschiedenen klinischen und zellul{\"a}ren Symptome bei NBS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Daten von 40 Patienten ausgewertet, die im Rahmen der Verdachtsdiagnose eines Nijmegen Breakage Syndroms mit der Durchflusszytometrie untersucht wurden. F{\"u}r die Unterscheidung zwischen NBS-positiven und NBS-negativen F{\"a}llen sind folgende Parameter von diagnostischer Relevanz: 1) der Anteil nichtproliferierender Zellen (G0/G1-Phase-Zelle), welcher bei NBS-Patienten meist deutlich h{\"o}her sind als bei gesunden Kontrollen. Sie spiegeln bei erh{\"o}hten Werten die herabgesetzte Mitogenantwort wider. 2) die G2/GF-Ratio als Maß f{\"u}r Strahlensensitivit{\"a}t, welche bei NBS-Patienten charakteristischerweise erh{\"o}ht ist. Die Auswertung der Daten erlaubte es in 22 F{\"a}llen die Verdachtsdiagnose NBS auszuschließen, da diese f{\"u}r beide Parameter Werte im Normalbereich zeigten. In 16 F{\"a}llen ergab sich ein positives Ergebnis mit erh{\"o}htem Anteil nichtproliferierender Zellen und erh{\"o}hter Strahlensensitivit{\"a}t. Unter den positiven F{\"a}llen konnte bei 9 Patienten die Diagnose des Nijmegen Breakage Syndroms mittels Mutationsanalyse best{\"a}tigt werden. Bei 7 Patienten konnte jedoch trotz erh{\"o}hter Strahlensensitivit{\"a}t keine Mutation im NBS1-Gen nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Durchflusszytometrie das Vorliegen einer erh{\"o}hten Strahlensensitivit{\"a}t eindeutig nachweisen kann. Eine erh{\"o}hte Strahlensensitivit{\"a}t ist wiederum ein charakteristisches Merkmal des Nijmegen Breakage Syndroms, da es in direkten Zusammenhang mit dem verursachenden Gendefekt steht. Die Durchflusszytometrie kann daher als ein sinnvolles diagnostisches Verfahren von hoher Sensitivit{\"a}t bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose NBS angesehen und erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings ist die Spezifit{\"a}t des Verfahrens sehr viel geringer. Die Methode der Wahl f{\"u}r die Prim{\"a}rdiagnostik des Nijmegen Breakage Syndroms wird in Zukunft daher die Mutationsanalyse sein.}, subject = {Durchflusscytometrie}, language = {de} } @phdthesis{Kraich2008, author = {Kraich, Michael}, title = {Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberfl{\"a}chenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die {\"u}berlappenden, biologischen Funktionen erkl{\"a}ren lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminos{\"a}ureebene nur etwa 25\% Sequenzidentit{\"a}t besitzen und stark unterschiedliche Affinit{\"a}ten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinit{\"a}t und die Spezifit{\"a}t der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabh{\"a}ngig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien f{\"u}r IL-13 und die extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es m{\"o}gliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuf{\"u}hren.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-{\"a}hnliche Dom{\"a}ne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminos{\"a}urereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten f{\"u}r die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch f{\"u}r die niederaffine Bindung von IL-4 von gr{\"o}ßter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope f{\"u}r IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und {\"u}berlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es m{\"o}glich, ein Strukturmodell der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Dom{\"a}ne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminos{\"a}urerest auf der Oberfl{\"a}che von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzukl{\"a}ren, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach h{\"o}herer Affinit{\"a}t an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinit{\"a}tssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformations{\"a}nderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zus{\"a}tzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen f{\"u}hrt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabh{\"a}ngig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zus{\"a}tzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinit{\"a}t zwischen Ligand und Rezeptor erh{\"o}ht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfl{\"a}che zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette m{\"o}glicherweise einen Mechanismus dar, {\"u}ber den Proteine die Affinit{\"a}t von Wechselwirkungen {\"u}ber einen großen Bereicht variieren k{\"o}nnen, ohne dabei Spezifit{\"a}t einzub{\"u}ssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmolek{\"u}le f{\"u}r die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, k{\"o}nnen die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen {\"u}ber den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Molek{\"u}le zu entwickeln.}, subject = {Renaturierung }, language = {de} } @phdthesis{Schwarz2008, author = {Schwarz, Roland}, title = {Modellierung von Metabolismus, Transkriptom und Zellentwicklung bei Arabidopsis, Listerien und anderen Organismen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27622}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in st{\"a}rker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergest{\"u}tzte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation {\"u}ber Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Ph{\"a}notyps, der Zellgr{\"o}ßenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab.}, subject = {Bioinformatik}, language = {de} } @phdthesis{Berg2008, author = {Berg, Daniela}, title = {Entwicklung von TRAIL-Fusionsproteinen und ihre Wirkung auf Myelomzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27430}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {1. Zusammenfassung L{\"o}sliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die "TNF homology domain" (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekund{\"a}rem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekund{\"a}rem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdom{\"a}ne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekund{\"a}rem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Molek{\"u}ls enth{\"a}lt, die die THD von der Transmembrandom{\"a}ne trennt, nach sekund{\"a}rem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivit{\"a}t der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdom{\"a}ne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDom{\"a}ne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandom{\"a}ne gew{\"a}hrleistet wird, k{\"o}nnte demnach f{\"u}r mTRAIL f{\"u}r eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion n{\"o}tig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion f{\"u}r die Aktivit{\"a}t dieser Liganden hin und bietet die M{\"o}glichkeit, rekombinante l{\"o}sliche Liganden der TNF-Familie mit erh{\"o}hter Aktivit{\"a}t zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann f{\"u}r die Behandlung von Tumorzellen n{\"u}tzlich sein. Es wurde jedoch k{\"u}rzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorf{\"o}rdernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu sch{\"u}tzt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabh{\"a}ngigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NF\&\#1082;B-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabh{\"a}ngig, die Aktivierung des NF\&\#1082;B- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabh{\"a}ngig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um m{\"o}gliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren.}, subject = {TRAIL}, language = {de} } @phdthesis{Mezger2007, author = {Mezger, Markus}, title = {Interaktion zwischen dem humanen Cytomegalievirus, Aspergillus fumigatus, dendritischen Zellen und neutrophilen Granulozyten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27254}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erh{\"o}htes Risiko f{\"u}r opportunistische Infektionen, die haupts{\"a}chlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bek{\"a}mpfung von HCMV und A. fumigatus n{\"a}her untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu k{\"o}nnen, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene F{\"a}rbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es m{\"o}glich, in Abh{\"a}ngigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschl{\"a}uchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molek{\"u}len (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabh{\"a}ngiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig best{\"a}tigt wurde. Als Wachen des Immunsystems m{\"u}ssen DCs Krankheitserreger zu einem fr{\"u}hen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung f{\"u}r humane DCs bisher nur unzureichend gekl{\"a}rt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. F{\"u}r TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, f{\"u}hrte zu einer erh{\"o}hten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antik{\"o}rpern konnte eine m{\"o}gliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor f{\"u}r A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antik{\"o}rpers gegen Dectin-1 war es m{\"o}glich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabh{\"a}ngigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor f{\"u}r A. fumigatus best{\"a}tigt. Wie fortf{\"u}hrende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor f{\"u}r Pilze. Die durchgef{\"u}hrten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erh{\"o}hten Virus- und Pilzinfektionsrisiko f{\"u}r Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis dar{\"u}ber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erh{\"o}hten Empf{\"a}nglichkeit f{\"u}r HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergr{\"o}ßerten Riskio f{\"u}r eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs k{\"o}nnte helfen, die individuelle Gefahr f{\"u}r HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzusch{\"a}tzen.}, subject = {Aspergillus fumigatus}, language = {de} } @phdthesis{Aichinger2007, author = {Aichinger, Eric}, title = {Risikoberechnung bei der Muskeldystrophie Duchenne und der Muskeldystrophie Becker}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27000}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Risikoberechnung in Familien mit Muskeldystrophie Duchenne oder Muskeldystrophie Becker. Unter Ber{\"u}cksichtigung eines Keimzellmosaiks, heterogener Neumutationsraten und der M{\"o}glichkeit homozygot betroffener Frauen.}, language = {de} } @phdthesis{Kleinhenz2008, author = {Kleinhenz, Marco}, title = {W{\"a}rme{\"u}bertragung im Brutbereich der Honigbiene (Apis mellifera)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26866}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In dieser Arbeit untersuche ich das Verhalten von Arbeiterbienen beim Brutw{\"a}rmen, die W{\"a}rme{\"u}bertragung von den Bienen auf die gedeckelte Brut, die thermophysikalischen Eigenschaften des Brutnests und spezielle Aspekte des Brutnestaufbaus, die f{\"u}r dieses Thema relevant sind und bisher nicht untersucht wurden. Meine Arbeit umfasst Verhaltensbeobachtungen und thermografische Messungen an individuellen Bienen, die Simulation des Heizverhaltens von Arbeiterinnen und das Messen der Temperatur{\"a}nderungen in der Wabe, die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und der Zellw{\"a}nde (W{\"a}rmeleitf{\"a}higkeit und Durchl{\"a}ssigkeit f{\"u}r W{\"a}rmestrahlung), die Auswertung von Brutzelltemperaturen als Ergebnis des Verhaltens von Arbeiterbienen, die Analyse der Anzahl und der r{\"a}umlichen Verteilung von Brutl{\"u}cken (Auswertung in 2-D und 3-D bez{\"u}glich beider Wabenseiten) und die Entwicklung spezifischer Computersoftware, die zur Erarbeitung dieser Ergebnisse unverzichtbar ist. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Entdeckung und Beschreibung eines bemerkenswerten, bislang unbekannten Verhaltens der Honigbiene: Die Aufrechterhaltung hoher Thoraxtemperaturen (TTh) bei Langzeitbesuchen in offenen Zellen („L{\"u}cken") die verstreut in der gedeckelten Brutfl{\"a}che vorkommen. Hier zeige ich, dass die Aufrechterhaltung der hohen TTh nicht auf den Zellinhalt (z. B. offene Brut) bezogen ist - in den meisten F{\"a}llen waren die besuchten Zellen ohnehin leer - sondern auf die direkt benachbarte gedeckelte Brut, mit der diese Zellen {\"u}ber gemeinsame Zellw{\"a}nde in Kontakt stehen. Dieses Verhalten liefert eine Erkl{\"a}rung f{\"u}r Langzeitzellbesuche von sehr langer Dauer ohne erkennbare Aktivit{\"a}t, die in fr{\"u}heren Arbeiten beschrieben aber nicht v{\"o}llig verstanden wurden, und es rehabilitiert die scheinbar „faulen" Bienen im Zellinnern. Diesem Verhalten kommt eine große Bedeutung f{\"u}r das Brutw{\"a}rmen zu, da sich der aufgeheizte Thorax tief in der Wabe (fast an der Mittelwand) befindet wo der W{\"a}rmeverlust an die Luft minimiert ist und von wo bis zu 6 umliegende Puppenzellen gleichzeitig gew{\"a}rmt werden k{\"o}nnen. Im Vergleich zum Brutw{\"a}rmeverhalten an der Wabenoberfl{\"a}che (Andr{\"u}cken des Thorax an die Brutdeckel), wo nur 1 oder Teile von 3 Brutdeckeln mit dem Thorax in Ber{\"u}hrung stehen, ist das W{\"a}rmen im Zellinnern mit derselben TTh bis zu 2,6-fach effizienter. Die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und die Simulation des Brutw{\"a}rmeverhaltens unter kontrollierten Bedingungen zeigen, dass sich die Wabe langsam aufw{\"a}rmt und eher ein lokal begrenztes W{\"a}rmen als eine rasche W{\"a}rmeausbreitung {\"u}ber eine große Fl{\"a}che beg{\"u}nstigt. Der Einflussbereich eines einzelnen Zellbesuchers h{\"a}ngt von seiner TTh und der Dauer des Zellbesuchs ab. Anstiege der Bruttemperatur in bis zu 3 Zellen Abstand zum Zellbesucher sind nachweisbar. Das hier beschriebene Brutw{\"a}rmeverhalten im Innern von L{\"u}cken (offenen Zellen) bietet nicht nur neue Einsichten in das Bienenverhalten. Es erm{\"o}glicht auch eine Neubewertung der L{\"u}cken und ihrer N{\"u}tzlichkeit f{\"u}r die Bienen. Eine von mir entwickelte Computersoftware („CombUse 2.0") erm{\"o}glicht es, das Vorkommen und die r{\"a}umliche Verteilung von L{\"u}cken mit hoher Genauigkeit auf der Ebene einzelner Zellen zu erfassen und auszuwerten. Die r{\"a}umliche Verteilung der L{\"u}cken in der gedeckelten Brutfl{\"a}che zeigt, dass schon bei geringen L{\"u}ckenh{\"a}ufigkeiten von ca. 4 bis 10 \%, die in gesunden Kolonien normal sind, eine {\"u}berraschend große Zahl gedeckelter Brutzellen (88 \% bis 99 \%, wenn die dreidimensionale Verteilung ber{\"u}cksichtigt wird) im Einflussbereich von Brut w{\"a}rmenden Zellbesuchern sind. Obwohl das Brutw{\"a}rmeverhalten im Zellinnern schwer zu entdecken und zu beobachten ist, f{\"u}hren die in dieser Arbeit pr{\"a}sentierten Daten zu dem Schluss, dass es sich dabei um einen wichtigen Bestandteil der Nestklimatisierung bei Honigbienen handelt.}, subject = {Biene }, language = {de} } @phdthesis{Hoefling2007, author = {H{\"o}fling, Christine}, title = {Gentherapie bei Fanconi An{\"a}mie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26363}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Unter Fanconi An{\"a}mie versteht man eine rezessiv vererbbare Multisystem-Erkrankung, die einhergeht mit erh{\"o}hter spontaner Chromosomenbr{\"u}chigkeit, sowie erh{\"o}hter Anf{\"a}lligkeit f{\"u}r toxische Substanzen, wie Mitomycin C (MMC) oder Diepoxybutan (DEB).Gentherapeutische Versuche scheitern bei FA letztlich daran, dass bei fortgeschrittener aplastischer An{\"a}mie (= Knochenmarkversagen) die Gewinnung der zur erfolgreichen Transduktion erforderlichen Mengen an CD34 positiven Stamm-Blutzellen schwierig bis unm{\"o}glich ist. Die Fortschritte bei den Fremdspender-Transplantationen lassen erwarten, dass zuk{\"u}nftig nahezu alle FA-Patienten mit dieser Therapieform mit guten Erfolgsaussichten behandelt werden k{\"o}nnen. Insofern ist auch zu erwarten, dass die Option einer somatischen Gentherapie - trotz vielversprechenden Ergebnissen - zuk{\"u}nftig wieder an Bedeutung verlieren wird.}, subject = {Gentherapie}, language = {de} } @phdthesis{Ritze2007, author = {Ritze, Yvonne}, title = {Die Rolle des Neurotransmitters Serotonin bei der Entwicklung von Ethanolsensitivit{\"a}t und Toleranz in Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26271}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Der Neurotransmitter Serotonin spielt ein Rolle bei der Entwicklung von Ethanoltoleranz und Alkoholismus. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Funktion von Serotonin (5HT) im Bezug auf Ethanolsensitivit{\"a}t und Toleranz in Drosophila melanogaster. Pharmakologisch wurden die 5HT Konzentrationen durch F{\"u}ttern eines Vorl{\"a}ufers der 5HT Synthese kurzeitig erh{\"o}ht oder mit einem Syntheseinhibitor reduziert. Die Ver{\"a}nderung der 5HT Konzentrationen mittels dieser Pharmaka hatte jedoch keinen Einfluss auf die Entwicklung von Ethanolsensitivit{\"a}t oder Toleranz. 5HT wird durch den 5HT Transporter (SERT) aus dem synaptischen Spalt in die Pr{\"a}synapse wieder aufgenommen. Die kurzzeitige F{\"u}tterung des SERT Inhibitors Paroxetin f{\"u}hrt zu erh{\"o}hter Ethanolsensitivit{\"a}t und reduzierter Toleranz. Ein {\"a}hnlicher Ph{\"a}notyp wurde in der hypomorphen sert55 Mutante, die eine reduzierte dsert Expression aufweist, beobachtet. Dies legt nahe, dass kurz- wie langfristige Reduktion der SERT Funktion die Entwicklung einer vollst{\"a}ndigen Ethanoltoleranz verhindern. Folglich hat die Verl{\"a}ngerung der 5HT Signaltransduktion im synaptischen Spalt, nicht aber die allgemeine Erh{\"o}hung von 5HT Konzentrationen im Fliegengehirn einen Einfluss auf die Entwicklung von Ethanoltoleranz. Zur genauen Bestimmung der SERT Expression im adulten Gehirn der Fliege wurde ein Drosophila SERT (dSERT) Antik{\"o}rper hergestellt. Mit Hilfe dieses Antik{\"o}rpers konnte gezeigt werden, dass der dSERT mit serotonergen Somata, Axonen und Dendriten kolokalisiert. Ferner sollten 5HT Konzentrationen im synaptischen Spalt durch {\"U}berexpression des wildtypischen dsert in einem Großteil der Neurone mit Hilfe des UAS/GAL4 Systems reduziert werden. Diese Fliegen wiesen weder eine ver{\"a}nderte 5HT Konzentration in den K{\"o}pfen auf noch war die Ethanolsensitivit{\"a}t bzw. Toleranz ver{\"a}ndert. Das kann einerseits daran liegen, dass der dSERT nicht in die Membran integriert wird oder andererseits daran, dass unser Konstrukt nicht funktional ist. Die {\"U}berexpression eines inaktiven dSERTs sollte theoretisch zur Erh{\"o}hung von 5HT Konzentrationen im synaptischen Spalt f{\"u}hren. Wurde ein inaktiver dSERT in den meisten Neuronen der Fliege exprimiert, erh{\"o}hten sich zwar die 5HT Konzentrationen in den K{\"o}pfen der Fliegen, dennoch war das ethanolinduzierte Verhalten nicht ver{\"a}ndert. Zus{\"a}tzlich wurde untersucht, welchen Einfluss die Inhibition der 5HT Aussch{\"u}ttung auf die Entwicklung von Ethanolsensitivit{\"a}t und Toleranz hat. Zur Inhibition der Neurotransmission in serotonergen Zellen wurde ein Tetanus Toxin (TNT) Transgen in Verbindung mit verschiedenen GAL4 Treiberlinien eingesetzt. Die Inhibition von serotonergen und dopaminergen Neuronen mit Hilfe einer GAL4 Linie, die einen Abschnitt des Gens der Dopamin Decarboxylase (ddc) beinhaltet, f{\"u}hrte zu keiner Ver{\"a}nderung von Ethanolsensitivit{\"a}t bzw. Toleranz. F{\"u}r weitere GAL4 Linien wurde zun{\"a}chst das Expressionsmuster neuroanatomisch untersucht. Von vier ausgew{\"a}hlten GAL4 Linien zeigten zwei Expression in serotonergen Neuronen. Die sert1+2-GAL4 Linie mit einem St{\"u}ck Promotorregion des dsert zeigt Expression in 46\% der serotonergen Neuronen. Wurden diese mit Hilfe von Tetanus Toxin inhibiert, zeigten die Fliegen eine leicht aber signifikant erh{\"o}hte Ethanolsensitivit{\"a}t und eine unver{\"a}nderte Toleranz. Die zweite GAL4 Linie enth{\"a}lt ein St{\"u}ck Promotorregion des 5HT1b Rezeptors und zeigt Expression in ebenfalls 46\% der serotonergen Neurone, weitgehend {\"u}berlappend mit der Expression der Linie sert1+2-GAL4. Jedoch exprimiert die 5htr1b-GAL4 Linie zus{\"a}tzlich in vier serotonergen Neuronen, in elf dopaminergen und einem unbekannten Neuron. Interessanterweise ist nach Inhibition der Neurotransmission in diesen Neuronen eine stark erh{\"o}hte Ethanolsensitivit{\"a}t sowie eine reduzierte Ethanoltoleranz zu beobachten. Folglich k{\"o}nnte die Inhibition der Neurotransmission in dopaminergen Neuronen f{\"u}r die Reduktion der Ethanolsensitivit{\"a}t verantwortlich sein. Deshalb wurde die Neurotransmitterausssch{\"u}ttung in dopaminergen Neuronen mit Hilfe der th-GAL4 Linie und TNT unterdr{\"u}ckt und diese Fliegen wurden auf ihre F{\"a}higkeit untersucht, Ethanolsensitivt{\"a}t und/oder Toleranz zu entwickeln. Nach Inhibition der von th-GAL4 getriebenen dopaminergen Neurone wurde eine erh{\"o}hte Ethanolsensitivit{\"a}t gemessen, aber keine signifikant ver{\"a}nderte Ethanoltoleranz. Da die ddc-GAL4 Linie im Vorfeld keinen ethanolinduzierten Verhaltensph{\"a}notyp gezeigt hat, sollte bestimmt werden, welche dopaminergen Neuronen der 5htr1b-GAL4 sowie der th-GAL4 Linie f{\"u}r die erh{\"o}hte Ethanolsensitivit{\"a}t verantwortlich sind. Serotonerge Neuronengruppen, die in die Entwicklung von Ethanolsensitivit{\"a}t und Toleranz involviert sein k{\"o}nnten, sind SE1, SE2, SE3, LP1, LP2, SP1, SP2 und IP, w{\"a}hrend es sich bei den dopaminergen Neuronengruppen um PAL1, PPL1, PPM2, PPM3 und SVP1 handeln k{\"o}nnte. Einige Neurone der 5htr1b-GAL4 Linie projizieren in den Ellipsoidk{\"o}rper, eine Struktur des Zentralkomplexes, f{\"u}r die bereits gezeigt wurde, dass sie in die Entwicklung vonEthanoltoleranz involviert ist. Jedoch muss n{\"a}her untersucht werden, welche Neuronen f{\"u}r die Innervation verantwortlich sind. Daf{\"u}r sollten GAL4 Linien verwendet werden, die eine {\"a}hnliche Expression wie die 5htr1b-GAL4 Linie, aber ausschließlich im Ellipsoidk{\"o}rper, zeigen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass serotonerge und dopaminerge Neurone in die Entwicklung von Ethanolsensitivit{\"a}t und Toleranz in Drosophila melanogaster involviert sind. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine ver{\"a}nderte 5HT Signaltransduktion zu einer reduzierten Toleranz f{\"u}hrt. Weiterf{\"u}hrend ist die Identifizierung von serotonergen Neuronen, die f{\"u}r die Entwicklung von Ethanolsensitivit{\"a}t und/oder Toleranz verantwortlich sind, von großem Interesse. Ziel ist es, die neuronalen Schaltkreise aufzudecken, die den Ph{\"a}nomenen Ethanolsensitivit{\"a}t und Toleranz zugrundeliegen.}, subject = {Ethanol}, language = {de} } @phdthesis{Kampfinger2007, author = {Kampfinger, Katja}, title = {Nachweis einer Mismatch-Reparatur-Defizienz in L5178Y Tk+/--3.7.2C-Mauslymphomzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26023}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizit{\"a}tsermittlung. F{\"u}r die {\"U}berpr{\"u}fung der Gentoxizit{\"a}t stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verf{\"u}gung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den f{\"u}r die Testung notwendigen Ver{\"a}nderungen weitere Ver{\"a}nderungen zu tragen, die zu Reaktionen f{\"u}hren k{\"o}nnen, wie sie in den Prim{\"a}rzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale absch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-t{\"a}tspr{\"u}fung am h{\"a}ufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Ver{\"a}nderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrit{\"a}t des Genoms zu gew{\"a}hrleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch {\"a}ußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die gesch{\"a}digten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu {\"u}berleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Sch{\"a}den und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomsch{\"a}den bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, w{\"a}hrend andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen f{\"u}r alkylierende Agenzien beschrieben ist, f{\"u}hrte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Ph{\"a}notyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Ph{\"a}notyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen gepr{\"u}ft und best{\"a}tigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte f{\"u}r den gezeigten MMR-defizienten Ph{\"a}notyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Ver{\"a}nde-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese f{\"u}hrt nach 260 Aminos{\"a}uren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminos{\"a}uren zu einem Abbruch der Aminos{\"a}uresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information f{\"u}r den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedom{\"a}ne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die f{\"u}r den C-Terminus hingegen, der f{\"u}r die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit f{\"u}r die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erkl{\"a}ren kann. Daraus folgt f{\"u}r den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizit{\"a}tstests, dass die Ber{\"u}cksichtigung ihrer MMR-Defizienz die M{\"o}glichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Bohn2007, author = {Bohn, Holger Florian}, title = {Biomechanik von Insekten-Pflanzen-Interaktionen bei Nepenthes-Kannenpflanzen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26101}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Interaktionen zwischen Insekten und Pflanzen k{\"o}nnen auf chemischen oder mechanischen Faktoren beruhen. Mechanische Faktoren spielen eine besonders wichtige Rolle bei den Fallen karnivorer Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle mechanischer Faktoren in der Interaktion zwischen der Kannenpflanze Nepenthes bicalcarata und der Ameise Camponotus schmitzi aufzukl{\"a}ren, bei der Ameisen Gegenanpassungen zu spezialisierten pflanzlichen Fangstrukturen entwickelt haben. Im Rahmen meiner Arbeit habe ich mich mit den Fragen besch{\"a}ftigt, 1) welche Kannenstrukturen und welche Mechanismen f{\"u}r den Fang von Arthropoden wichtig sind und 2) welche speziellen Anpassungen C. schmitzi-Ameisen f{\"u}r das Leben auf ihrer karnivoren Wirtspflanze besitzen. Bisher wurde angenommen, dass Nepenthes-Kannen Tiere mit Hilfe von rutschigen Wachskristallschichten fangen. Ich konnte zeigen, dass ein weiterer, bisher unbekannter Fangmechanismus existiert, welcher auf speziellen Oberfl{\"a}cheneigenschaften des Kannenrandes (Peristom) und "Insekten-Aquaplaning" basiert. Das Peristom besitzt eine regelm{\"a}ßige Mikrostruktur, welche daf{\"u}r sorgt, dass die Oberfl{\"a}che vollst{\"a}ndig mit Wasser benetzbar ist, so dass sie bei feuchter Witterung von homogenen Fl{\"u}ssigkeitsfilmen {\"u}berzogen ist. Auf dem trockenen Peristom k{\"o}nnen Ameisen ohne Schwierigkeiten laufen und Nektar von den am inneren Peristomrand gelegenen Nektarien ernten. Wird die Oberfl{\"a}che aber beispielsweise durch Regen nass, rutschen die meisten Tiere ab und st{\"u}rzen in die Kanne. Messungen der Reibungskr{\"a}fte von Weberameisen (Oecophylla smaragdina) auf dem Peristom von N. bicalcarata zeigten, dass Fl{\"u}ssigkeitsfilme auf der Oberfl{\"a}che die Anhaftung der Haftorgane (Arolien) verhindern, und dass die Mikrostruktur des Peristoms auch den Einsatz der Krallen unterbindet. Versuche an Nepenthes alata zeigten dar{\"u}ber hinaus, dass dieser Fangmechanismus des Peristoms auch f{\"u}r Nepenthes-Arten mit wachsbereifter Kanneninnenwand essentiell, und die Wachsschicht eher f{\"u}r die Retention gefangener Tiere wichtig ist. Zur Analyse der {\"o}kologischen Auswirkungen des "Aquaplaning"-Fangmechanismus habe ich die Peristomfeuchte von Nepenthes rafflesiana var. typica-Kannen zeitgleich mit meteorologischen Daten im Feld kontinuierlich aufgezeichnet und mit Experimenten zur Beurteilung der Fangeffizienz der Kannen kombiniert. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass die Kannen abh{\"a}ngig vom Befeuchtungsgrad des Peristoms zeitweise sehr effiziente Fallen mit Fangraten von 80\% sein k{\"o}nnen, w{\"a}hrend sie zu anderen Zeiten vollkommen ineffizient sind. Die Variation der Peristomfeuchte wird durch Regen, Kondensation und von den Peristomnektarien sezerniertem Nektar verursacht. Es ist zu vermuten, dass die nur zeitweise und unvorhersehbare Aktivierung der Nepenthes-Kannenfallen durch N{\"a}sse der Evolution von Vermeidungsstrategien bei Beutetieren entgegenwirkt. Im Rahmen der Untersuchungen, welche mechanischen Anpassungen C. schmitzi-Ameisen f{\"u}r das Leben auf N. bicalcarata besitzen habe ich mich auf die Fragen konzentriert, wie es den Ameisen gelingt den Peristom-Fangmechanismus zu umgehen und welche Anpassungen sie besitzen um in der Kannenfl{\"u}ssigkeit tauchend und schwimmend nach Nahrung zu suchen. Im Gegensatz zu generalistischen Arten st{\"u}rzen C. schmitzi-Ameisen auf dem nassen Peristom nicht ab. Durch selektive Manipulation der tarsalen Haftstrukturen konnte ich demonstrieren, dass die Arolien f{\"u}r die Peristomlauff{\"a}higkeit der C. schmitzi-Ameisen eine wesentliche Rolle spielen. F{\"u}r das Furagieren in der Kannenfl{\"u}ssigkeit verf{\"u}gen C. schmitzi-Ameisen {\"u}ber ein sich wiederholendes, stereotypes Verhaltensmuster, welches aus einer Unterwasserlauf- und einer Oberfl{\"a}chenschwimmphase besteht. Meine Untersuchungen dieses Verhaltensmusters zeigten, dass die Ameisen am Ende der Unterwasserlaufphase mit Hilfe ihres stets vorhandenen Auftriebs zur Fl{\"u}ssigkeitsoberfl{\"a}che aufsteigen. Dabei taucht ein Teil ihres Hinterleibs aus der Kannenfl{\"u}ssigkeit auf, was den Ameisen die Sauerstoffaufnahme aus der Luft erm{\"o}glicht. Nach dem Auftauchen schwimmen C. schmitzi-Ameisen mittels schneller Beinbewegungen an der Oberfl{\"a}che der Kannenfl{\"u}ssigkeit. Dabei {\"a}hnelt die Bewegungskoordination ihrer Beine dem bei Ameisen f{\"u}r die Fortbewegung an Land typischen Dreifußgang. Ein Vergleich der Kinematik von schwimmenden und laufenden C. schmitzi-Ameisen hat gezeigt, dass schwimmende Ameisen ihre Beine in der Schlagphase mit einer h{\"o}heren Winkelgeschwindigkeit als in der R{\"u}ckholphase bewegen, w{\"a}hrend dies bei den laufenden Tieren genau umgekehrt ist. Ferner strecken schwimmende Ameisen ihre Beine w{\"a}hrend der Schlagphase weiter aus als in der R{\"u}ckholphase, wohingegen laufende Ameisen in beiden Bewegungsphasen vergleichbare Beinradien aufweisen. Dies l{\"a}sst den Schluss zu, dass die Schwimmkinematik der C. schmitzi-Ameisen eine abgewandelte Form ihrer Laufkinematik darstellt, welche f{\"u}r die Erzeugung von Vortrieb im Wasser optimiert wurde.}, subject = {Biomechanik}, language = {de} } @phdthesis{Baier2007, author = {Baier, Andrea}, title = {Architektur meiotischer Chromosomen : Eigenschaften und Evolution des Synaptonemalkomplexproteins SYCP3}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25995}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Meiose ist eine besondere Art der Zellteilung, die w{\"a}hrend der Keimzellreifung stattfindet. Sie umfasst zwei aufeinander folgende Zellteilungen mit nur einer DNA-Repli-kationsrunde, wodurch aus einer diploiden Ausgangszelle vier haploide Gameten entstehen. In der ersten meiotischen Teilung werden die homologen Chromosomen miteinander rekombiniert und voneinander getrennt, in der Meiose II findet die Trennung der Schwesterchromatiden statt. F{\"u}r den korrekten Ablauf dieser Prozesse musste sich eine spezielle molekulare Architektur des meiotischen Chromosoms entwickeln welche die Synapse der homologen Chromosomen durch den Synaptonemalkomplex (SC) beinhaltet. SCs sind evolution{\"a}r hochkonservierte, meiosespezifische Proteinkomplexe, die eine zentrale Bedeutung f{\"u}r Synapse, Rekombination und Segregation der homologen Chromosomen haben. Ein SC besteht aus zwei lateralen Elementen (LEs), die den Achsen der homologen Chromosomen aufgelagert sind, einer zentralen Region (CR) und einem zentralen Element (CE). Eine Hauptstrukturkomponente der LEs in Vertebraten ist das Synaptonemalkomplexprotein, SYCP3. Um die molekulare Architektur des SC besser zu verstehen und die Bedeutung von SYCP3 f{\"u}r die Zusammenlagerung der LE aufzudecken, wurden die Polymerisationseigenschaften von SYCP3, exprimiert in somatischen Zellen, erforscht. In diesem experimentellen Ansatz polymerisierte SYCP3 autonom zu stabilen, h{\"o}her geordneten, filament{\"o}sen Strukturen. Die „Coiled-Coil"-Dom{\"a}ne und die flankierenden, evolution{\"a}r konservierten Motive sind dabei notwenig, und nach Deletion des weniger konservierten N-terminalen Bereichs auch ausreichend f{\"u}r die Bildung der h{\"o}her geordneten Strukturen. Der N-Terminus hingegen spielt eine Rolle in der Stabilit{\"a}t der Polym{\"a}rstrukturen, welche durch Phosphorylierung zweier Serinreste im N-terminalen Bereich beeinflusst werden k{\"o}nnte. Obwohl die Struktur des SC in der Evolution hochkonserviert ist, sind die Protein-komponenten auf Aminos{\"a}uresequenzebene sehr unterschiedlich und weisen wenn {\"u}berhaupt eine strukturelle Homologie in ihrer Dom{\"a}nenorganisation auf. Um den SC-Aufbau und dessen Funktion besser verstehen zu k{\"o}nnen, wurden die orthologen SC-Proteine zwischen taxonomisch entfernten Spezies Ratte und Medaka verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass trotz der Unterschiede in den Aminos{\"a}uresequenzen die sich in den letzen 450 Millionen Jahren zwischen Fisch- und S{\"a}ugern-SYCP3 akkumuliert haben, die Eigenschaften der Proteine vergleichbar sind, und das sie unter experimentellen Bedingungen miteinander interagieren und zu h{\"o}her geordneten Strukturen kopolymerisieren k{\"o}nnen.}, subject = {Meiose}, language = {de} } @phdthesis{Frentzen2007, author = {Frentzen, Alexa}, title = {Posttranskriptionale Regulation der Internalinexpression und alternative Internalin-unabh{\"a}ngige Aufnahme von Listeria monocytogenes in Animalzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25631}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Listeria monocytogenes ist ein weit verbreitetes, Gram-positives humanpatho-genes Bakterium, welches in immunsupprimierten Personen das Krankheitsbild der Listeriose ausl{\"o}sen kann. Der Infektionszyklus der Listerien im Wirt ist im Hinblick auf die Pathogenese dieses Erregers intensiv untersucht worden. Die Regulation der verschiedenen beteiligten Virulenzfaktoren unterliegt in L. monocytogenes einer starken Kontrolle, die einerseits durch regulatorische Proteine aber auch durch Umweltfaktoren beeinflusst wird. Die Mechanismen, die auf transkriptionaler wie auch auf translationaler Ebene die Expression verschiedener listerieller Virulenzgene regulieren, wurden k{\"u}rzlich n{\"a}her charakterisiert. Es wurden f{\"u}r verschiedene listerielle Virulenzgene Riboswitch-mechanismen zur Expressionskontrolle in Listerien neu beschrieben. Durch Vorarbeiten wurde auch f{\"u}r das inlAB-Operon ein posttranskriptionaler Regu-lationsmechanismus postuliert. Dabei wurde der anaerobe Stoffwechsel der Listerien als m{\"o}glicher Ausl{\"o}ser f{\"u}r die beobachtete Translationssteigerung des inlA- und inlB-Gens diskutiert. Innerhalb der vorliegenden Arbeit sollte nun weitergehend untersucht werden, in welchem Bereich der Sequenz des inlAB-Operons sich regulatorische Strukturen zur posttranskriptionalen Regulation unter anaeroben Wachstumsbedingungen befinden. Dazu wurden verschiedene Mutanten mit unterschiedlichen Deletionen im inlAB-Operon konstruiert und die Transkription und Translation sowohl des inlA-, als auch des inlB-Gens betrachtet. Eine Deletion im aroA-Gen bewirkt das Wachstum der Bakterien bei anaerobem Stoffwechsel. Diese Deletion wurde in die konstruierten St{\"a}mme eingef{\"u}gt, um die Expression der Gene unter den verschiedenen Wachstumsbedingungen vergleichen zu k{\"o}nnen. Außerdem wurden verschiedene gus-Reportergen-Fusionsmutanten und Promotor-austauschmutanten konstruiert, um quantitativ aussagekr{\"a}ftigere Daten zu erheben. Die Charakterisierung der Mutanten ließ erkennen, dass keiner der deletierten Bereiche des inlAB-Operons von L. monocytogenes f{\"u}r die beobachtete Translationssteigerung im inlA-Gen bei anaerobem Stoffwechsel verantwortlich zu sein scheint. Das inlB-Gen war innerhalb der hier gezeigten Experimente nicht posttranskriptional reguliert, wie im Vorfeld postuliert. Nach plasmidkodierter Expression verschiedener Bereiche des inlAB-Operons konnte, verglichen mit genomischer Expression, keine Ver{\"a}nderung in der inlA-Expression beobachtet werden. Die m{\"o}gliche Beteiligung eines potentiellen Regulatorproteins konnte innerhalb dieser Arbeit daher nicht n{\"a}her eingegrenzt werden. Auch ein Einfluss der regulatorischen Faktoren Hfq und CcpA auf die Expression des InlA Proteins in der L. monocytogenes \&\#916;aroA-Mutante konnte nicht gefunden werden. Es zeigte sich interessanterweise außerdem, dass weitere Virulenzgene wie actA und hly unter den anaeroben Bedingungen ebenfalls eine Translations-steigerung zeigten. Somit stellt sich abschließend die Frage, ob es sich bei der beobachteten Translationssteigerung des inlA-Gens wirklich um einen durch bestimmte Strukturen in der inlAB-mRNA ausgel{\"o}sten Mechanismus handelt. L. monocytogenes ist als intrazellul{\"a}r replizierendes, Gram-positives Bakterium interessant f{\"u}r den Einsatz in immun- und tumortherapeutischen Anwendungen. Attenuierte L. monocytogenes-St{\"a}mme wurden dazu bereits erfolgreich im Mausmodell als Tr{\"a}gerbakterien f{\"u}r Impfstoffstrategien eingesetzt. Die gezielte Infektion von Geweben ist jedoch aufgrund des wenig ausgepr{\"a}gten Zelltropismus der Listerien im Wirt bisher ein Problem f{\"u}r einen Einsatz in bakterienbasierten Anwendungen, wie z.B. der Tumor- oder Gentherapie. Innerhalb dieser Arbeit wurden L. monocytogenes-St{\"a}mme konstruiert, bei denen chromosomal das f{\"u}r die Integrase codierende Gen gegen das Gen f{\"u}r das Staphylokokken Protein A (SPA) unter der Kontrolle listerieller Promotoren ausgetauscht wurde. Die erfolgreiche Oberfl{\"a}chenlokalisation von Protein A in der Zellwand von Listerien konnte im Western Blot oder in funktionellen Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen in Mikroskop- und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Diese St{\"a}mme sollen im Cell Targeting zur gezielten Infektion von Geweben eingesetzt werden. Dazu konnten die Bakterien {\"u}ber Herceptin®-HER2/neu-vermittelte Adh{\"a}sion an SK-BR-3-Zellen erfolgreich in diese aufgenommen werden und innerhalb dieser replizieren. Die neu konstruierten Listeria-St{\"a}mme zeigten im Mausmodell keine Ver{\"a}nderung in ihrer Virulenz verglichen mit nicht-SPA-exprimierenden St{\"a}mmen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Antik{\"o}rper-Rezeptor-vermittlelte Aufnahme der Listerien in Zellen stellt einen neuen, bisher nicht beschriebenen Mechanismus dar, der in vielen therapeutischen Anwendungen zur Infektion spezifischer Gewebe durch Listerien genutzt werden kann.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} } @phdthesis{Hampel2007, author = {Hampel, Stefanie}, title = {Funktionelle Analyse des Einflusses von putativen T-Beta-H-positiven Neuronen auf das ethanolinduzierte Verhalten von Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25600}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Es sollten neuronale Netzwerke in Drosophila melanogaster identifiziert werden, die in die Entwicklung von ethanolinduziertem Verhalten involviert sind. Mittels der Tyramin-beta-Hydroxylase (TbH) wird der letzte Schritt der Biosynthese von Oktopamin aus Tyramin gew{\"a}hrleistet. TbHM18 Mutanten entwickeln eine reduzierte Ethanoltoleranz und haben keine nachweisbaren Oktopamin Konzentrationen (MONASTIRIOTI et al. 1996; SCHOLZ et al. 2000). Die molekulargenetische Ursache dieser Mutante wurde n{\"a}her untersucht. Wahrscheinlich ist die Deletion von einem Teil des Intron 1, des Exon 2 und einem Teil des Intron 2 des TbH-Gens verantwortlich f{\"u}r den Verlust der Tyramin-beta-Hydroxylase. Die Deletion der kodierenden Sequenz f{\"u}hrt jedoch nicht zu einem Leserasterschub in der Aminos{\"a}uresequenz. Demzufolge k{\"o}nnte ein verk{\"u}rztes Protein hergestellt werden. Ferner gibt es zwei Transkripte des TbH-Gens, woraus eventuell zwei Proteine exprimiert werden k{\"o}nnten. Ein Protein w{\"a}re die Tyramin-beta-Hydroxylase und das andere k{\"o}nnte eine Dopamin-beta-Hydroxylase sein. Um m{\"o}glicherweise spezifische putative Subsets von T\&\#61538;H-positiven Neuronen zu markieren, wurden verschiedene GAL4-Treiberlinien mit Hilfe unterschiedlicher Fragmente der Promoterregion des TbH-Gens hergestellt. Mittels des GAL4/UAS Systems konnte die Neurotransmitteraussch{\"u}ttung in putativen TbH-positiven Neuronen der TbH-GAL4-Linien inhibiert werden. Auf diese Weise sollte die Funktion der putativen TbH-positiven Neurone w{\"a}hrend der Entwicklung von Ethanolsensitivit{\"a}t und Toleranz untersucht werden. Das Transgen Tetanustoxin wurde mit der 1.3TbH-GAL4 Treiberlinie in einem bestimmten Set von Neuronen exprimiert. Die Inhibition der Synaptobrevin-abh{\"a}ngigen Neurotransmission in den 1.3T\&\#61538;H-GAL4-positiven Neuronen beeinflusst nicht das ethanolinduzierte Verhalten. Hingegen das Ausschalten der Erregbarkeit der Zellen mit Hilfe eines UAS-Kir2.1 Transgens resultiert in erh{\"o}hter Resistenz gegen{\"u}ber Ethanol. Das heißt, dass Synaptobrevin-unabh{\"a}ngige zellul{\"a}re Mechanismen der Zellen notwendig sind, um ethanolinduziertes Verhalten zu regulieren. Die 1.3TbH-GAL4-Linie exprimiert in einem sehr spezifischen Subset von Neuronen GAL4, bzw. Effektoren. Insgesamt werden \&\#8776; 10 Zellen detektiert. Davon liegen die Somata zweier Neurone caudal und projizieren in die Region der ersten und vierten Bande des F{\"a}cherf{\"o}rmigen K{\"o}rpers. Weitere kleine Ansammlungen von acht Zellen k{\"o}nnen um den {\"O}sophagus und im Bereich des Sub{\"o}sophagialganglion verzeichnet werden. Die mit GFP markierten Neurone exprimieren wahrscheinlich kein Oktopamin. Ferner resultierte die Inhibition der synaptischen Transmission von 6.2TbH-GAL4-positiven Neuronen, mit Hilfe von Tetanustoxin, in einer erh{\"o}hten Ethanolsensitivit{\"a}t. Ebenfalls zu einer ethanolinduzierten Verhaltens{\"a}nderung f{\"u}hrt die Inaktivierung der 6.2TbH-GAL4 Zellen mittels eines UAS-Kir2.1 Transgens. Dabei entwickeln die Fliegen eine erh{\"o}hte Ethanolresistenz. Somit w{\"a}re m{\"o}glich, dass die Entwicklung von Ethanolsensitivit{\"a}t und Resistenz {\"u}ber verschiedene zellul{\"a}re Mechanismen reguliert werden. Die 6.2TbH-GAL4-Linie erm{\"o}glicht die Transgen-Expression in 65-70 Neuronen. Diese innerverieren u.a. das Sub{\"o}sophagialganglion, den {\"O}sophagus, den Ellipsoid K{\"o}rper, das laterale und das dorso-laterale Protocerebrum. F{\"u}nf der Neurone, die sich durch die 6.2TbH-GAL4 Treiberlinie markieren lassen, exprimieren Oktopamin. Dazu geh{\"o}rt ein VUM-Neuron und vier große caudale Zellen. Eine weitere putativ oktopaminerge GAL4-Linie Tdc2-GAL4 wurde mit der UAS-Kir2.1 Effektorlinie gekreuzt und die Nachkommen im Inebriometer gemessen. Bei Inaktivierung der Erregbarkeit der Tdc2-positiven Neurone resultiert dies in einer erh{\"o}hten Ethanolsensitivit{\"a}t, hingegen in keiner Ver{\"a}nderung der Toleranz. Die reduzierten Levels an Oktopamin spielen dabei wahrscheinlich eine Rolle. Hingegen regulieren eventuelle neurosekretorische Zellen {\"u}ber andere Mechanismen die Ethanolresistenz, wie die 6.2TbH-GAL4, UAS-Kir2.1 Fliegen zeigen. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Neuronencluster f{\"u}r verschiedene ethanolinduzierte Verhaltensantworten verantwortlich sind. Da wahrscheinlich neurosekretorische Zellen des PI die Ethanolresistenz beeinflussen (RODAN et al. 2002), hingegen den Zentralkomplex-innervierende Zellen eher f{\"u}r die Entwicklung von Ethanolsensitivit{\"a}t und Toleranz notwendig sind (URIZAR et al. 2007).}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @phdthesis{Weniger2007, author = {Weniger, Markus}, title = {Genome Expression Pathway Analysis Tool - Analyse und Visualisierung von Microarray Genexpressionsdaten unter genomischen, proteomischen und metabolischen Gesichtspunkten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25392}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Messung der Genexpression ist f{\"u}r viele Bereiche der Biologie und Medizin wichtig geworden und unterst{\"u}tzt Studien {\"u}ber Behandlung, Krankheiten und Entwicklungsstadien. Microarrays k{\"o}nnen verwendet werden, um die Expression von tausenden mRNA-Molek{\"u}len gleichzeitig zu messen und erm{\"o}glichen so einen Einblick und einen Vergleich der verschiedenen zellul{\"a}ren Bedingungen. Die Daten, die durch Microarray-Experimente gewonnen werden, sind hochdimensional und verrauscht, eine Interpretation der Daten ist deswegen nicht einfach. Obwohl Programme f{\"u}r die statistische Auswertung von Microarraydaten existieren, fehlt vielen eine Integration der Analyseergebnisse mit einer automatischen Interpretationsm{\"o}glichkeit. In dieser Arbeit wurde GEPAT, Genome Expression Pathway Analysis Tool, entwickelt, das eine Analyse der Genexpression unter dem Gesichtspunkten der Genomik, Proteomik und Metabolik erm{\"o}glicht. GEPAT integriert statistische Methoden zum Datenimport und -analyse mit biologischer Interpretation f{\"u}r Genmengen oder einzelne Gene, die auf dem Microarray gemessen werden. Verschiedene Typen von Oligonukleotid- und cDNAMicroarrays k{\"o}nnen importiert werden, unterschiedliche Normalisierungsmethoden k{\"o}nnen auf diese Daten angewandt werden, anschließend wird eine Datenannotation durchgef{\"u}hrt. Nach dem Import k{\"o}nnen mit GEPAT verschiedene statische Datenanalysemethoden wie hierarchisches, k-means und PCA-Clustern, ein auf einem linearen Modell basierender t-Test, oder ein Vergleich chromosomaler Profile durchgef{\"u}hrt werden. Die Ergebnisse der Analysen k{\"o}nnen auf H{\"a}ufungen biologischer Begriffe und Vorkommen in Stoffwechselwegen oder Interaktionsnetzwerken untersucht werden. Verschiedene biologische Datenbanken wurden integriert, um zu jeder Gensonde auf dem Array Informationen zur Verf{\"u}gung stellen zu k{\"o}nnen. GEPAT bietet keinen linearen Arbeitsablauf, sondern erlaubt die Benutzung von beliebigen Teilmengen von Genen oder biologischen Proben als Startpunkt einer neuen Analyse oder Interpretation. Dabei verl{\"a}sst es sich auf bew{\"a}hrte Datenanalyse-Pakete, bietet einen modularen Ansatz zur einfachen Erweiterung und kann auf einem verteilten Computernetzwerk installiert werden, um eine große Zahl an Benutzern zu unterst{\"u}tzen. Es ist unter der LGPL Open-Source Lizenz frei verf{\"u}gbar und kann unter http://gepat.sourceforge.net heruntergeladen werden.}, subject = {Microarray}, language = {de} } @phdthesis{Tischner2007, author = {Tischner, Denise}, title = {Mechanistische Untersuchungen zur Therapie von Multipler Sklerose am Beispiel der Experimentellen Autoimmunen Encephalomyelitis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25258}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {No abstract available}, subject = {Autoimmunit{\"a}t}, language = {de} } @phdthesis{Schultheis2007, author = {Schultheis, Christina}, title = {Die geschlechtsbestimmende Region des Platyfisches Xiphophorus maculatus auf den Geschlechtschromosomen X und Y: Molekulare Analyse der genomischen Struktur und molekulargenetische Untersuchung von Genkandidaten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25170}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Mit {\"u}ber 24.000 Arten sind etwa die H{\"a}lfte aller heute lebenden Wirbeltiere Fische. Im Gegensatz zu V{\"o}geln oder S{\"a}ugetieren weisen Fische eine erstaunliche Vielfalt und Variabilit{\"a}t der Geschlechtsbestimmungsmechanismen auf. S{\"a}mtliche Formen von Zwittrigkeit sowie umweltbedingte und genetische Geschlechtsbestimmung sind beschrieben worden. Die molekularen Grundlagen der genetischen Geschlechtsbestimmung bei Fischen sind jedoch weitgehend unbekannt. F{\"u}r einige Fischarten, wie etwa der Zebrafisch, die beliebte Modellorganismen zur Untersuchung z.B. von Krankheiten sind, liegen bereits sequenzierte Genome vor. Dennoch sind diese Modellorganismen aufgrund bisher nicht identifizierbarer Geschlechtschromosomen oder fehlender geschlechtsgebundener molekularer Marker als Modellorganismen zur Untersuchung der genetischen Geschlechtsbestimmung und der Evolution der Geschlechtschromosomen ungeeignet. Bei Stichling und Medaka, ebenfalls Fische mit vollst{\"a}ndig sequenzierten Genomen, konnte hingegen die geschlechtsbestimmende Region identifiziert werden. Im Medaka ist bereits das geschlechtsbestimmende Gen identifiziert worden, eine Y-spezifische Kopie des Gens dmrt1. Dmrt1bY konnte aber lediglich in einigen Medaka Arten nachgewiesen werden und stellt somit keinesfalls das universelle geschlechtsbestimmende Gen der Fische dar. Da die geschlechtsbestimmenden Regionen von Medaka und Stichling evolution{\"a}r gesehen relativ jung und linienspezifisch sind, spiegeln sie nur begrenzt den evolution{\"a}ren Verlauf der Entstehung von Geschlechtschromosomen und Geschlechtsbestimmungsmechanismen wider. Der Platyfisch Xiphophorus maculatus ist ein hervorragender Modellorganismus zur Untersuchung der Geschlechtsbestimmung und Evolution von Geschlechtschromosomen. Er wird seit Ende 1920 zur Untersuchung von malignen Melanomen verwendet. Interspezifische Hybride bilden durch die kreuzungsbedingte Aktivierung eines Tumorlocus erbliche Melanome aus. Der Tumorlocus konnte bereits molekular identifiziert werden. Er entspricht dem Onkogen Xmrk, das durch eine Xiphophorus-spezifische Duplikation des Protoonkogens egfrb gebildet worden ist. Onkogen und Protoonkogen, die beide f{\"u}r epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren codieren, befinden sich in der Subtelomerregion auf den Geschlechtschromosomen des Platyfisches. Sie flankieren die etwa 1 Mb große geschlechtsbestimmende Region. Neben dem geschlechtsbestimmenden Locus sind verschiedene pigmentzelldefinierende Loci in dieser Region vorzufinden. Die Geschlechtschromosomen X und Y des Platyfisches sind sehr homolog, lassen sich aber sowohl cytogenetisch als auch genetisch gut voneinander unterscheiden. Zur Untersuchung der genetischen Struktur der geschlechtsbestimmenden Region und zur Identifizierung des geschlechtsbestimmenden Gens mittels positioneller Klonierung, wurde eine artifizielle Bakterienchromosom-(BAC) Bibliothek aus m{\"a}nnlichen Platyfischen (Genotyp XY) angelegt. Onkogen und Protoonkogen sowie verschiedene andere X- und Y-chromosomale molekulare Marker wurden als Startpunkte f{\"u}r „Chromosomen-Walking" und den Aufbau von X- und Y-chromosomalen artifizielle Bakterienchromosom (BAC)-Contigs verwendet. Hauptaufgabe meiner Doktorarbeit war die Erweiterung und physikalische Verkn{\"u}pfung verschiedener X- und Y-chromosomaler Contigs mittels molekularbiologischer und cytogenetischer Methoden sowie die Identifizierung von Genen mittels Bioinformatik und funktioneller Analyse. Bis zum jetzigen Zeitpunkt decken die BAC-Contigs 3,1 Mb auf dem Y-Chromosom und 3,8 Mb auf dem X-Chromosom in der geschlechtsbestimmenden Region ab. Sie stellen mitunter die gr{\"o}ßten geschlechtschromosomalen Contigs bei Fischen dar. Die X- und Y-chromosomalen Contigs werden derzeit in Kollaboration mit dem Sequenzierungszentrum Genoscope in Frankreich komplett durchsequenziert. Erste Sequenzanalysen weisen auf eine molekulare Differenzierung zwischen den X- und Y-Geschlechtschromosomen in der geschlechtsbestimmenden Region hin. Es konnten ein duplizierter Bereich auf dem Y Chromosom sowie eine Inversion in der geschlechtsbestimmenden Region identifiziert werden. Nichthomologe Rekombinationsereignisse zwischen transponierbaren Elementen und wiederholende Sequenzen sind mutmaßlich an dieser molekularen Umordnung beteiligt. Solche transponierbaren und sich wiederholenden Elemente akkumulieren in der geschlechtsbestimmenden Region und erschwerten auch maßgeblich Aufbau und Ausweitung der geschlechtschromosomalen Contigs. W{\"a}hrend die meisten Elemente auf beiden Geschlechtschromosomen zu finden sind, konnten auch Y-spezifische Kopien nachgewiesen werden, wie beispielsweise der endogene Retrovirus foamy. Eine Reihe von Genkandidaten wurden in der geschlechtsbestimmenden Region identifiziert. Einige stellen aussichtsreiche Kandidaten f{\"u}r den geschlechtsbestimmenden Locus dar. So ist das Gen fredi, das f{\"u}r einen putativen Transkriptionsfaktor mit Helix-Turn-Helix Motiv codiert, im Hoden stark exprimiert. Verschiedene fredi Kopien sind auf dem X und Y Chromosom in der geschlechtsbestimmenden Region identifiziert worden. Interessanterweise ist die codierende Sequenz der X-chromosomalen fredi Kopien durch ein transponierbares Element zerst{\"o}rt. Die Y-chromosomalen Kopien sind hingegen scheinbar nicht beeintr{\"a}chtigt. Zwei weitere miteinander verwandter Genkandidaten namens fah und tan, die bislang f{\"u}r Genprodukte mit unbekannten Eigenschaften codieren, liegen nebeneinander in der geschlechtsbestimmenden Region vor. Expressionsanalysen beider Gene weisen eine spezifische Expression im Ovar und zwar in der vegetativen Hemisph{\"a}re der Oocyten auf. Orthologe Gene wurden in Medaka und Zebrafisch identifiziert und kloniert. Expressionsanalysen in Medaka zeigten eine Ovar-spezifische Transkription wie in Xiphophorus, w{\"a}hrend im Zebrafisch fah und tan ubiquit{\"a}r exprimiert sind. Interessanterweise konnte im Platyfisch eine Spleißvariante von fah identifiziert werden, die auch im Hoden exprimiert ist. Dies macht fah zu einem vielversprechenden Kandidaten f{\"u}r den geschlechtsbestimmenden Locus. Die genomischen Regionen, in der fah und tan bei anderen Fischarten wie Medaka, Zebrafisch und Kugelfisch identifiziert wurden, zeigen hohe Syntenie zur geschlechtsbestimmenden Region des Platyfisches und k{\"o}nnten auch bei diesen Fischarten eine Rolle in der Geschlechtsbestimmung spielen. Ein einziges Gen, das mit fah und tan verwandt ist, konnte auch in Maus, Huhn und Frosch nachgewiesen werden. Interessanterweise konnte auf dem menschlichen X-Chromosom eine mit Stoppcodons durchzogene, zu fah/tan homologe Pseudogene Sequenz identifiziert werden. Diese Syntenie zwischen Geschlechtschromosomen von Fischen und S{\"a}ugern k{\"o}nnte auf eine evolution{\"a}r sehr alte geschlechtsbestimmende Region der Wirbeltiere hindeuten. Zusammenfassend hat diese Arbeit neben neuen Erkenntnissen {\"u}ber die Evolution der Geschlechtschromosomen bei Fischen verschiedene Genkandidaten f{\"u}r den geschlechtsbestimmenden Locus geliefert, die nun auch funktionell analysiert werden m{\"u}ssen.}, subject = {Geschlechtsbestimmung}, language = {de} } @phdthesis{Golitschek2007, author = {Golitschek, Robert von}, title = {Charakterisierung von genomischer Instabilit{\"a}t mit Hilfe der Spektralen Karyotypisierung beim Werner-Syndrom}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24957}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals Metaphasen von Fibroblastenkulturen (AA, WL, SCH, H-51) von Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Werner Syndrom (WS) mit der Spektralen Karyotypisierung (SKY) analysiert. Die Auswertung best{\"a}tigte in allen vier Zelllinien (ZLL) die zuvor mit konventionellen Methoden (z.B. mit G- und R-B{\"a}nderung) etablierten zytogenetischen Charakteristika des WS in Form des „Variegated Translocation Mosaicism" (VTM) und der im zeitlichen Verlauf einer Zellkultur vorherrschenden zytogenetischen, dominanten Klone, deren Eigenschaften mit den drei Schlagw{\"o}rtern „clonal attenuation", „clonal succession" und „clonal expansion" bereits durch Salk et al. [28] treffend umschrieben wurden. Alle ZLL wurden nach 7 oder 8 Passagen seneszent, einer f{\"u}r WS-Fibroblasten typischen, reduzierten Lebensspanne. In der genaueren Analyse der aberranten Metaphasen war SKY den konventionellen Methoden deutlich {\"u}berlegen. W{\"a}hrend bei Salk et al. in 1005 Metaphasen 271 Br{\"u}che entdeckt wurden, wurden mit SKY in 69 Metaphasen 108 Br{\"u}che eindeutig klassifiziert, was außerdem eine detailliertere Einteilung der Klone in unterschiedliche, teilweise singul{\"a}re Subklone erforderlich machte. Die bisher noch nie in WS-Zellen festgestellten trizyklischen Chromosomenaustausche und dreifach-rekombinanten Chromosomen zeigten die F{\"a}higkeit der SKY-Methode, komplexe genomische Ver{\"a}nderungen genau darzustellen. Zudem wurde erstmals ein pseudotetraploider Subklon T mit 87-90 Chromosomen entdeckt, der aus der Mutterkultur WL stammte und ein ungew{\"o}hnliches Wachstumspotential von etwa 45 Populationsverdoppelungen (PD) erreichte und die durchschnittlichen 20 PD von WS-Fibroblasten um mehr als das Doppelte {\"u}berschritt, aber unter den 54 PD von Kontrollfibroblasten lag. Eine Tetrasomie wurde f{\"u}r alle autosomalen Chromosomen außer den Chromosomen 4 und 6 festgestellt, die jeweils dreimal, die Geschlechtschromosomen X und Y jeweils zweimal vertreten waren. Die Translokationen waren identisch mit denen von Klon a aus WL, allerdings in jeweils zweifacher Ausf{\"u}hrung. 77 der 10 Chromosomen beinhalteten in den 69 Metaphasen \&\#8805;6 Br{\"u}che und waren in jeweils mindestens 3 der 4 ZLL an Chromosomenaberrationen beteiligt. V.a. Chromosom 16 war mit 17 Bruchpunkten bzw. in 23 von 78 aberranten Chromosomen am h{\"a}ufigsten involviert. Zudem war es an zwei der drei dreifach-rekombinierten Chromosomen und bei einem der zwei trizyklischen Chromosomenaustausche beteiligt. Dies weist auf eine m{\"o}glicherweise große Bedeutung von Chromosom 16 in Rekombinationsprozessen hin. Auff{\"a}llig war eine nicht-zuf{\"a}llige Bruchpunktverteilung. Die Bruchpunkte 3q11\&\#8594;q12, 9q13, 15q15, 16q12\&\#8594;q13 und 16q22 waren m{\"o}gliche hot spots f{\"u}r Bruchereignisse und trugen Rechnung f{\"u}r \&\#8776;21\% der Bruchereignisse. V.a. 16q22 brach am h{\"a}ufigsten (11mal), war als einziger Bruchpunkt in allen 4 Zelllinien vorhanden und maßgeblich f{\"u}r die hohe Beteiligung des Chromosoms 16 an strukturellen Aberrationen verantwortlich. 16q22 wurde in vorherigen Untersuchungen bisher noch nicht als einer der bevorzugten Bruchpunkte in WS festgestellt. Einige der bei Salk et al. genannten hot spots wurden in dieser Arbeit best{\"a}tigt, jedoch mit unterschiedlichem Verteilungsmuster. Dies h{\"a}ngt m{\"o}glicherweise mit der h{\"o}heren Sensitivit{\"a}t von SKY, aber auch mit der in dieser Arbeit relativ niedrigen Anzahl an Metaphasen zusammen. F{\"u}r SKY bestehen weitere mannigfaltige Anwendungsm{\"o}glichkeiten , die in der zytogenetischen Forschung nicht nur auf dem Gebiet des WS Fortschritte erzielen k{\"o}nnen. SKY ist zudem eine sichere Methode, erfordert jedoch einen hohen zeitlichen und materiellen Aufwand, die die Anwendungsm{\"o}glichkeiten wiederum limitieren. Als diagnostisches Instrument erscheint SKY daher nur in F{\"a}llen sinnvoll, in denen nach der Anwendung konventioneller Methoden weiterhin Unsicherheiten bez{\"u}glich der Diagnose bestehen. Mit der Eigenschaft komplexe Rearrangements mit hoher Sensitivit{\"a}t zweifelsfrei nachzuweisen, kann es jedoch als der Gold-Standard bei unklaren F{\"a}llen gelten.}, subject = {Progeria adultorum}, language = {de} } @phdthesis{Wittmann2007, author = {Wittmann, Stefanie}, title = {LOH- und Expressionsanalysen zur Identifikation neuer prognostischer Marker in Wilms Tumoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24891}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, z{\"a}hlt zu den im Kindesalter am h{\"a}ufigsten auftretenden malignen Tumoren und entsteht meist unilateral (90 - 95 \%) und sporadisch (98 - 99 \%). Leider sind bis heute die molekularen Ursachen, die zur Entwicklung dieser Tumoren f{\"u}hren nur unzureichend aufgekl{\"a}rt. So werden bisher nur drei Gene mit dem Auftreten von WT in Verbindung gebracht: WT1, CTNNB1 und WTx. W{\"a}hrend WT1 und CTNNB1 jeweils Mutationsraten von etwa 10 - 15 \% aufweisen, die zudem h{\"a}ufig gemeinsam vorliegen, werden f{\"u}r WTx Mutationsraten von etwa 30 \% beobachtet. Die genetischen Alterationen der anderen Tumoren sind noch immer komplett unbekannt. Ziel dieser Arbeit war aus diesem Grund die Identifikation von relevanten Regionen und Genen, die an der Entstehung bzw. dem klinischen Fortschreiten von Wilms Tumoren beteiligt sind. Zus{\"a}tzlich sollten weitere Untersuchungen zur Einsch{\"a}tzung ihres prognostischen Potenzials dienen. In einem ersten Ansatz wurden die Chromosomenbereiche 11q und 16q in einer großen Anzahl von Wilms Tumoren auf LOH (=loss of heterozygosity), d.h. den (partiellen) Verlust von genetischem Material, untersucht. In beiden F{\"a}llen wurden erh{\"o}hte LOH-Raten von etwa 20 \% beobachtet, jedoch war keine Eingrenzung der relevanten Regionen m{\"o}glich, da Allelverluste nicht stets ab einem bestimmten Marker beobachtet wurden. Ein Vergleich mit der Histologie ergab signifikante Assoziationen der Allelverluste mit anaplastischen und Mischtyp-Tumoren (nur f{\"u}r LOH 11q), wohingegen kaum LOHs in epithelialen und stromareichen Tumoren festgestellt wurden. Somit scheinen auf 11q und 16q Gene vorzuliegen, die einerseits die Differenzierung in Epithel und Stroma beg{\"u}nstigen oder andererseits ein blastemreiches und anaplastisches Erscheinungsbild verhindern. Jedoch k{\"o}nnte auch die Assoziation von bestimmten Subtypen mit LOH 11q und 16q auf eine Entstehung aus unterschiedlichen Zellen hindeuten. Weiterhin war das Auftreten von LOH, v.a. wenn jeweils der komplette Chromosomenarm betroffen war, mit einem erh{\"o}hten Rezidiv- und Sterberisiko (nur LOH 11q) verbunden. Somit konnte gezeigt werden, dass LOH-Untersuchungen auf 11q und 16q zur Identifikation von Hochrisikopatienten f{\"u}r die Entwicklung von Rezidiven bzw. erh{\"o}hter Mortalit{\"a}t eingesetzt werden k{\"o}nnen, wodurch eine individuelle Anpassung der Therapiemaßnahmen erm{\"o}glicht wird. In einem zweiten Ansatz wurden eine Reihe von bereits publizierten potenziellen Markergenen in einer großen Anzahl von Wilms Tumoren mit Hilfe der Realtime RT-PCR auf ihre Relevanz {\"u}berpr{\"u}ft. Allen diesen Genen wurde zuvor eine Funktion bei der histologischen Klassifikation der Tumoren bzw. bei der Vorhersage bestimmter klinischer Verl{\"a}ufe zugeschrieben. Die univariate Analyse diente der Beurteilung der Relevanz einzelner Gene, wohingegen die multivariate Analyse zur Bestimmung von prognostischen Genkombinationen eingesetzt wurde. Anschließend erfolgte die Validierung mittels eines zweiten und unabh{\"a}ngigen Tumorsatzes. Auch wenn viele der bereits publizierten Marker und in der ersten Analyse erhaltenen Assoziationen in einem weiteren und unabh{\"a}ngigen Tumorsatz nicht verifizierbar waren, konnten dennoch einige fr{\"u}here Ergebnisse repliziert und die Relevanz der entsprechenden Gene nachgewiesen werden. Neben der Verbindung der Repression von HEY2 und TRIM22 mit Hochrisikotumoren bzw. einer h{\"o}heren Sterbewahrscheinlichkeit fanden sich schwach signifikante Assoziationen auch f{\"u}r die verminderte Expression von TRIM22 und VEGF mit der Histologie. Ebenso waren erh{\"o}hte Level von TERT und die Repression von TRIM22 mit der Entwicklung eines Rezidivs verbunden. Vor allem aber die Korrelation der Repression von HEY2 und VEGF sowie einer {\"U}berexpression von CA9 mit Rezidiven, Tumoren hoher Malignit{\"a}t oder prim{\"a}ren Metastasen verweisen auf die Notwendigkeit, besonders die Hypoxie- und Angiogenese-Signalkaskaden in Wilms Tumoren zu untersuchen, um deren Einfluss v.a. auf das Fortschreiten und die Ausbreitung der Tumoren zu evaluieren. Auch wenn die multivariate Analyse nicht zu relevanten Genkombinationen f{\"u}hrte, konnte hier dennoch eine schwache Assoziation der verminderten Expression von TOP2A und TRIM22 mit prim{\"a}ren Metastasen oder einer erh{\"o}hten Mortalit{\"a}t, sowie der {\"U}berexpression von TERT mit der Rezidivbildung best{\"a}tigt werden. Interessanterweise stellte sich die Histologie, die derzeit das Hauptkriterium f{\"u}r die Risikoklassifikation darstellt, weder als geeigneter prognostischer Marker f{\"u}r die Beurteilung des Rezidiv- noch des Sterberisikos heraus. Somit sollten Realtime RT-PCR Analysen in Zukunft als weiterer Faktor zur Beurteilung des Rezidiv- und Sterberisikos eingesetzt werden, um eine individuelle Anpassung der Therapie zu erm{\"o}glichen. Basierend auf den Ergebnissen der Realtime RT-PCR Analyse wurde der Einfluss der Expression ausgew{\"a}hlter Gene auf Prim{\"a}rkulturen, die aus nativem Wilms Tumormaterial gewonnen wurden, untersucht. Nach der {\"U}berexpression von HEY2, EGR1, MYCN und TRIM22 wurden bei allen Zellen hohe Sterberaten beobachtet, v.a. bei HEY2 und EGR1. Leider konnte weder f{\"u}r HEY2 noch f{\"u}r EGR1 der Grund hierf{\"u}r aufgekl{\"a}rt werden, allerdings war bei EGR1 weder die Apoptose noch die Seneszenz beteiligt. Im Gegensatz hierzu wurde die Apoptose als entscheidender Mechanismus bei MYCN und v.a. TRIM22 ermittelt. Außerdem scheint bei MYCN ein großer Anteil an Zellen in die Seneszenz einzutreten. Auch wenn diese ersten Untersuchungen an Prim{\"a}rkulturen von Wilms Tumoren eindeutig die Relevanz dieser Gene f{\"u}r die Entwicklung bzw. das Fortschreiten der Tumoren best{\"a}tigten, so sind trotz alledem weitere Experimente v.a. in einer gr{\"o}ßeren Anzahl genetisch unterschiedlicher Prim{\"a}rkulturen n{\"o}tig, um das endg{\"u}ltige Potenzial dieser Gene aufzukl{\"a}ren.}, subject = {Nephroblastom}, language = {de} } @phdthesis{Schmidt2007, author = {Schmidt, Doris}, title = {Blimp-1deltaexon7 : Eine nat{\"u}rlich vorkommende Blimp-1 Deletionsmutante mit autoregulativen Eigenschaften}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24750}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Blimp-1 (B lymphocyte induced maturation protein-1) kontrolliert die Regulation der terminalen B-Zelldifferenzierung. So ist die ektopische Expression von Blimp-1 ausreichend, damit naive B-Zellen zu antik{\"o}rpersezernierenden Zellen differenzieren k{\"o}nnen. Dabei wirkt Blimp-1 als transkriptioneller Repressor, der zusammen mit Kofaktoren die Chromatinstruktur in der Promotorregion der Zielgene modifiziert und so deren Expression steuert. Neben der urspr{\"u}nglich beschriebnen Blimp-1 mRNA existiert eine weitere mRNA, welcher das Exon 7 fehlt (Blimp-1?exon7). In diesem Exon sind die ersten zwei von insgesamt f{\"u}nf Zinkfingern kodiert, welche nachweislich essentiell f{\"u}r die sequenzspezifische DNA-Interaktion von Blimp-1 sind. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Blimp-1?exon7 Deletionsmutante vorwiegend in ruhenden CD19+ B-Zellen der Maus und in unstimulierten humanen B-Zellen exprimiert wird. Obwohl die Blimp-1 sequenzspezifische DNA-Bindung des Proteins (Blimp-1?Ex7) nicht mehr gegeben ist, lokalisiert es teilweise in den Kern, interagiert ebenfalls mit Korepressoren wie Histondeacetylase-2, und assoziiert mit heterochromatischen Bereichen der DNA. Die ektopische Expression von Blimp-1?Ex7 in einer murinen B-Zell-Lymphomlinie, f{\"u}hrt zu Zellzyklusarrest und Apoptose, ohne jedoch die Differenzierung zur Plasmazelle zu erm{\"o}glichen. Dar{\"u}ber hinaus ist in Gegenwart von Blimp-1?Ex7 die LPS-induzierte B-Zelldifferenzierung blockiert. Die Unterdr{\"u}ckung der Differenzierung korreliert mit einer verminderten Blimp-1 Expression. Zusammenfassend legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass Blimp-1?Ex7 in naiven B-Zellen exprimiert wird und eine vorzeitige Differenzierung verhindert, indem es autoregulativ die Promotoraktivit{\"a}t herabsetzt und damit Blimp-1 kontrolliert.}, subject = {B-Zelle}, language = {de} } @phdthesis{Brocher2007, author = {Brocher, Jan}, title = {Einfluss von HMGA1-Proteinen auf die Myogenese und Heterochromatinorganisation w{\"a}hrend der Differenzierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24456}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {HMG-Proteine sind nach den Histonen die zweith{\"a}ufigste Superfamilie nukle{\"a}rer Proteine. Sie binden an DNA und Nukleosomen und induzieren strukturelle Ver{\"a}nderungen im Chromatin. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Dynamik des Chromatins und beeinflussen dadurch DNA-abh{\"a}ngige Prozesse, wie Transkription und Replikation. Proteine der HMGA-Familie sind charakterisiert durch konservierte DNA-Bindungsmotive, den AT-Hooks, welche eine Bindung an AT-reiche DNA-Sequenzen vermitteln und durch einen sauren C-Terminus. HMGA-Proteine sind verst{\"a}rkt im Heterochromatin konzentriert und stehen in Verbindung mit der Expressionsregulation spezifischer Gene aufgrund der Stabilisierung von Nukleoproteinkomplexen, so genannten Enhanceosomen. HMGA-Proteine spielen des Weiteren eine entscheidende Rolle in verschiedenen Entwicklungsprozessen und bei der Tumorprogression . Um den Einfluss von HMGA1 auf die zellul{\"a}re Differenzierung und die Chromatinmodulation zu untersuchen, wurden C2C12 Maus-Myoblastenzellen verwendet. Die Induktion der Myogenese in diesen Zellen geht mit der Herunterregulierung von HMGA1 einher. Durch die Etablierung einer C2C12-Zelllinie, welche ein EGFP-markiertes HMGA1a stabil exprimierte, konnte gezeigt werden, dass eine anhaltende HMGA1-Expression spezifisch die Myogeneseprozess inhibierte, w{\"a}hrend die Osteogenese davon unbeeinflusst zu bleiben schien. Dieser hemmende Effekt kann durch die HMGA1-abh{\"a}ngige Fehlexpression verschiedener Gene, welche f{\"u}r eine einwandfreie Muskeldifferenzierung n{\"o}tig sind und in die Zellzyklusregulation eingreifen, erkl{\"a}rt werden. Unter der Verwendung von RNAi konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulierung von HMGA1-Proteinen f{\"u}r eine korrekte Genexpression und den Muskeldifferenzierungsprozess notwendig ist. W{\"a}hrend der terminalen Differenzierung wird die Umorganisation des Chromatins durch die Fusion der Chromozentren offensichtlich. Fotobleichtechniken, wie „fluorescence recovery after photobleaching" (FRAP) zeigten, dass HMGA1-Proteine mit dem Methyl-CpG-bindenden Protein 2 (MeCP2), welches eine wichtige Rolle in der Chromozentrenfusion spielt, um DNA-Bindungsstellen konkurriert und dieses vom Chromatin verdr{\"a}ngt. Diese dynamische Konkurrenz zwischen einem anhaltend exprimierten HMGA1 und MeCP2 tr{\"a}gt somit zur Inhibition der differenzierungsabh{\"a}ngigen Modulation des Chromatins w{\"a}hrend der sp{\"a}ten Myogenese bei. Die Untersuchungen in C2A1a-Zellen lieferten weitere Hinweise daf{\"u}r, dass der wesentlichste Umbau des Chromatins in einem Zeitfenster um den dritten Tag nach Induktion der Myogenese stattfindet, an welchem HMGA1 nat{\"u}rlicherweise nahezu vollst{\"a}ndig herunterreguliert sind. In diesem Zeitraum kommt es zur Dissoziation der Chromozentren, zu ver{\"a}nderten Expressionsmustern in bestimmten Genen, zu Modulationen in Histonmodifikationen (H3K4me2, H3K4me3, H3K27me3), zur Replikations-unabh{\"a}ngigen Akkumulation von Histon H3 in den Chromozentren {\"u}ber ungef{\"a}hr einen Zellzyklus hinweg und zu eine signifikanten Erh{\"o}hung der HP1-Dynamik. Durch den Einsatz von Bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung (BiFC), die es erlaubt Protein-Protein-Interaktionen in vivo zu visualisieren, konnte gezeigt werden, dass der saure C-Terminus des HMGA mit der Chromodom{\"a}ne (CD) des HP1 interagiert. Zus{\"a}tzlich ist f{\"u}r diese Interaktion die korrekte DNA-Bindung des HMGA n{\"o}tig. FRAP-Messungen mit HP1-EGFP-Fusionsproteinen in Zellen die wildtypisches oder ein mutiertes HMGA koexprimierten, best{\"a}tigten diese Daten und wiesen darauf hin, dass die HP1-Verweildauer im Heterochromatin maßgeblich von der Gegenwart eines funktionellen HMGA1 abh{\"a}ngig ist. Des Weiteren zeigten C2C12-Myoblasten, die HMGA1 nat{\"u}rlicherweise exprimieren, eine hohe HP1-Verweildauer, die nach HMGA1-knock down drastisch verringert ist. Umgekehrt ist die HP1-Verweildauer nach einer Herunterregulierung von HMGA1 an Tag 3 der Myogenese gering und steigt durch die Koexpression von HMGA1 auf das in Myoblasten gemessene Niveau an. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die differenzielle Expression von HMGA1 und ihre F{\"a}higkeit mit HP1 zu interagieren, sowie ihre Konkurrenz mit MeCP2 um DNA-Bindungsstellen einen entscheidende Rolle in der Regulation der Aufrechterhaltung und Plastizit{\"a}t des Heterochromatins w{\"a}hrend der Differenzierung spielen. Daher ist eine zeitlich festgelegte Herunterregulierung von HMGA1 notwendig, um die Modulation des Chromatins und dadurch den Differenzierungsprozess zu erm{\"o}glichen}, subject = {HMG-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Osterloh2007, author = {Osterloh, Lisa}, title = {Identifizierung und Charakterisierung LIN-9 regulierter Gene im humanen System - Die Rolle von LIN-9 in der Regulation des Zellzyklus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24360}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Das humane LIN-9 wurde zuerst als pRB-interagierendes Protein beschrieben und spielt eine Rolle als Tumorsuppressor im Kontext des pRB-Signalweges. {\"U}ber die molekulare Funktion von LIN-9 ist jedoch wenig bekannt. Die Homologe von LIN-9 in D. melanogaster und in C. elegans, sind an der transkriptionellen Regulation verschiedener Genen beteiligt. Dies und die Tatsache, dass LIN-9 mit pRB in der Aktivierung differenzierungspezifischer Gene kooperiert, ließ vermuten, dass humanes LIN-9 einen bedeutenden Einfluss auf die transkriptionelle Regulation von Genen haben k{\"o}nnte. Prim{\"a}res Ziel dieser Arbeit war daher die Identifizierung LIN-9 regulierter Gene. Dazu sollte mit Hilfe von cDNA-Microarray Analysen, das Genexpressionsprofil LIN-9 depletierter prim{\"a}rer humaner Fibroblasten (BJ ET Zellen) im Vergleich zu Kontrollzellen untersucht werden. Hierf{\"u}r wurde zun{\"a}chst ein RNAi-basierendes System etabliert, um die posttranskriptionelle Expression von LIN-9 in BJ-ET Zellen effizient zu reprimieren. Auf dem Ergebnis der cDNA-Microarray Analysen aufbauende Untersuchungen sollten Aufschluss {\"u}ber die molekularbiologische Funktion von LIN-9 geben. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der Verlust von LIN-9 zu einer verminderten Expression einer Gruppe G2/M-spezifischer Gene f{\"u}hrt, deren Produkte f{\"u}r den Eintritt in die Mitose ben{\"o}tigt werden. Bekannt war, dass ein Teil dieser Gene durch den Transkriptionsfaktor B-MYB koreguliert wird. Zudem konnten Untersuchungen in unserem Labor eine Interaktion von LIN-9 und B-MYB auf Proteinebene, sowie die Bindung beider Proteine an die Promotoren der LIN-9 regulierten G2/M-Gene nachweisen. Dies l{\"a}sst vermuten, dass LIN-9 und B-MYB gemeinsam die Expression der G2/M-Gene kontrollieren. Die verminderte Expression von G2/M-Genen in LIN-9 bzw. B-MYB depletierten Zellen geht mit einer Reihe ph{\"a}notypischer Ver{\"a}nderungen einher, wie einer deutlich verlangsamten Proliferation und einer Akkumulation der Zellen in der G2/M-Phase. Mit Hilfe eines Durchflusszytometers erstellte Zellzykluskinetiken ergaben, dass die Progression LIN-9 bzw. B-MYB depletierter Fibroblasten von der S-Phase durch die G2/M-Phase und in die n{\"a}chste G1-Phase deutlich verz{\"o}gert ist. Es konnte weder ein Arrest dieser Zellen in der Mitose noch eine ver{\"a}nderte L{\"a}nge der S-Phase nach LIN-9 oder B-MYB Depletion festgestellt werden. Daher ist die verlangsamte Zellzyklusprogression nach LIN-9 bzw. B-MYB Verlust h{\"o}chstwahrscheinlich auf einen Defekt in der sp{\"a}ten G2-Phase zur{\"u}ckzuf{\"u}hren, welcher in einem verz{\"o}gerten Eintritt in die Mitose resultiert. In D. melanogaster und in C. elegans sind die Homologe von LIN-9 und B-MYB zusammen, als Bestandteile hoch konservierter RB/E2F-Komplexe, an der Regulation von Genen entscheidend beteiligt. Daher liegt es nahe, dass im humanen System LIN-9 und B MYB ebenfalls Bestandteile eines {\"a}hnlichen Komplexes sind und dadurch die Aktivierung der LIN 9 abh{\"a}ngigen G2/M-Gene vermitteln. Die Tatsache, dass LIN-9 sowohl als Tumorsuppressor, als auch als positiver Regulator des Zellzyklus fungiert, l{\"a}sst vermuten, dass LIN-9 zu einer stetig gr{\"o}ßer werdenden Gruppe von Proteinen geh{\"o}rt, welche in Abh{\"a}ngigkeit vom zellul{\"a}ren und genetischen Kontext sowohl tumorsuppressive als auch onkogene Funktionen besitzen.}, subject = {Zellzyklus}, language = {de} } @phdthesis{Wicovsky2007, author = {Wicovsky, Andreas}, title = {Die Rolle von TRAF1 und JNK bei der TNF-vermittelten Apoptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23689}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {TNF (Tumor Nekrose Faktor) vermittelt seine biologischen Funktionen durch Interaktionen mit TNFR1 (TNFRezeptor 1) und TNFR2 (TNFRezeptor 2). In fr{\"u}heren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der TNFR2 sowohl durch die Induktion von membrangebundenem TNF als auch durch die proteasomale Degradation von TRAF2 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 2) die TNFR1-vermittelte Apoptose verst{\"a}rken kann. Des Weiteren war bekannt, dass TRAF1 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 1), ein anderes Mitglied der TRAF-Familie, mit TRAF2 Heterotrimere bilden kann und zudem nach TNF-induzierter NFkappaB- (nuclear factor kappaB) Aktivierung verst{\"a}rkt exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werden, dass TRAF1 in beide TNFR-Signalkomplexe rekrutiert wird und darin in einem TRAF2/TRAF1-Heterotrimer TRAF2 funktionell ersetzen kann. Dar{\"u}ber hinaus verhindert TRAF1 die Rekrutierung von TRAF2 in lipid rafts sowie dessen anschließende proteasomale Degradation. Auf diese Weise kann TRAF1 die TNFR2-abh{\"a}ngige Verst{\"a}rkung der TNFR1-induzierten Apoptose verhindern. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die TNF-vermittelte Aktivierung der JNK (c-Jun N-terminale Kinase), dessen Regulation durch ROS (reactive oxygen species), Caspasen (Cysteinyl-Aspartat-spezifische Proteasen) sowie NFkappaB-induzierte Faktoren untersucht. TNF induziert in den meisten Zellen zun{\"a}chst nach zehn bis 30 Minuten eine transiente JNK-Aktivierung, woraufhin bei NFkB-inhibierten Zellen eine zweite andauernde JNK-Aktivierung folgt. Die meisten in der Literatur beschriebenen Studien gehen dabei von einem ROS-abh{\"a}ngigen, Caspase-unabh{\"a}ngigen Mechanismus der persistierenden JNK-Aktivierung aus. Des Weiteren wurde in den vor allem bei embryonale Mausfibroblasten durchgef{\"u}hrten Untersuchungen davon ausgegangen, dass bestimmte NFkappaB-induzierte Radikalf{\"a}nger die andauernde Aktivierung der JNK verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den humanen Zelllinien KB, Jurkat und HaCaT die andauernde Aktivierung der JNK, im Gegensatz zur transienten JNK-Aktivierung, Caspase-abh{\"a}ngig verl{\"a}uft. Es ergab sich {\"u}berdies, dass die inhibierende Wirkung des NFkB-Signalweges auf die persistierende JNK-Aktivierung in diesen Zelllinien in erster Linie auf die indirekte Verhinderung der Apoptose durch die Induktion von antiapoptotischen Proteinen wie Flip-L (FLICE-inhibitory protein long) und IAPs (inhibitor of apoptosis) zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist, als auf die direkte Expression von Radikalf{\"a}ngern. Zudem wurde in den untersuchten Zelllinien die Caspase-vermittelte Spaltung von MEKK-1 (MAP/ERK kinase kinase-1) und p21WAF/Cip 1 nachgewiesen, von denen bekannt ist, dass die Spaltprodukte eine JNK-stimulierende Wirkung haben. Dennoch m{\"u}ssen k{\"u}nftige Studien zeigen, ob die Spaltung von p21WAF/Cip 1 und MEKK-1 in Fragmente mit JNK-stimulierender Aktivit{\"a}t oder andere Caspasesubstrate f{\"u}r die Caspase-vermittelte andauernde Aktivierung der JNK verantwortlich sind.}, language = {de} } @phdthesis{Link2007, author = {Link, Stefanie}, title = {Molekulare Charakterisierung des Filament{\"o}sen H{\"a}magglutinins von Bordetella holmesii}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23049}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Zur Gattung Bordetella z{\"a}hlen derzeit neun verschiedene Arten Gram-negativer Bakterien. Der strikt humanpathogene Keim B. pertussis ist der Erreger des Keuchhustens und stellt das wohl wichtigste Mitglied der Gattung dar. B. holmesii geh{\"o}rt zu den sogenannten neuen Bordetella-Arten und wurde 1995 erstmals von Weyant et al. beschrieben. In den letzten Jahren gewann B. holmesii als humanpathogener Keim, der Keuchhusten-{\"a}hnliche Erkrankungen verursacht, zunehmend an Bedeutung. Mit Ausnahme des BvgAS-Systems (Gerlach et al., 2004) konnten in B. holmesii bislang keine f{\"u}r die „klassischen" Bordetella-Arten bekannten Virulenzfakoren nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein zum Filament{\"o}sen H{\"a}magglutinin homologer Faktor in B. holmesii identifiziert. Der fhaB-Locus aus B. holmesii unterscheidet sich deutlich von dem der anderen Bordetella-Arten, da die fhaB-Sequenz in B. holmesii (fhaBBH) stromaufw{\"a}rts von einem putativen Membranprotein und stromabw{\"a}rts von einem IS1001-{\"a}hnlichen IS-Element flankiert wird. Sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene weist das fhaBBH-Gen die gr{\"o}ßte {\"A}hnlichkeit zu dem fhaB-Homolog aus B. avium auf, was die Vermutung best{\"a}rkt, dass B. holmesii phylogenetisch im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Durch in silico-Analysen der FhaBBH-Aminos{\"a}uresequenz konnte eine N-terminale Signalpeptiddom{\"a}ne sowie eine TPS-Dom{\"a}ne identifiziert werden. Dies l{\"a}sst vermuten, dass FHABH an die bakterielle Oberfl{\"a}che transportiert und m{\"o}glicherweise sekretiert wird. Anhand von in silico-Analysen wurde zudem ein KGD-Motiv, nicht jedoch eine Heparinsulfat- und eine Kohlenhydratbindedom{\"a}ne im FhaBBH identifiziert. Das KGD-Motiv k{\"o}nnte das RGD-Motiv im FHA der „klassischen" Bordetella-Arten bei der Erkennung von Rezeptoren ersetzen. In Zellkultur-Experimenten konnte die Ad{\"a}sionsf{\"a}higkeit von B. holmesii G7702 an A549-Zellen nachgewiesen werden. Eine fhaB-Deletionsmutante des entsprechenden Stammes zeigte dagegen eine signifikant niedrigere Adh{\"a}sionsrate an die menschlichen Lungenepithelzellen. Somit konnte gezeigt werden, dass FHA in B. holmesii eine Rolle als Adh{\"a}sionsfaktor spielt. Die im Vergleich zum Wildtyp stark verringerte Adh{\"a}sionsrate der bvgA-Mutante von B. holmesii G7702 l{\"a}sst zudem auf die Beteiligung weiterer Adh{\"a}sionsfaktoren an der Wirtszelladh{\"a}sion in B. holmesii und deren Regulation durch das BvgAS-Systems schließen. Die Regulationsstudien haben gezeigt, dass die fhaB-Transkription in B. holmesii {\"u}ber zwei konstitutiv aktive Promotoren und einen bvg-abh{\"a}ngigen Promotor erfolgt. In vitro ist phosphoryliertes BvgABH in der Lage, spezifisch an die fhaB-upstream-Region aus B. holmesii zu binden. Innerhalb der fhaBBH-upstream-Region wurden drei putative BvgA-Bindestellen BS2-4 identifiziert, die {\"A}hnlichkeiten zu inverted repeat-Anordnungen der BvgA-Konsensussequenz 5'- T/A T T C C/T T A -3' aufweisen. Basierend auf den Ergebnissen der in vitro-Binde- und in vivo-Expressionsstudien zur Charakterisierung der einzelnen putativen BvgABH-Bindestellen wird ein Modell f{\"u}r die BvgABH-Bindung innerhalb des fhaB-Promotors in B. holmesii vorgeschlagen. Demnach wird zun{\"a}chst die prim{\"a}re BvgABH-Bindestelle BS2 mit der h{\"o}chsten Affinit{\"a}t von BvgABH-P gebunden, wobei f{\"u}r BvgABH-P eine Dimerisierung angenommen wird. Anschließend bindet ein zweites BvgABH-P-Dimer an die als sekund{\"a}re Bindestelle bezeichnete BS3-Region, die sich stromabw{\"a}rts von BS2 befindet. Eine m{\"o}glicherweise darauf folgende unspezifische Anlagerung von zwei weiteren BvgABH-P-Dimeren an den 37 bp großen DNA-Abschnitt zwischen BS2 und BS3 ist, ebenso wie die Besetzung der niedrigaffinen Bindestelle BS4 durch ein weiteres BvgABH-P-Dimer, haupts{\"a}chlich auf kooperative Protein-Protein-Wechselwirkungen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Das an BS4 gebundene BvgABH-P-Dimer befindet sich am weitesten stromabw{\"a}rts und k{\"o}nnte zusammen mit der RNA-Polymerase die Initiation der Transkription gew{\"a}hrleisten. Ergebnisse aus den in vitro-Bindestudien sowie die unterschiedliche Zusammensetzung und Anordnung der putativen BvgA-Bindestellen der fhaB-Promotoren aus B. holmesii und B. pertussis deuten auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Promotoren hin. So scheint der fhaB-Promotor aus B. holmesii, im Vergleich zum fhaB-Promotor aus B. pertussis, erst bei h{\"o}heren Konzentrationen an phosphoryliertem BvgA gebunden und somit aktiviert zu werden. In B. holmesii wird vermutlich die konstitutive FHA-Synthese nach BvgAS-Stimulation durch die bvg-abh{\"a}ngige fhaBBH-Expression unterst{\"u}tzt, um eine erfolgreiche Infektion des Wirtes zu gew{\"a}hrleisten.}, subject = {Bordetella}, language = {de} } @phdthesis{Stahl2006, author = {Stahl, Sonja}, title = {Molekulare Mechanismen der Neurodegeneration in der Grosshirnrinde von Kathepsin B und L-Doppelknockoutm{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21606}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Kathepsin B und L sind lysosomale Cysteinproteasen, die mit einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie z. B. Cancerogenese, Tumorangiogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht werden. Dennoch sind bis jetzt nur wenige Proteinsubstrate beschrieben. Ausserdem sind die Mechanismen der Regulation von Zellproliferation, -invasion und -apoptose durch Kathepsin B und L weitgehend unverstanden. Ein kombinierter Mangel beider Kathepsine f{\"u}hrt zu einer fr{\"u}hzeitigen Neurodegeneration in M{\"a}usen, die an neuronale Lipofuszinosen beim Menschen erinnert. In der vorliegenden Studie wurden Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von wildtypischen und doppelt-defizienten Gehirnlysosomen quantifiziert. Eine Kombination von subzellul{\"a}rer Fraktionierung und LC-MS/MS unter Verwendung einer isobarischen Markierung (iTraqTM) erlaubte uns die gleichzeitige Untersuchung von zerebralen Lysosomen aus Wildtyp und Kathepsin B-/-L-/- M{\"a}usen. Ingesamt waren 19 Proteine signifikant erh{\"o}ht in Kathepsin B-/-L-/- Lysosomen. Die meisten erh{\"o}hten Proteine wurden der neuronalen Biosynthese, regenerierenden bzw. endozytotischen oder lysosomalen Kompartimenten zugeordnet. Der Anstieg von Calcyon, dem Delta/Notch- verwandten epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (DNER), Neurochondrin, Phospholipase D3, Rab14, Cathepsin D und Apolipoprotein E l{\"a}sst eine potentielle Rolle von Kathepsin B und L im Axonwachstum und der Synapsenbildung w{\"a}hrend der postnatalen Entwicklung des Zentralnervensystems vermuten.}, subject = {Kathepsin B}, language = {de} } @phdthesis{Seitz2007, author = {Seitz, Sabine}, title = {Identifikation und Charakterisierung von autoreaktiven humanen T-Zell-Rezeptor Molek{\"u}len}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22511}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Multiple Sklerose und die entz{\"u}ndlichen Muskelerkrankungen Polymyositis und Einschlussk{\"o}rperchenmyositis sind Autoimmunerkrankungen, in denen T-Lymphozyten in das Gehirn bzw. den Muskel eindringen und dort k{\"o}rpereigenes Gewebe zerst{\"o}ren. Die Pathogenese dieser Krankheiten ist bis jetzt noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die ins Zielgewebe eingedrungenen autoaggressiven T-Lymphozyten aus gefrorenem Biopsiegewebe zu isolieren, ihren ab-T-Zell-Rezeptor zu analysieren und diesen rekombinant zu exprimieren. Folgeversuche mit den TZR-Transfektanten sollten erste Hinweise auf ein m{\"o}gliches Antigen liefern. Um autoaggressive T-Zellen von irrelevanten zu unterscheiden, konzentrierten wir uns auf Zellen, die zum einen im Zielgewebe klonal expandiert vorlagen, zum anderen einen direkten morphologischen Kontakt mit der Zielzelle aufwiesen. Wir untersuchten das T-Zell-Repertoire verschiedener Patienten auf klonal expandierte Populationen durch CDR3-Spektratyping und isolierten positiv gef{\"a}rbte Kandidatenzellen durch Lasermikrodissektion aus dem Gewebe. Anschließend wurden die T-Zell-Rezeptoren mit einer speziellen, im Rahmen der Arbeit entwickelten Einzelzell-Muliplex-RT-PCR analysiert. Bisher war es nicht m{\"o}glich, die a- und b-Kette desselben T-Zell-Rezeptors aus Biopsiematerial zu identifizieren. Dies lag an der geringen Anzahl verf{\"u}gbarer anti-a-Ketten-Antik{\"o}rper sowie an der wesentlich h{\"o}heren Variabilit{\"a}t der a-Ketten-Gene. Aus dem Biopsiegewebe eines Patienten isolierten wir 23 ab-TZR-P{\"a}rchen, welche alle die identische expandierte TZR-b-Kette zeigten. 20 der 23 Zellen wiesen eine identische a-Kette auf. Die Dominanz des TZR ist ein Hinweis auf die pathogene Relevanz dieses T-Zell-Klons. Die anderen drei Zellen zeigten drei unterschiedliche funktionelle a-Ketten. Aus der Biopsie eines zweiten Patienten isolierten wir zwei weitere ab-TZR-P{\"a}rchen. Die vier Rezeptoren des ersten Patienten wurden in einer T-Zell Hybridom Zellinie exprimiert. Vorl{\"a}ufige Versuche, ein m{\"o}gliches Antigen zu detektieren, zeigten, dass es sich wahrscheinlich weder um ein muskelspezifisches Antigen noch um ein ubiquit{\"a}r exprimiertes Selbst-Antigen handelt. Die hier beschriebene Methode der Isolierung und Analyse von autoaggressiven T-Lymphozyten kann man nicht nur zur Untersuchung des TZR-ab-Repertoires von Myositis- oder MS-Patienten einsetzen. Sie ist ebenfalls geeignet, andere Autoimmunerkrankungen sowie Tumor- oder Infektionserkrankungen zu untersuchen.}, subject = {Autoaggressionskrankheit}, language = {de} } @phdthesis{Kusnezow2006, author = {Kusnezow, Wlad}, title = {Entwicklung von Antik{\"o}rper-Mikroarray : von Biophysik der Mikrospot-Reaktion bis zur Hochdurchsatzanalyse der Proteine}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22534}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Obwohl Protein-Mikroarrays urspr{\"u}nglich aus dem gut entwickelten und fest etablierten DNA-Pendant entstanden sind, repr{\"a}sentierte jedoch die Umstellung der Mikroarray-Technik von der DNA- auf die Proteinanalyse aufgrund der enormen physikalisch-chemischen Variabilit{\"a}t der Proteine, deren relativ niedrigen Stabilit{\"a}t und der komplexen Mikrospot-Kinetik eine große technologische Herausforderung. Deshalb setzt das Vorhaben, die Technik der Antik{\"o}rper-Mikroarrays von ihrem konzeptuellen Zustand ausgehend zu einem robusten, real funktionierenden Werkzeug zu etablieren, nicht nur eine Vielzahl an technologischen L{\"o}sungen, sondern auch eine systematische und physikalisch begr{\"u}ndete Herangehensweise in dieser technologischen Entwicklung voraus. Das waren im Wesentlichen die zwei wichtigsten, der eigentlichen Entwicklung der Antik{\"o}rper-Mikroarrays untergeordneten Ziele der Arbeit. Mit dem Ziel, Antik{\"o}rper-Mikroarrays prinzipiell zu etablieren und eine optimale Immobilisierungschemie f{\"u}r deren Herstellung zu finden, wurden im ersten Teil dieser Arbeit mehrere chemische Beschichtungen von Glasslides optimiert, unterschiedliche Spotting-Bedingungen von Antik{\"o}rpern f{\"u}r verschiedene Oberfl{\"a}chen getestet und verschiedene Blockierungsverfahren und Strategien zur Aufbewahrung von Slides analysiert. Anschließend wurde eine Reihe von kommerziellen und selbst hergestellten chemisch beschichteten Slides unter den optimierten Bedingungen miteinander verglichen. Als Hauptergebnis dieser Untersuchung wurde die Herstellung der Antik{\"o}rper-Microarrays etabliert. Unter anderem konnte im Zuge dieser systematischen Analyse gezeigt werden, dass Epoxysilan-modifizierte Oberfl{\"a}chen am besten geeignet sind. Diese Oberfl{\"a}che ist heutzutage auf dem Gebiet der Protein-Microarrays am weitesten verbreitet und wurde f{\"u}r alle weiteren Studien innerhalb dieser Dissertation verwendet. Die Entwicklung der Antik{\"o}rper-Mikroarrays in den letzten Jahren demonstrierte erhebliche Schwierigkeiten im Erreichen der n{\"o}tigen Sensitivit{\"a}t und Reproduzierbarkeit. Um dieser Problematik auf den Grund zu gehen, und die Mikrospot-Kinetik experimentell untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte und f{\"u}r den Fall der Mikrorrays angepasste Variante des Two-Compartment Modells (TCM) entwickelt. TCM erm{\"o}glicht auf eine ph{\"a}nomenologische Weise, d.h., dass Diffusionskoeffizienten, Mischintensit{\"a}t oder Dichte der Bindungsstellen nicht bekannt sein m{\"u}ssen, eine quantitative experimentelle Analyse der Mikrospot-Kinetik unter Ber{\"u}cksichtigung von Effekten des Massentransports. Um die ph{\"a}nomenologischen TCM-Werte interpretieren zu k{\"o}nnen und um den Mechanismus der Mikrospot-Reaktion zu untersuchen, wurden auch andere, f{\"u}r die Mikrospot-Kinetik relevante, klassische Theorien an die Bedingungen der Mikrospot-Reaktion angepasst und mit dem modifizierten TCM mathematisch verbunden. Als das erste in der Mikroarray-Technologie mathematisch-physikalische Werkzeug dieser Art hat die hier entwickelte Theorie ein großes Potential, auch in den anderen verwandten Techniken wie DNA- oder Peptid-Mikroarrays Verwendung zu finden. Außerdem wurde innerhalb dieser Arbeit ein anderes einheitliches theoretisches Modell entwickelt, das eine kinetische Simulation von verschiedenen Reaktionsphasen sowohl f{\"u}r konventionelle als auch f{\"u}r Mikrospot-Immunoassays erm{\"o}glicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte f{\"u}r einen typischen Standard-Antik{\"o}rper-Mikroarray theoretisch und experimentell eine lang andauernde, stark massentransportabh{\"a}ngige Mikrospot-Kinetik beschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Erreichen eines thermodynamischen Gleichgewichts in Mikroarrays wegen eines relativ langsamen Ligandentransports zum Spot eine lange Zeit dauert, je nach Bindungskonstante, Diffusionsgeschwindigkeit und Ligandenkonzentration mehrere Stunden bis hin zu Wochen. In dieser Arbeit wurde ein neues physikalisches Konzept, das dem heutzutage dominierenden Blickwinkel, der sogenannten ambient analyte Theorie, opponierend gegen{\"u}bersteht, formuliert. Auch konnten viele Konsequenzen f{\"u}rs Design und die zuk{\"u}nftige Entwicklung dieser relativ neuen Technologie gezogen werden. Als eine logische Folge der massentransportlimitierten Reaktionen ist das Design eines Antik{\"o}rper-Mikroarray ein kritischer Punkt f{\"u}r die Leistung des Verfahrens. Im Laufe der experimentellen und/oder theoretischen Betrachtungen konnte gezeigt werden, dass eine Reihe allgemeiner Parameter wie Gr{\"o}ße eines Spots, Spotting-Muster, Inkubationsgeometrie, Volumen und Konzentration einer Probe, Viskosit{\"a}t des Inkubationspuffers und Mischintensit{\"a}t die Reaktionsraten auf den Spots insgesamt um mehrere Gr{\"o}ßenordnungen beeinflusst. Ist die maximale Rate des Massentransports in einem Mikroarray-Verfahren gew{\"a}hrleistet, kann dann auch die maximale Bindungsleistung der Spots, die durch die Dichte der Bindungsstellen, Bindungsaffinit{\"a}t, Inkubationszeit und andere relevante Parameter eingestellt wird, erreicht werden. Aber nicht nur in der Inkubationsphase, sondern auch bei den Wasch- und Detektionsschritten sollte die gleiche Liste der Parameter ber{\"u}cksichtigt werden. Durch die Optimierung all dieser Parametern konnte eine deutliche Verbesserung der Sensitivit{\"a}t von Antik{\"o}rper-Mikroarrays in der Protein-Expressionsanalyse von klinischen Blutproben erzielt werden In einer weiteren Studie zur Analyse von unterschiedlichen Detektionsverfahren konnte die Sensitivit{\"a}t und Reproduzierbarkeit der etablierten Antik{\"o}rper-Mikroarrays weiter verbessert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Markierungssubstanzen mit NHS (N-hydroxysuccinimide) und ULS (universal linkage system) reaktiven Gruppen wurden innerhalb drei Detektionsverfahren untersucht: 1) eine direkte Probenmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, 2) Markierung der Probe mit Biotin-Substanzen und nachfolgender Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Extravidin und 3) Markierung der Probe mit Fluorescein-Substanzen mit Anti-Fluorescein-Detektion. Aus den Erfahrungen der vorherigen kinetischen Untersuchungen wurde hier vorerst das kinetische Verhalten des Testsystems analysiert und optimale Inkubationsbedingungen festgelegt. Anschließend wurden optimale Konzentrationen all dieser Substanzen f{\"u}r die Markierung von Blutplasma bestimmt. Im Vergleich zur direkten Fluoreszenzmarkierung resultierten sich die indirekten Detektionsverfahren mit Biotin- und Fluorescein-Substanzen in wesentlich besseren Signal-zu-Hintergrund-Verh{\"a}ltnissen. In einer anschließenden Vergleichsanalyse zeigten sich einige Substanzen wie Biotin-ULS oder Fluoresceine-NHS als am besten geeignet f{\"u}r eine Protein-Expressionsanalyse von Blutplasma. Sensitivit{\"a}ten im femtomolaren Bereich konnten mittels der etablierten Antik{\"o}rper-Mikroarrays sowohl f{\"u}r eine markierte Antigenmischung als auch f{\"u}r komplexe klinische Proben innerhalb dieser Dissertation erzielt werden. Viele niedrig konzentrierte Proteine wie beispielsweise Zytokine, die normalerweise in einer piko-oder femtomolaren Konzentration im Blut vorliegen, wurden in dieser Arbeit mit sehr hohen Signal-zu-Hintergrund-Verh{\"a}ltnissen detektiert. Das hier beschriebene Verfahren {\"o}ffnet zus{\"a}tzliche M{\"o}glichkeiten f{\"u}r schnelle, kosteng{\"u}nstige und unbeschr{\"a}nkt erweiterungsf{\"a}hige Mikrospot-Immunoassays.}, subject = {Microarray}, language = {de} } @phdthesis{Grossmann2006, author = {Großmann, Claudia}, title = {Interaktion zwischen der Signaltransduktion von Aldosteron, Mineralocorticoidrezeptor und epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22260}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskul{\"a}ren und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor f{\"u}r G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise f{\"u}r eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So k{\"o}nnen Mineralocorticoide nach zerebraler Isch{\"a}mie zu einem vermehrten vaskul{\"a}ren Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration f{\"u}hren und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verst{\"a}rken. Daher w{\"a}re eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung f{\"u}r die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu {\"u}berpr{\"u}fen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erh{\"o}ht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Prim{\"a}rkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen best{\"a}tigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. {\"U}ber den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung ausl{\"o}sen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders f{\"u}r therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivit{\"a}t des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivit{\"a}t im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Dom{\"a}ne f{\"u}r die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Dom{\"a}nen C, D, E und F gen{\"u}gt nicht, um den EGFR-Promoter vollst{\"a}ndig zu aktivieren. Um Hinweise f{\"u}r die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellul{\"a}rmatrix in glatten Gef{\"a}ßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt f{\"u}r die vermehrte Bildung von extrazellul{\"a}rer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterst{\"u}tzt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskul{\"a}ren und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskul{\"a}ren und renalen System kommt es {\"u}ber eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, n{\"a}mlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion {\"u}ber den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und k{\"o}nnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zus{\"a}tzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron f{\"u}hren diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und f{\"u}hrt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte k{\"o}nnen folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron f{\"u}hrt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabh{\"a}ngig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabh{\"a}ngig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen f{\"u}r eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorg{\"a}ngen.}, subject = {Aldosteron}, language = {de} } @phdthesis{Horvat2007, author = {Horvat, Aleksandra}, title = {Untersuchungen zur Signalwahrnehmung der Sensorkinase BvgS des BvgAS-Zwei-Komponentensystems aus Bordetella bronchiseptica und Struktur-Funktionsanalyse des Response Regulator-Proteins BvgA aus Bordetella holmesii}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21991}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Histidin-Kinase BvgS des BvgAS-Zwei-Komponentensystems geh{\"o}rt zu den unorthodoxen Histidin-Kinasen, die im Gegensatz zu den klassischen Sensorkinasen durch eine komplexere Dom{\"a}nen-Struktur gekennzeichnet ist. Schon seit l{\"a}ngerem ist bekannt, dass BvgS durch niedrige Temperaturen oder die Anwesenheit von chemischen Substanzen, wie Sulfationen oder Nikotins{\"a}ure inaktiviert wird. Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass die Autophosphorylierungs-Aktivit{\"a}t der BvgS Histidin-Kinase nach Inkubation mit oxidiertem Ubichinon inhibiert wird (Bock \& Gross, 2002). Bislang ist weitgehend unklar, welche Bedeutung die zus{\"a}tzlichen Dom{\"a}nen, wie die periplasmatische-, PAS- bzw. HPt-Dom{\"a}ne f{\"u}r die Signalwahrnehmung besitzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb nach Erstellung einer B. bronchiseptica spezifischen Genbank mit Hilfe des GAL4-Yeast Two-Hybrid (YTH) Systems nach Interaktionspartnern der einzelnen BvgS-Dom{\"a}nen gesucht. Nach dem Ausschluss von falsch-positiven Klonen und dem Durchlauf entsprechender Kontrollen konnten im YTH-System f{\"u}r die periplasmatische und die PAS-Dom{\"a}ne von BvgS insgesamt vier Interaktionspartner identifiziert werden. F{\"u}r die HPt-Dom{\"a}ne konnte mit Hilfe des YTH-Systems kein m{\"o}glicher Interaktionspartner gefunden werden. Als ein putativer Interaktionspartner der BvgS-PAS-Dom{\"a}ne wurde das BB0602-Protein identifiziert, das ein ATP-Bindeprotein darstellt, welches als Bestandteil eines ABC-Transport-System f{\"u}r den Transport von verzweigten Aminos{\"a}uren verantwortlich gemacht wird. Diese Interaktion konnte mittels eines GST-Pulldownassays best{\"a}tigt werden. Der biochemische Nachweis der {\"u}brigen identifizierten Protein-Interaktionen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erbracht werden. Die Ergebnisse des YTH-Screenings deuten darauf hin, dass die Aktivit{\"a}t der BvgS Histidin-Kinase und damit die Virulenzgenexpression durch die An- bzw. Abwesenheit von verzweigten Aminos{\"a}uren beeinflusst werden k{\"o}nnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Relevanz der Interaktion zwischen der PAS-Dom{\"a}ne und dem ATP-Bindeprotein BB0602 nicht n{\"a}her charakterisiert werden, so dass in Zukunft unter anderem die Konstruktion einer B. bronschiseptica bb0602-Deletionsmutante geplant ist, um somit m{\"o}gliche Auswirkungen auf die Expression von bvg-abh{\"a}ngigen Genen zu beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit lag in der Struktur-Funktionsanalyse des Response Regulators BvgA aus B. holmesii (BvgABH). K{\"u}rzlich konnte gezeigt werden, dass trotz der umfangreichen Sequenzkonservierung der BvgA-Proteine aus B. holmesii und B. pertussis, eine B. pertussis bvgA-Mutante nicht durch den bvgA-Lokus aus B. holmesii komplementiert werden konnte (Gerlach et al., 2004). Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein hybrider Response Regulator BvgAfus konstruiert, der aus der Receiver- und Linker-Dom{\"a}ne des BvgABH-Proteins und der Output-Dom{\"a}ne von BvgABP zusammengesetzt ist. Voraussetzung hierf{\"u}r war die Kenntnis der einzelnen Dom{\"a}nengrenzen und die Sequenz des Linker-Bereiches des Response Regulators BvgA aus B. pertussis (BvgABP), welche durch limitierte Proteolyse und massenspektrometrische Methoden identifiziert wurden (Bantscheff et al., 2000). Im Falle des hybriden Proteins konnte im Gegensatz zu BvgABH eine Bindung an BvgABP-abh{\"a}ngige Promotorsequenzen beobachtet werden. Zudem war BvgAfus in der Lage, die Expression BvgABP-abh{\"a}ngiger Gene in vivo zu induzieren. Allerdings war es in seiner Phosphorylierungseffizienz im Vergleich zum wildtypischen Response Regulator-Protein aus B. holmesii eingeschr{\"a}nkt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wenigen Abweichungen zwischen den Aminos{\"a}uresequenzen der Output-Dom{\"a}nen daf{\"u}r verantwortlich sind, dass das BvgABH-Protein die Funktion von BvgABP in vivo und in vitro nicht {\"u}bernehmen kann. So unterscheiden sich die Output-Dom{\"a}nen der Response Regulatoren aus B. pertussis und B. holmesii in zehn Aminos{\"a}ureaustauschen, wobei davon vier Aminos{\"a}uren innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives ver{\"a}ndert sind. Um zu untersuchen, ob die unterschiedlichen DNA-Binde- und transkriptionsaktivierenden Eigenschaften von BvgABH im Besonderen auf diese Aminos{\"a}ureunterschiede zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind, wurden mittels ortspezifischer Mutagenese die Aminos{\"a}uresequenz innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives an die Sequenz aus B. pertussis angeglichen. Das resultierende Protein BvgABH* zeigte eine dem wildtypischen BvgABH-Protein {\"a}hnliche Phosphorylierungseffizienz, war aber nicht in der Lage, BvgABP-abh{\"a}ngige Zielsequenzen spezifisch zu erkennen bzw. die Funktion des BvgABP-Proteins in vivo zu ersetzen. Dieses Ergebnis l{\"a}sst vermuten, dass die wenigen Aminos{\"a}ureunterschiede der Output-Dom{\"a}ne außerhalb der DNA-Binderegion zwar nicht im Zusammenhang mit der Phosphorylierungseffizienz stehen, jedoch die DNA-Bindeeigenschaften beeinflussen.}, subject = {Bordetella}, language = {de} } @phdthesis{Goetzke2006, author = {G{\"o}tzke, Armin}, title = {Entwicklung einer Naturschutzkonzeption in Weinbaugebieten auf der Grundlage einer vergleichenden Untersuchung faunistischer und betriebswirtschaftlicher Parameter praxis{\"u}blich und {\"o}kologisch erzeugender Weinbaubetriebe}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21989}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {1) Wenn der Erhalt der biologischen Vielfalt gesellschaftliche Zielvorgabe ist und daf{\"u}r landwirtschaftlich genutzte Fl{\"a}chen einbezogen werden sollen, sind Maßnahmen zu pr{\"a}ferieren, deren Opportunit{\"a}tskosten gering sind. Diese Arbeit stellt den Versuch dar, solche Maßnahmen am Beispielsystem „Weinbau" zu entwickeln. 2) Die Anbauform „Weinbau" ist f{\"u}r diese Studie aus folgenden Gr{\"u}nden besonders geeignet: Rebfl{\"a}chen sind an Standorte mit besonderen klimatischen Bedingungen gebunden, die ebenfalls f{\"u}r Lebensgemeinschaften von Bedeutung sind, die in Deutschland als besonders gef{\"a}hrdet gelten (thermophile und xerothermophile Gemeinschaften). Auch die speziellen, fr{\"u}her artenreichen „Weinbergsgesellschaften" (Flora und Fauna) verdienen besondere Beachtung; zudem ist in Unterfranken eine starke r{\"a}umliche Beziehung zwischen Naturschutzgebieten, die thermophile und xerothermophile Artengemeinschaften sch{\"u}tzen sollen, und umgebenden Rebfl{\"a}chen gegeben. Weiterhin erscheinen Rebfl{\"a}chen durch die Trennung der Anbaufl{\"a}che in die Bereiche „Zeile" (die den linienf{\"o}rmig angepflanzten Reben entspricht) und „Gasse" (ein etwa zwei Meter breiter Streifen zwischen den Zeilen) hervorragend geeignet, landwirtschaftliche Produktion und biodiversit{\"a}ts-orientierte Maßnahmen zu verbinden. 3) In der Region „Mainfranken" (Deutschland, Bayern) wurden drei Vergleichsfl{\"a}chenpaare in Ertragsrebfl{\"a}chen ausgew{\"a}hlt, die einerseits praxis{\"u}blich, andererseits nach den Vorschriften des „{\"o}kologischen Landbaus" i.S. des BML wirtschaften. 4) In der naturschutzfachlichen Analyse wurden folgende Gesellschaften der Vergleichsfl{\"a}chen faunistisch untersucht: bodenaktive (epig{\"a}ische) Spinnen (Araneae), Laufk{\"a}fer (Carabidae), Zikaden (Auchenorrhyncha) und Heuschrecken (Saltatoria). Im betriebswirtschaftlichen Teil wurde nach Literaturdaten und Arbeitstageb{\"u}chern die Außenwirtschaft der Weinbaubetriebe analysiert. Beide Datengruppen wurden zusammengef{\"u}hrt, um die Auswirkungen betrieblicher Maßnahmen der Außenwirtschaft sowohl im Hinblick auf ihre naturschutzfachliche als auch betriebswirtschaftliche Wirksamkeit zu ermitteln und hieraus Umstellungsstrategien im Weinbau abzuleiten. Zudem wurden die monet{\"a}ren Differenzen quantifiziert, um die H{\"o}he etwaiger Ausgleichszahlungen bestimmen zu k{\"o}nnen. 5) Die naturschutzfachliche Analyse zeigte, dass mit Ausnahme der Heuschrecken alle Gruppen eine starke F{\"o}rderung durch den {\"o}kologischen Anbau erfuhren; die F{\"o}rderung betraf sowohl die allgemeine Diversit{\"a}t wie naturschutzfachlich bedeutsame Arten. Diese Effekte konnten vor allem auf den Faktor „Einf{\"u}hrung einer struktur- und artenreichen Dauerbegr{\"u}nung" sowie auf die Etablierung ungest{\"o}rter R{\"u}ckzugsbereiche zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden. Die Ver{\"a}nderungen des Pflanzenschutzes wurden als nicht wirksam eingestuft, die Kupferbehandlungen im {\"o}kologischen Weinbau werden sogar als problematisch angesehen. Weiterhin wurde die Maßnahme „Mulchen" des {\"o}kologischen Weinbaus als problematische Maßnahme der Begr{\"u}nungspflege identifiziert. 6) Die betriebswirtschaftliche Analyse zeigte, dass f{\"u}r die Ertragssituation der Betriebe vor allem der Pflanzenschutz bedeutsam ist. Von der Einf{\"u}hrung einer Dauerbegr{\"u}nung gehen moderate Effekte aus, die zudem oftmals auf eine „Umstellungsphase" befristet sind. 7) In der Zusammenf{\"u}hrung beider Analysen wird ein Anbauschema vorgeschlagen, dass ein modifiziertes Begr{\"u}nungsmodell nach {\"o}kologischer Wirtschaftsweise mit einem modifizierten Pflanzenschutzsystem nach praxis{\"u}blicher Wirtschaftsweise kombiniert. Die Kalkulation eines solchen Systems zeigt, dass auf Ausgleichszahlungen verzichtet werden k{\"o}nnte, bzw. geleistete Zahlungen nicht als Kompensation i.e.S., sondern als Anreizzahlungen zu verstehen w{\"a}ren. 8) Die Notwendigkeit einer {\"U}berpr{\"u}fung des entwickelten Schemas in einem Konversionsexperiment wird dargelegt.}, language = {de} } @phdthesis{Porsche2006, author = {Porsche, Christian}, title = {Neuronale Plastizit{\"a}t im Hippocampus der Maus : Die Rolle von Neurotrophine und Cytokinen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21968}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Neurotrophe Faktoren haben ein breites Aufgabenfeld und spielen eine wichtige Rolle als {\"U}berlebensfaktoren embryonaler Neurone, bei Proliferation und Differenzierung im Nervensystem sowie als Modulatoren synaptischer Plastizit{\"a}t. Im ersten Themenkomplex der vorliegenden Arbeit wurden neurotrophe Faktoren als Modulatoren synaptischer Plastizit{\"a}t und ihr Einfluß auf die BDNF-Regulation im Hippocampus untersucht. Dabei wurde zun{\"a}chst das selbsthergestellte polyclonale BDNF-Immunserum f{\"u}r die Anwendung in der Immunhistochemie und im Western Blot optimiert, doch es konnten bez{\"u}glich BDNF keine Ver{\"a}nderungen in Hippocampi CNTF-defizienter M{\"a}use gegen{\"u}ber Wildtyp-Tieren festgestellt werden. Die Ergebnisse der Voruntersuchungen, die im Hippocampus CNTF-defizienter Tiere verminderte BDNF-Level gezeigt hatten, konnten somit nicht verifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an CNTF-defizienten M{\"a}usen eine eingeschr{\"a}nkte LTP und LTD nachgewiesen. Zum besseren Verst{\"a}ndnis der - laut LTP-Untersuchungen - ver{\"a}nderten Situation an der hippocampalen CA1-Synapse bei CNTF-defizienten Tieren wurden elektronenmikroskopische Bilder dieser Region angefertigt, deren Auswertung keine augenscheinlichen Unterschiede ergab. Im Stratum radiatum der CA1-Region war zudem keine spezifische CNTF-F{\"a}rbung nachweisbar. Zur Kl{\"a}rung der Frage, ob es IGF-vermittelt nach Training zu hippocampaler BDNF-Hochregulation kommt, wurden Laufradexperimente mit wildtypischen und konditionalen IGF1-Rezeptor-knockout M{\"a}usen durchgef{\"u}hrt und die jeweiligen BDNF-Level untersucht. Dabei wurde BDNF durch Laufradtraining in beiden Genotypen in {\"a}hnlichem Maße hochreguliert, was f{\"u}r alternative Wege der BDNF-Hochregulation spricht. Der zweite Themenkomplex befasste sich mit dem Einfluß neurotropher Faktoren auf die Proliferation und Differenzierung in Hippocampus und Cortex. BrdU-Inkorporationsexperimenten zeigten in der K{\"o}rnerzellschicht des Gyrus dentatus gesteigerte Proliferationsraten bei CNTF-defizienten und CNTF\&LIF-defizienten M{\"a}usen, wobei LIF-defiziente Tiere keine ver{\"a}nderten Proliferationsraten zeigten. Untersuchungen an Kulturen cortikaler Vorl{\"a}uferzellen best{\"a}tigten die Hypothese, wonach cortikale Vorl{\"a}uferzellen zun{\"a}chst Neurone bilden, die einen Faktor sezernieren, der auf die cortikalen Vorl{\"a}uferzellen wirkt und sie zur Bildung von Astrozyten veranlasst. Es konnte gezeigt werden, dass CT-1 der Hypothese folgend in vitro und in vivo f{\"u}r die Einleitung der Astrozytogenese im Cortex verantwortlich ist.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Schaer2006, author = {Sch{\"a}r, Jennifer}, title = {Molekulare Charakterisierung der Response-Regulatoren ArsR (HP0166), HP1043 und HP1021 von Helicobacter pylori}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21855}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Bakterien m{\"u}ssen st{\"a}ndig in der Lage sein auf Ver{\"a}nderungen in ihrer Umwelt reagieren zu k{\"o}nnen. Zur Wahrnehmung dieser Ver{\"a}nderungen haben sich unterschiedliche Signaltransduktionssysteme entwickelt. Ein weit verbreiteter und gut charakterisierter Mechanismus zur Signaltransduktion sind die so genannten Zwei-Komponentensysteme. Im Genom von H. pylori konnten nur wenige Bestandteile von Zwei-Komponentensystemen identifiziert werden. Dazu z{\"a}hlen neben dem Chemotaxis-System lediglich drei Histidin-Kinasen, ArsS, CrdS und FlgS, und f{\"u}nf Response-Regulatoren HP1021, HP1043, ArsR, CrdR und FlgR, die vermutlich Transkriptions-regulatorische Funktionen haben. Zwei der Response-Regulatoren, HP1043 und ArsR als essentiell f{\"u}r das {\"U}berleben von H. pylori, w{\"a}hrend HP1021 einen deutlichen Einfluss auf das Zellwachstum hat, da ein Wachstums-Defekt zu erkennen ist, wenn das entsprechende Gen hp1021 deletiert wird. Eine Deletion von arsS, dem Gen der zugeh{\"o}rigen Histidin-Kinase von ArsR, hat unter Standard-Wachstumsbedingungen keine Auswirkung auf das Zellwachstum von H. pylori. Diese Beobachtung spricht f{\"u}r die Hypothese, dass der Response-Regulator ArsR die Transkription zweier unterschiedlicher Sets von Zielgenen kontrolliert. Demzufolge reguliert der Response-Regulator ArsR nach S{\"a}ure-induzierter Phosphorylierung durch ArsS die Transkription von Genen, die zur S{\"a}ureresistenz beitragen, w{\"a}hrend ArsR im nicht-phosphorylierten Zustand die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert, von denen mindestens eines f{\"u}r das Zellwachstum essentiell sein sollte. Das durch ArsR~P kontrollierte Regulon konnte bereits weitgehend charakterisiert werden allerdings sind die Zielgene des unphosphorylierten Regulators bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die zuvor beschriebene Hypothese best{\"a}tigt werden, da gezeigt wurde, dass ein Derivat von ArsR, mit einer Mutation der Phosphorylierungsstelle D52 zu N52, das wildtypische Protein bez{\"u}glich des Zellwachstums unter Standardbedingungen funktionell ersetzen kann. F{\"u}r die Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 konnte bislang keine zugeh{\"o}rige Histidin-Kinase identifiziert werden und interessanterweise findet man in der Receiver-Dom{\"a}ne dieser Response-Regulatoren atypische Abweichungen von der Konsensus-Sequenz. Um die Bedeutung dieser atypischen Prim{\"a}rsequenzen f{\"u}r die Funktion dieser Response-Regulatoren zu untersuchen wurden mutierte H. pylori-St{\"a}mme konstruiert, die ausschließlich Derivate von HP1021 bzw. HP1043 exprimieren, die in ihrer Receiver-Sequenz der Konsensus-Sequenz entsprachen. Da diese Mutanten sich bez{\"u}glich ihres Zellwachstums nicht vom Wildtyp unterscheiden, konnte nachgewiesen werden, dass die atypischen Receiver-Sequenzen der beiden Response-Regulatoren nicht entscheidend f{\"u}r die Funktionen der Response-Regulatoren sind. Weiterhin konnten Indizien daf{\"u}r gesammelt werden, dass HP1021 und HP1043 hinsichtlich ihrer Aktivierung vermutlich vom {\"u}blichen Zwei-Komponentenparadigma abweichen. Derivate von HP1021 und HP1043 mit Mutationen ihrer putativen atypischen Phosphorylierungsstelle sind in der Lage ihre wildtypischen Pendants hinsichtlich der bekannten Ph{\"a}notypen funktionell zu ersetzen. Somit ist eine Phosphorylierung der Receiver-Dom{\"a}ne dieser Response-Regulatoren keine Voraussetzung f{\"u}r ein normales Zellwachstum von H. pylori. Diese Hypothese wird gest{\"u}tzt durch die Beobachtung, dass ein Ortholog von HP1043 aus C. jejuni CJ0355, das nat{\"u}rlicherweise an der potentiellen Phosphorylierungsstelle einen nicht phosphorylierbaren Aminos{\"a}urerest tr{\"a}gt, HP1043 in seiner Funktion ersetzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro keine Phosphorylierung durch radioaktiv markiertes Acetylphosphat stattfindet und dass ein H. pylori-Stamm mit einer Deletion der Gene pta und ackA, welche Proteine kodieren, die bei der Synthese von zellul{\"a}rem Acetylphosphat ben{\"o}tigt werden, einen normalen Wachstums-Ph{\"a}notyp zeigt. Zus{\"a}tzlich konnten in einer massenspektrometrischen Analyse des Proteins HP1021, welches nach Zweidimensionaler Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinlysaten aus H. pylori isoliert wurde, keine Hinweise auf eine Serinphosphorylierung entdeckt werden. Es ist daher fraglich ob in vivo eine funktionell relevante Phosphorylierung stattfindet. Die Mechanismen zur Modulation der Regulator-Aktivit{\"a}t von HP1043 und HP1021 bleiben unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass eine strikte Transkriptionskontrolle nicht f{\"u}r die Zellwachstums-assoziierten Funktionen von HP1021 von Bedeutung ist. Dagegen wurden Hinweise darauf erzielt, dass die Expression von HP1043 auf einem posttranskriptionellen und/oder auf einem posttranslationellen Level reguliert wird. Es waren bislang keine Zielgene von HP1021 bekannt. Durch vergleichende Zweidimensionale Gelelektrophorese der H. pylori St{\"a}mme 26695 und 26695 1021\&\#916; konnten einige potentielle Zielgene des Response-Regulators HP1021 identifiziert werden.}, subject = {Helicobacter pylori}, language = {de} }