@phdthesis{Fink2021,
  author    = {Fink, Severin Lion Julian},
  title     = {Entwicklung eines Sleeping Beauty Transposon Systems zum simultanen und induzierbaren shRNA-Knock-down verschiedener Zielstrukturen in Zelllinien des Multiplen Myeloms},
  doi       = {10.25972/OPUS-24979},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-249796},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Das Multiple Myelom (MM) ist ungeachtet neuer medikament{\"o}ser Therapien weiterhin eine f{\"u}r die allermeisten Patienten unheilbare Erkrankung. Aktuelle Whole-Genome-Sequenzierungen konnten die Annahme, dass hierf{\"u}r die genetische Heterogenit{\"a}t des MM verantwortlich ist, best{\"a}tigen. Um dieses onkogene Signalnetzwerk auf effiziente Weise zu untersuchen, wurde ein induzierbares Knock-down-System basierend auf der weitverbreiteten RNA-Interferenz und dem neuen, innovativen Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) entwickelt. Die Etablierung des SBTS im MM zeigte, dass die CMV-Promotor-vermittelte EGFP-Expression {\"u}ber 231 Tage stabil ist. Die Verwendung des SBTS erm{\"o}glicht es, Zellen bei niedrigster biologischer Schutzstufe (S1) stabil zu transfizieren. Am Beispiel des MAPK-Signalweges konnten stabile shRNA-vermittelte Knock-downs in verschiedenen MM-Zelllinien erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden. Um ein induzierbares Tet-On-System zur shRNA-Expression zu erstellen, wurden zum einen dem verwendeten H1-Promotor zwei TetO-Sequenzen hinzugef{\"u}gt. Zum anderen wurde durch die Verwendung eines zweiten, neu konstruierten SBTS Vektors mit anderer Selektionsresistenz in den verwendeten Zellen das Tet-Repressor-Protein (TetR) stabil exprimiert. Die notwendige Expression von TetR konnte nur mittels CAG-Promotors erreicht werden. Am Beispiel von ERK2 konnte gezeigt werden, dass es durch die stabile Transfektion und die Induktion des Knock-downs mit Doxycyclin m{\"o}glich ist, den Knock-down Effekt zu erzielen. Das etablierte Plasmid-basierte System stellt somit ein versatiles, einfach anwendbares, kosteng{\"u}nstiges und zeitsparendes Werkzeug dar, induzierbare Knock-downs durch RNA-Interferenz f{\"u}r einzelne oder mehrere Proteine gleichzeitig zu erzielen. Es ist davon auszugehen, dass die Anwendung aufgrund der Verwendung etablierter Techniken und der leichten Modifizierbarkeit nicht nur auf das MM begrenzt sein wird.},
  subject      = {RNS-Interferenz},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Roth2021,
  author    = {Roth, Bernhard},
  title     = {Entwicklung von Plasmiden mit multiplen short hairpin RNA-Expressionskassetten f{\"u}r den simultanen Knockdown onkogener Zielstrukturen im Multiplen Myelom},
  doi       = {10.25972/OPUS-21946},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-219464},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Zielvorgabe dieser Dissertation stellte die Konstruktion eines Plasmides mit mehreren shRNA-Expressionskassetten f{\"u}r den simultanen Knockdown onkogener Zielstrukturen im Multiplen Myelom dar. Es sollte sich zudem um ein Konstrukt handeln, bei dem ein beliebig h{\"a}ufiges Einf{\"u}gen oder Ersetzen von Expressionskassetten durch einfache Klonierungsschritte m{\"o}glich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Plasmide mit bis zu vier unterschiedlichen shRNA-Expressionskassetten konstruiert und getestet. Mittels Elektroporation und anschließender Analyse der Knock-down-Effizienz im Western Blot konnte beispielhaft an Proteinen des MEK-ERK-Signalweges gezeigt werden, dass mithilfe der klonierten Plasmide die Spiegel von mindestens vier Zielproteinen gleichzeitig herunterreguliert werden k{\"o}nnen, ohne dass es dabei zu Einschr{\"a}nkungen im Vergleich zur Verwendung von Einzel-shRNA-Expressionsvektoren kommt. Es konnte gezeigt werden, dass weder die zunehmende Menge an hintereinander klonierten Kassetten noch die Reihenfolge der einzelnen Expressionskassetten im Plasmid einen negativen Einfluss auf das Knock-down-Ergebnis haben. Dieses Ergebnis konnte in verschiedenen Zelllinien des Multiplen Myeloms best{\"a}tigt werden. Die Vorteile des Verfahrens liegen vor allem in der Kosteneffizienz, der einfachen Herstellung und Modifikation, sowie der niedrigen biologischen Sicherheitsstufe der Versuchsschritte. Bedeutend ist zudem die Vermeidung von toxischen Effekten, welche das Einbringen von Fremd-DNA in Zellen ab gewissen Mengen mit sich bringt, durch Klonierung aller shRNA-Expressionskassetten zu lediglich einem Plasmidkonstrukt. Einschr{\"a}nkungen erf{\"a}hrt die etablierte Methodik dadurch, dass die zu untersuchenden Zellen sich f{\"u}r die Transfizierung mit Plasmiden eigenen m{\"u}ssen und ein Verfahren der Selektion transfizierter von nativen Zellen verf{\"u}gbar sein muss. Durch genannte Vorteile stellt das Konstrukt jedoch ein hervorragendes Mittel zur Erforschung zellul{\"a}rer Signalwege und ihrer Interaktionen weit {\"u}ber die Erkrankung des Multiplen Myeloms hinaus dar. Es kann zudem als kosteng{\"u}nstige molekulare Methode zur Identifizierung neuer pharmakologischer Angriffspunkte bei Tumorerkrankungen dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden in Folgeversuchen genutzt um eine stabile Integration der shRNA-Expressionskassetten in die zellul{\"a}re DNA sowie eine pharmakologische Induzierbarkeit zu erreichen. Es konnte somit der Sprung von den transienten Knock-down-Versuchen dieser Arbeit hin zur langfristig verminderten Proteintranslation geschafft werden. Am Ende dieser Arbeit verblieb zu eruieren, inwieweit die Anzahl der shRNA-Expressionskassetten {\"u}ber die getestete Anzahl von vier erweiterbar w{\"a}re und ob die guten Erfahrungen mit dieser Methodik auch bei anderen Arten von Tumorzellen replizierbar sind. Das etablierte Vektorsystem k{\"o}nnte in k{\"u}nftigen Versuchen zur schnellen Erforschung bisher wenig untersuchter oder unbekannter Signalwege dienen.},
  subject      = {RNS-Interferenz},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mourad2019,
  author    = {Mourad, Caroline},
  title     = {RNA-Interferenz humaner Nat{\"u}rlicher Killer-Zellen unter Einf{\"u}hrung von siRNA mittels Lipofektion und Elektroporation},
  doi       = {10.25972/OPUS-18545},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-185458},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Als Teil des angeborenen Immunsystems spielen Nat{\"u}rliche Killer(NK)- Zellen eine entscheidende Rolle in der Interaktion mit Pathogenen und Tumorzellen. Mithilfe der RNA-Interferenz bestimmter Gene wie beispielsweise CD56 k{\"o}nnten Hinweise auf die genaue Funktionsweise der NK-Zellen gewonnen werden. Ziel dieser Arbeit war es eine geeignete Transfektionsmethode zum Einf{\"u}hren von siRNA in NK-Zellen zu finden, welche eine hohe Transfektionseffizienz bei gleichzeitig hoher Zellviabilit{\"a}t aufweist. Hierf{\"u}r wurden drei verschiedene Lipofektionsreagenzien und sechs verschiedene Elektroporationsprogramme verglichen. Zun{\"a}chst wurde die Transfektionseffizienz mit an AF488 gekoppelter negativer siRNA per Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie evaluiert und jeweils das effizienteste Lipofektionsreagenz bzw. Elektroporationsprogramm ausgew{\"a}hlt. Mit diesen wurde anschließend eine Herunterregulation des CD56-Gens mit CD56-siRNA per RNA-Interferenz versucht. Die CD56-Gen-Expression wurde auf Proteinebene per Durchflusszytometrie und auf mRNA-Ebene per PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) evaluiert.},
  subject      = {RNS-Interferenz},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Winkler2015,
  author    = {Winkler, Ann-Cathrin Nicole},
  title     = {Identification of human host cell factors involved in \(Staphylococcus\) \(aureus\) 6850 infection},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-114300},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Staphylococcus aureus is both a human commensal and a pathogen. 20\%-30\% of all individuals are permanently or occasionally carriers of S. aureus without any symptoms. In contrast to this, S. aureus can cause life-threatening diseases e.g. endocarditis, osteomyelitis or sepsis. Here, the increase in antibiotic resistances makes it more and more difficult to treat these infections and hence the number of fatalities rises constantly. Since the pharmaceutical industry has no fundamentally new antibiotics in their pipeline, it is essential to better understand the interplay between S. aureus and the human host cell in order to find new, innovative treatment options. In this study, a RNA interference based whole genome pool screen was performed to identify human proteins, which play a role during S. aureus infections. Since 1,600 invasion and 2,271 cell death linked factors were enriched at least 2 fold, the big challenge was to filter out the important ones. Here, a STRING pathway analysis proved to be the best option. Subsequently, the identified hits were validated with the help of inhibitors and a second, individualised small interfering RNA-based screen. In the course of this work two important steps were identified, that are critical for host cell death: the first is bacterial invasion, the second phagosomal escape. The second step is obligatory for intracellular bacterial replication and subsequent host cell death. Invasion in turn is determining for all following events. Accordingly, the effect of the identified factors towards these two crucial steps was determined. Under screening conditions, escape was indirectly measured via intracellular replication. Three inhibitors (JNKII, Methyl-beta-cyclodeytrin, 9-Phenantrol) could be identified for the invasion process. In addition, siRNAs targeted against 16 different genes (including CAPN2, CAPN4 and PIK3CG), could significantly reduce bacterial invasion. Seven siRNAs (FPR2, CAPN4, JUN, LYN, HRAS, AKT1, ITGAM) were able to inhibit intracellular replication significantly. Further studies showed that the IP3 receptor inhibitor 2-APB, the calpain inhibitor calpeptin and the proteasome inhibitor MG-132 are able to prevent phagosomal escape and as a consequence intracellular replication and host cell death. In this context the role of calpains, calcium, the proteasome and the mitochondrial membrane potential was further investigated in cell culture. Here, an antagonistic behaviour of calpain 1 and 2 during bacterial invasion was observed. Intracellular calcium signalling plays a major role, since its inhibition protects host cells from death. Beside this, the loss of mitochondrial membrane potential is characteristic for S. aureus infection but not responsible for host cell death. The reduction of membrane potential can be significantly diminished by the inhibition of the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger. All together, this work shows that human host cells massively contribute to different steps in S. aureus infection rather than being simply killed by bacterial pore-forming toxins. Various individual host cell factors were identified, which contribute either to invasion or to phagosomal escape and therefore to S. aureus induced cytotoxicity. Finally, several inhibitors of S. aureus infection were identified. One of them, 2-APB, was already tested in a sepsis mouse model and reduced bacterial load of kidneys. Thus, this study shows valuable evidence for novel treatment options against S. aureus infections, based on the manipulation of host cell signalling cascades.},
  subject      = {Staphylococcus aureus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Geiger2016,
  author    = {Geiger, Katharina},
  title     = {Etablierung eines Vektorsystems zum shRNA-vermittelten Knockdown von Y-box binding protein 1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-149809},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2016},
  abstract  = {Die Funktion eines Genes zu erforschen, indem man es ausschaltet, und damit seiner Rolle im komplexen Zusammenspiel der einzelnen Prozesse des menschlichen K{\"o}rpers nachzugehen, stellt heutzutage eines der vielversprechendsten Felder der Gentechnologie dar. Der als RNA-Interferenz bekannte Mechanismus wurde in dieser Arbeit durch den Einsatz von sogenannten short hairpin RNAs (shRNAs), dauerhaft in das Wirtsgenom integrierter Knockdown-Tr{\"a}ger, f{\"u}r das Gen bzw. Protein Y box binding Protein (YBX1) angewendet. YBX1, ein Vertreter der Cold-Shock-Proteine, stellt einen zentralen Interakteur lebensnotwendiger Prozesse wie Proliferation, Apoptose und Embryogenese im menschlichen K{\"o}rper dar. Seine Dysregulation wird jedoch auch in einen Zusammenhang mit Entz{\"u}ndung, Tumorformation und -aufrechterhaltung gebracht, unter anderem auch f{\"u}r das Multiple Myelom. Das Multiple Myelom ist f{\"u}r 1\% aller Krebserkrankungen weltweit verantwortlich mit noch immer ungel{\"o}sten Problemen unzul{\"a}nglicher Therapie und delet{\"a}rer Prognose. In der vorliegenden Arbeit wurde die M{\"o}glichkeit geschaffen, die Rolle von YBX1 f{\"u}r das Multiple Myelom mit Hilfe einer Maus-Plasmazelllinie in vivo zu untersuchen. Dies geschah durch die Suppression der Genexpression von YBX1 mittels verschiedener gegen YBX1 gerichteter Polymerase II-getriebener short hairpin RNAs (shRNAs). Diese wurden in ein lentivirales Plasmid kloniert. Durch das Vorhandensein von Tetrazyklin induzierbaren Promotoren (Tet-On bzw. Tet-Off) wurde die M{\"o}glichkeit geschaffen, einen konditionellen Knockdown von YBX1 zu induzieren. Dies war notwendig, da initiale Arbeiten mit humanen Myelomzelllinien zeigten, dass der Knockdown von YBX1 Apoptose induzieren kann. Mit diesem Konstrukt wurden in HEK293 Zellen lentivirale Partikel hergestellt und damit die murine Plasmozytomzelle MOPC315.BM stabil transduziert. Nach Selektion, Klonierung und Testung (Puromycin-Selektion, RFP-Expression und Western-Blot Analyse) stand ein Zellklon zur Verf{\"u}gung, der einen induzierbaren YBX1 Knockdown zeigt. Damit gelang die Etablierung eines gegen YBX1 gerichteten Vektorsystems in einer murinen Plasmazellinie in vitro. Mit Hilfe dieser Zelllinien kann nun in weiteren Arbeiten untersucht werden, wie ein YBX1 Knockdown das Tumorwachstum in vivo beinflusst.},
  subject      = {Plasmozytom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Xu2014,
  author    = {Xu, Jiajia},
  title     = {A high-complexity lentiviral shRNA screen identifies synthetic lethal interactions with deregulated N-Myc in neuroblastoma cells},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-103157},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {In contrast to c-Myc, a deregulated expression of the MYCN gene is restricted to human neuroendocrine tumours. In most cases, the excessive activity of N-Myc results from a MYCN amplification. In neuroblastoma, amplification of MYCN is a predictor of poor prognosis and resistance to therapy. The inability to target the N-Myc protein directly necessitates the search for alternative targets. This project aimed at identifying genes specifically required for growth and survival of cells that express high levels of N-Myc using high-throughput shRNA screening combined with next generation sequencing. The identification and analysis of these genes will shed light on functional interaction partners of N-Myc. We screened a shRNA library containing 18,327 shRNAs and identified 148 shRNAs, which were selectively depleted in the presence of active N-Myc. In addition, shRNAs targeting genes that are involved in p53 and ARF turnover and apoptosis were depleted in the cell population during the screen. These processes are known to affect N-Myc-mediated apoptosis. Consequently, these results biologically validated the screen. The 148 shRNAs that showed a significant synthetic lethal interaction with high levels of N-Myc expression were further analysed using the bioinformatics program DAVID. We found an enrichment of shRNAs that target genes involved in specific biological processes. For example, we validated synthetic lethal interactions for genes such as, THOC1, NUP153 and LARP7, which play an important role in the process of RNA polymerase II-mediated transcription elongation. We also validated genes that are involved in the neddylation pathway. In the screen we identified Cullin 3, which is a component of the BTB-CUL3-Rbx1 ubiquitin ligase that is involved in the turnover of Cyclin E. Depletion of cullin 3 and activation of N-Myc was found to synergistically increase Cyclin E expression to supraphysiological levels, inducing S-phase arrest and a strong DNA damage response. Together with results from a proteomics analysis of N-Myc associated proteins, our results lead us to the following hypothesis: In a neuroblastoma cell, the high levels of N-Myc result in a conflict between RNA polymerase II and the replication machinery during S-phase. The newly identified interaction partners of N- Myc are required to solve this conflict. Consequently, loss of the interaction leads to a massive DNA damage and the induction of apoptosis. In addition, inhibition or depletion of the essential components of the neddylation pathway also results in an unresolvable problem during S-phase.},
  subject      = {Neuroblastom},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Zinke2012,
  author    = {Zinke, Michael Benedikt},
  title     = {Hemmung der Masernvirusreplikation durch RNA-Interferenz},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83933},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die subakut sklerosierende Panenzephalitis ist eine demyelinisierende Erkrankung des ZNS. {\"A}tiologisch liegt eine persistierende Infektion von Masernviren der Neuronen bzw. Gliazellen zugrunde. Bis heute gibt es keine spezifische Therapie und lediglich symptomatische Therapiemaßnahmen werden in deren Behandlung angewandt. Obwohl sich w{\"a}hrend des Krankheitsverlaufes eine ausgepr{\"a}gte Immunantwort des nat{\"u}rlichen als auch adaptiven Immunsystems des Wirtes abspielt f{\"u}hrt die Erkrankung unweigerlich zum Tode der Betroffenen. Eine Therapiem{\"o}glichkeit diesbez{\"u}glich k{\"o}nnten die Effekte der RNAi darstellen. Um geeignete Sequenzen f{\"u}r einen m{\"o}glichen Genknockdown einzelner MV-Gene herauszufiltern, wurde ein plasmid-basierendes Testsystem entwickelt, das die mRNA des Fluoreszenzproteins DsRed2 zusammen mit mRNA-Sequenzen einzelner MV-Gene exprimiert. Gegen diese MV-Gene wiederum wurden verschiedene shRNAs ausgew{\"a}hlt, welche mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems exprimiert werden. Als Expressionsindikator findet in diesem lentiviralen Vektorsystem simultan die Expression von eGFP als statt. Die Auswertung dieses Dual-Color-Systems erfolgte im Folgenden mittels FACS-Analysen. Die wirksamsten siRNA-Sequenzen, ausgew{\"a}hlt durch eine hohe Abnahme der Rotfluoreszenz in den untersuchten Zellen, wurden f{\"u}r weitere Versuche selektiert. Die auf diese Weise ausgew{\"a}hlten shRNA-Sequenzen wurden in einem weiteren Schritt durch die Generierung lentiviraler Partikel in persistierend infizierten NT2-Zellen (piNT2), die das Fluoreszenzprotein HcRed als Infektionsindikator exprimieren, transduziert. Weitere durchflusszytometrische Messungen zeigten eine {\"a}ußerst hohe Reduktion viraler Replikation innerhalb von 7 Tagen bis unterhalb der Detektionsgrenze sofern die shRNAs gegen die Expression der MV-Proteine N, P und L gerichtet waren. Die Anzahl der virus-negativen Zellen blieb im Folgenden bis zu 3 Wochen nach stattgehabter Transduktion konstant, sofern das fusion-inhibiting-peptide den Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die transduzierten piNT2-Zellen, welche keine Expression von HcRed zeigten wurden auf Zellrasen bestehend aus Vero-Zellen aufgetragen und f{\"u}hrten im zeitlichen Verlauf zu keiner Fusion bzw. Synzytienbildung. Dieser Zusammenhang legt nahe, dass die transduzierten piNT2-Zellen die F{\"a}higkeit einer Expression viraler Proteine verloren haben und eine „Heilung" stattfinden kann, wenn die virale Proteinbiosynthese durch eine permanente Expression von siRNAs, wie beispielsweise durch lentivirale Vektorsysteme, gehemmt wird.},
  subject      = {RNS-Interferenz},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Joseph2011,
  author    = {Joseph, Julie},
  title     = {Studying the role of Th17 cells in autoimmune diabetes and generation of a beta cell reporter mouse by lentiviral transgenesis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-66571},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Type 1 diabetes affects around 0.5\% of the population in developed countries and the incidence rates have been rising over the years. The destruction of beta cells is irreversible and the current therapy available to patients only manages the symptoms and does not prevent the associated pathological manifestations. The patients need lifelong therapy and intensive research is being carried out to identify ways to eliminate autoimmune responses directed against pancreatic beta cells and to replace or regenerate beta cells. The work presented herein aimed at analyzing the role of the Th17 T cell subset, characterized by secretion of the pro- inflammatory cytokine IL-17A, in autoimmune diabetes and also at generating a beta cell reporter mouse line in the NOD background, the most widely- used mouse model for type 1 diabetes. We generated IL- 17A knockdown (KD) NOD mice, using RNAi in combination with lentiviral transgenesis. We analyzed diabetes frequency in IL-17A deficient mice and found that the loss of IL-17A did not protect the transgenic mice from diabetes. Based on these observations, we believe that Th17 cells do not play a critical role in type 1 diabetes through the IL-17A pathway, though they might still be involved in the disease process through alternate pathways. We also generated NOD and NOD-SCID mice with a transgene that drives the beta cell specific expression of a luciferase reporter gene. We used a lentiviral construct, which combined a luciferase sequence and a short- hairpin RNA (shRNA) expression cassette, allowing gene- knockdown under the beta cell specific rat insulin promoter (RIP). These mice will be of use in studying beta cell phenotypes resulting from the knockdown of target genes, using non- invasive bioimaging. We believe that the generation of these reporter mouse lines for diabetes studies will prove valuable in future investigations. Furthermore, the demonstration that the loss of IL-17A does not alter susceptibility to type 1 diabetes should help clarify the controversial involvement of Th17 cells in this disease.},
  subject      = {Diabetes mellitus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Blank2009,
  author    = {Blank, Marc},
  title     = {Mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Apoptose in T-Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-41332},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 {\"U}berexpression resultiert in einer Resistenz gegen{\"u}ber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide k{\"o}nnen die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage {\"u}ber die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die {\"a}ußere Mitochondrienmembran zu sch{\"a}digen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu f{\"u}hren. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, f{\"u}hren so {\"u}ber eine Erh{\"o}hung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden M{\"o}glichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegen{\"u}ber GC-induzierter Apoptose f{\"u}hrt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. W{\"a}hrend die {\"U}berexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, f{\"u}hrte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegen{\"u}ber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Dar{\"u}ber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout M{\"a}usen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in h{\"a}matopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter M{\"a}use genutzt wurden, best{\"a}tigt werden. W{\"a}hrend der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im h{\"a}matopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo.},
  subject      = {Glucocorticosteroidrezeptor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Humrich2009,
  author    = {Humrich, Jan},
  title     = {G-Protein betagamma-Regulation durch Phosducin-like Proteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40059},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der L{\"a}nge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquit{\"a}r exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abh{\"a}ngigen Funktionen f{\"u}hrt. Der um 83 Aminos{\"a}uren verl{\"a}ngerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches f{\"u}r die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte {\"u}berraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator f{\"u}r Gbetagamma-abh{\"a}ngige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden F{\"a}higkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verl{\"a}ngerten N-Terminus durch die ubiquit{\"a}re Casein Kinase 2 (CK2) zur{\"u}ckgef{\"u}hrt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) f{\"u}hrte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsf{\"a}higkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinit{\"a}t nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsf{\"a}higkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminos{\"a}ure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsf{\"a}higkeit, als auch die F{\"a}higkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuh{\"a}ngen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinf{\"a}rbung) nicht die Funktionsf{\"a}higkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu k{\"o}nnen. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass m{\"o}glicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein k{\"o}nnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Dom{\"a}nen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma f{\"u}hrte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.},
  subject      = {G-Proteine},
  language  = {de}
}